Пептиды, проникающие в клетку

Пептиды, проникающие в клетку

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новому пептиду, проникающему через клеточную мембрану, и к фармацевтической композиции, содержащей пептид и гидрофильное физиологически активное вещество.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Клетки изолированы от внешней среды посредством клеточной мембраны, которая непроницаема для гидрофильных физиологически активных веществ, таких как белки и нуклеиновые кислоты. Отсутствие способов доставки таких гидрофильных физиологически активных веществ внутрь клетки препятствует клиническому применению многих гидрофильных физиологически активных веществ, чьи участки воздействия локализованы в клетках.

Было описано несколько методов для доставки таких, не проникающих в клетку, гидрофильных физиологически активных веществ. Наиболее известным способом является тот, который при помощи липида придает гидрофобность гидрофильному физиологически активному веществу, и, посредством этого, может быть увеличено проникновение через мембрану клетки. Дополнительно описан способ, где для увеличения проницаемости применяют пептидный лиганд.

Пептидный лиганд, свойства которого позволяют ему перемещаться снаружи от клетки внутрь клетки без разрушения клеточной мембраны, называют проникающим в клетку пептидом. Примеры хорошо известных пептидов, проникающих в клетку, включают олигоаргинины, где аргинины связаны друг с другом; Tat (патентный документ 1), который получают из вируса ВИЧ-1; и пенетратин (патентный документ 2), который представляет собой пептид, полученный из Drosophila. В дополнение к этим пептидам, также были описаны различные проникающие в клетку пептиды, такие как те, что характеризуются простой основностью, те, что характеризуются амфипатичностью первичной или вторичной структуры пептида, и те, механизм которых неясен. В дополнение к способности проникать в клетку пептида обособленно, широко исследуется его применение для доставки в клетку гидрофильного физиологически активного вещества, такого как ген, с которым эти пептиды связаны в качестве носителя. Однако, хотя эти пептиды успешно проявили себя как реагенты в исследованиях, только небольшое число пептидов можно использовать для клинического применения. Таким образом, пептиды изучают различными способами и в каждом случае ищут последовательности пептидов, с которыми они могут наиболее эффективно перемещаться внутрь клеток.

Описано, что часть пептидов, проникающих в клетку, способна содействовать проникновению гидрофильного физиологически активного вещества через слой эпителиальных клеток слизистой оболочки в случаях, когда они перорально или интраназально вводятся вместе с гидрофильным физиологически активным веществом, позволяя гидрофильному физиологически активному веществу проникать с высокой интенсивностью в общий кровоток. Считают, что не все пептиды, проникающие в клетку, обладают свойством усиливать проникновение через слизистую и что не только проницаемость клеточной мембраны, но также внутриклеточная динамика, отделение от клетки и т.п. участвуют в способности содействовать проникновению. Таким образом, считается, что только часть проникающих в клетку пептидов, которые удовлетворяют этим условиям, обладает свойством способствовать абсорбции гидрофильных физиологически активных веществ через слизистую. Однако описано только небольшое число типов пептидов с такой функцией. Дополнительно пептиды, для которых описана способность усиливать абсорбцию через слизистую, это те, у которых эффект может быть подтвержден только в случаях, когда их применяют в формах конъюгатов с конкретными физиологически активными веществами (патентные документы 2 и 3); и те, которые требуют больших количеств пептидов, проникающих в клетку, для того, чтобы получить достаточный эффект, даже в случаях, когда показана возможность того, что пептиды можно использовать в формах, не требующих ковалентного связывания с лекарственным средством (патентный документ 4). Таким образом, многие проблемы остаются нерешенными перед практическим применением пептидов.

В последние годы в дополнение к низкомолекулярным гидрофобным лекарственным средствам, которые в основном применяли до сих пор, привлекают внимание гидрофильные физиологически активные вещества в качестве кандидатных соединений лекарственных средств. Хотя гидрофильные физиологически активные вещества демонстрируют заметные терапевтические эффекты, их плохая абсорбция через слизистую ограничивает способ их введения практически только инъекцией. Таким образом, крайне желательно развитие технологии, позволяющей гидрофильным физиологически активным веществам абсорбироваться через слизистую, для неинъекционного введения гидрофильных физиологически активных веществ. В частности, ожидается, что усиливающий абсорбцию способ с применением пептидов, проникающих в клетку, покажет более низкий уровень стимуляции слизистой по сравнению с усиливающим абсорбцию методом с применением поверхностно-активных веществ, которые широко изучались до сих пор, и открытие проникающих в клетку пептидов, которые вызывают эффективное усиление абсорбции, может привести к развитию перспективного метода.

ДОКУМЕНТЫ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Патентные документы

Патентный документ 1: JP 10-33186 A

Патентный документ 2: переведенная японская выложенная патентная заявка РСТ № 2002-530059

Патентный документ 3: WO 2004/037859

Патентный документ 4: JP 10-95738 A

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачи, решаемые изобретением

Данное изобретение направлено на создание нового пептида, проникающего в клетку, который может позволить гидрофильному физиологически активному веществу проникать внутрь клетки.

Средства решения задач

Авторы данного изобретения искали последовательности пептидов, способных проникать через мембрану клеток, и открыли новые последовательности пептидов с желаемой способностью проникать через мембрану клеток. То есть настоящее изобретение имеет следующий состав.

(1) Проникающий в клетку пептид, который является любым от (A) до (D), указанных ниже:

(А) пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1;

(В) пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, что и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, этот пептид обладает способностью проникать через мембрану клеток;

(С) пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, что и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что 1-5 аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, этот пептид обладает способностью проникать через мембрану клеток;

(D) пептид с аминокислотной последовательностью, представленной обратной последовательностью любого от (A) до (C); аминокислотная последовательность, такая же, как и аминокислотная последовательность, представленная обратной последовательностью (A), за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; или аминокислотная последовательность, такая же, как и аминокислотная последовательность, представленная обратной последовательностью (A), за исключением того, что 1-5 аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; этот пептид обладает способностью проникать через мембрану клеток.

(2) Проникающий в клетку пептид согласно абзацу (1), где пептид (B) имеет аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO:2-4, 9-10 и 13.

(3) Проникающий в клетку пептид согласно абзацу (1) или (2), где пептид (С) имеет аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO:12 и 15-30.

(4) Проникающий в клетку пептид согласно абзацам (1)-(3), где пептид (D) имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:5 или 14.

(5) Фармацевтическая композиция, которая содержит проникающий в клетку пептид согласно любому из абзацев (1)-(4) и гидрофильное физиологически активное вещество.

(6) Фармацевтическая композиция для перорального введения, фармацевтическая композиция, которая содержит проникающий в клетку пептид согласно любому из абзацев (1)-(4) и гидрофильное физиологически активное вещество.

(7) Фармацевтическая композиция для интраназального введения, фармацевтическая композиция, которая содержит проникающий в клетку пептид согласно любому из абзацев (1)-(4) и гидрофильное физиологически активное вещество.

(8) Фармацевтическая композиция согласно любому из абзацев (5)-(7), где гидрофильное физиологически активное вещество представляет собой пептид, белок или нуклеиновую кислоту.

Эффект изобретения

Посредством настоящего изобретения возможен эффективный перенос гидрофильного физиологически активного вещества внутрь клеток, и возможна новая фармакотерапия, направленная на молекулы в клетке. Дополнительно, гидрофильное физиологически активное вещество, которое можно было вводить только при помощи инъекции, можно вводить путем перорального введения, интраназального введения или т.п., позволяя проводить простую и ориентированную на пациента фармакотерапию.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой график, показывающий перемещение проникающих в клетку пептидов внутрь клеток HeLa.

Фиг.2 представляет собой график, показывающий усиление перемещения инсулина внутрь клеток HeLa при помощи проникающих в клетку пептидов.

Фиг.3 представляет собой график, показывающий усиление перемещения полистироловых гранул внутрь клеток HeLa при помощи проникающих в клетку пептидов.

Фиг.4 представляет собой график, показывающий уровень глюкозы в крови как индикатор интраназальной абсорбции инсулина, которую наблюдали при использовании проникающего в клетку пептида.

Фиг.5 представляет собой график, показывающий уровень инсулина в плазме как индикатор интраназальной абсорбции инсулина, которую наблюдали при использовании проникающего в клетку пептида.

Фиг.6 представляет собой график, показывающий биодоступность как индикатор интраназальной абсорбции инсулина, которую наблюдали при использовании проникающих в клетку пептидов.

Фиг.7 представляет собой график, показывающий уровень интерферона-β в плазме как индикатор интраназальной абсорбции интерферона-β, которую наблюдали при использовании проникающих в клетку пептидов.

Фиг.8 представляет собой график, показывающий уровень экзендина-4 в плазме как индикатор интраназальной абсорбции экзендина-4, которую наблюдали при использовании проникающих в клетку пептидов.

Фиг.9 представляет собой график, показывающий уровень глюкозы в крови как индикатор кишечной абсорбции инсулина, которую наблюдали при использовании проникающих в клетку пептидов.

Фиг.10 представляет собой график, показывающий уровень инсулина в плазме как индикатор кишечной абсорбции инсулина, которую наблюдали при использовании проникающих в клетку пептидов.

Фиг.11 представляет собой график, показывающий выделение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) как индикатор интраназальной токсичности проникающего в клетку пептида.

Фиг.12 представляет собой изображения с конфокального лазерного микроскопа, показывающие усиление перемещения инсулина внутрь клеток HeLa при помощи соответствующих проникающих в клетку пептидов. На каждой диаграмме A (вверху слева) показывает локализацию инсулина, меченного родамином; B (вверху справа) показывает мембрану клетки, окрашенную DiD'Oil; C (внизу слева) показывает изображение, полученное методом дифференциальной интерференции; и A+B (внизу справа) показывает наложенное изображение картинки A и картинки B.

Фиг.13 представляет собой график, показывающий усиление перемещения инсулина внутрь клеток HeLa при помощи проникающих в клетку пептидов.

Фиг.14 представляет собой график, показывающий AUC как индикатор интраназальной абсорбции инсулина, которую наблюдали при использовании проникающих в клетку пептидов.

Фиг.15 представляет собой график, показывающий перемещение проникающих в клетку пептидов внутрь клеток HeLa.

Фиг.16 представляет собой график, показывающий усиление перемещения инсулина внутрь клеток HeLa при помощи проникающих в клетку пептидов.

ЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения вновь открыли, что пептид с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 (далее в настоящем документе обозначаемый как пептид с SEQ ID NO:1), или его модифицированный пептид представляет собой проникающий в клетку пептид, завершив тем самым настоящее изобретение. Проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению будут описаны ниже подробно.

Способность проникать через мембрану клеток у проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению означает свойство проходить через липидную мембрану, отделяющую внутреннюю часть клетки от ее внешнего окружения. Можно подтвердить, может пептид или нет проходить через клеточную мембрану, посредством связывания флуоресцентного вещества с пептидом и добавлением полученной субстанции к клеткам с последующим наблюдением клеток при помощи конфокального лазерного микроскопа или т.п. для того, чтобы увидеть, можно ли обнаружить флуоресцентное вещество в клетках. Дополнительно, количественное подтверждение проницаемости внутрь клеток можно проводить путем внедрения пептида, связанного с флуоресцентным веществом, внутрь клеток и гомогенизацией клеток с последующим измерением интенсивности флуоресценции гомогената при помощи спектрофотометра. В настоящем описании в случаях, когда количество проникшего внутрь клеток пептида, связанного с флуоресцентным веществом (например, флуоросцеином), не менее чем в 3 раза выше, чем количество не проникающего в клетки и связанного с флуоресцентным веществом пептида с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:6, первый из упомянутых пептидов считают проникающим в клетку пептидом.

Дополнительно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению имеют свойство придавать гидрофильным физиологически активным веществам способность проникать через клеточную мембрану. В настоящем описании, когда эффективность проникновения флюоресцентно меченного гидрофильного физиологически активного вещества внутрь клеток не менее чем в 3 раза выше в случаях, когда флюоресцентно меченное гидрофильное физиологически активное вещество связано или смешано с пептидом и находится в контакте с клетками, чем в случаях, когда флюоресцентно меченное гидрофильное физиологически активное вещество само по себе находится в контакте с клетками, считают, что пептид имеет свойство придавать гидрофильному физиологически активному веществу способность проникать через клеточную мембрану.

Дополнительно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению имеют свойство придавать гидрофильным физиологически активным веществам способность абсорбироваться через слизистую оболочку (предпочтительно кишечная абсорбция или интраназальная абсорбция). Более конкретно, даже в случаях, когда гидрофильное физиологически активное вещество с трудом абсорбируется само по себе внутри живого организма через слизистую, его абсорбция через слизистую (предпочтительно кишечная абсорбция или интраназальная абсорбция) повышается при контакте с тканями слизистой оболочки (предпочтительно ткань кишечника или интраназальная ткань) гидрофильного физиологически активного вещества, связанного или смешанного с проникающим в клетку пептидом.

Пептид с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1, представляет собой новый пептид, открытый путем скрининга проникающих в клетку пептидов. Тип клетки, в которую проникает пептид, не ограничен, и клетка может быть или прокариотической клеткой или эукариотической клеткой, и пептид может предпочтительно проходить через клеточную мембрану эукариотической клетки, предпочтительно клетки млекопитающего, еще более предпочтительно через мембрану клеток слизистой оболочки млекопитающего. Пептид сам по себе проникает через клеточную мембрану и, кроме того, за счет ковалентного связывания с гидрофильным физиологически активным веществом, придает способность проникать через клеточную мембрану гидрофильному физиологически активному веществу. Предпочтительно, пептид может придавать способность проникать через клеточную мембрану гидрофильному физиологически активному веществу даже в случаях, когда пептид и гидрофильное физиологически активное вещество присутствуют в композиции независимо друг от друга.

Дополнительно, модифицированный пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, как и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, также представляет собой проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению при условии, что модифицированный пептид проникает через клеточную мембрану. В настоящем документе основная аминокислота означает любую из аминокислот аргинин, лизин и гистидин. Количество замещенных, удаленных, вставленных и/или добавленных основных аминокислот составляет предпочтительно от одной до семи, более предпочтительно от одной до пяти, еще более предпочтительно от одной до трех, особенно предпочтительно - одну. В аминокислотной последовательности, которая была мутирована путем замены, делеции и/или вставки, предпочтительно сохранена последовательность не менее чем из трех последовательных аминокислот в изначальной аминокислотной последовательности, и предпочтительно сохранена последовательность не менее чем из пяти последовательных аминокислот в изначальной аминокислотной последовательности. Дополнительно, в случае модифицированного пептида, полученного путем замещения основной аминокислоты/аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, другой основной аминокислотой(-ами), модификация является наиболее приемлемой, поскольку замещение другой аминокислотой с тем же свойством не меняет общие свойства пептида. Предпочтительные примеры пептида с аминокислотной последовательностью, такой же, как и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот удалены, замещены и/или добавлены, при этом пептид проникает через клеточную мембрану, включают в себя пептиды с аминокислотными последовательностями, представленными любыми из SEQ ID NO:2-4, 9-10 и 13.

Дополнительно, модифицированный пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, как и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что от одной до пяти, предпочтительно от одной до трех, более предпочтительно от одной до двух, еще более предпочтительно одна аминокислота(-ы), которые не ограничиваются основной аминокислотой(-ами), замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, также представляет собой проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению при условии, что модифицированный пептид проникает через клеточную мембрану. В аминокислотной последовательности, полученной путем замещения, делеции, вставки и/или добавления аминокислоты(-лот) в SEQ ID NO:1, предпочтительно сохранена последовательность не менее чем из трех последовательных аминокислот в изначальной аминокислотной последовательности, и более предпочтительно сохранена последовательность не менее чем из пяти последовательных аминокислот в изначальной аминокислотной последовательности. Дополнительно, например, в случаях, когда основная аминокислота(-ы) в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, замещена/замещены другой/другими основными аминокислотами; в случаях, когда гидрофильная аминокислота(-ы) в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, замещена/замещены другой/другими гидрофильными аминокислотами; и в случаях, когда гидрофобная аминокислота(-ы) в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, замещена/замещены другой/другими гидрофобными аминокислотами; модификация является наиболее приемлемой, поскольку замещение аминокислотой с тем же свойством не меняет общие свойства пептида. Предпочтительные примеры пептида с аминокислотной последовательностью, такой же, что и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что от одной до пяти аминокислот, которые не ограничиваются основными аминокислотами, замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, при этом пептид обладает способностью проникать через мембрану клеток, включают пептиды с аминокислотными последовательностями, представленными любой из SEQ ID NO:12 и 15-30.

Дополнительно, пептид с аминокислотной последовательностью, представленной обратной последовательностью пептида с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1; пептид с аминокислотной последовательностью, представленной обратной последовательностью аминокислотной последовательности, такой же, как и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, как и обратная последовательность аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько основных аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; пептид с аминокислотной последовательностью, представленной обратной последовательностью аминокислотной последовательности, такой же, как и аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:1, за исключением того, что от одной до пяти аминокислот, которые не ограничиваются основными аминокислотами, замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; пептид с аминокислотной последовательностью, такой же, как и обратная последовательность аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, за исключением того, что от одной до пяти аминокислот, которые не ограничиваются основными аминокислотами, замещены, удалены, вставлены и/или добавлены; также являются проникающими в клетку пептидами по настоящему изобретению при условии, что они проникают через клеточную мембрану. В настоящем документе пептид с обратной последовательностью означает, что последовательность аминокислот, идущих друг за другом, является обратной, и, например, когда последовательность аминокислот с N-конца по направлению к C-концу представляет собой аргинин, глутамин, изолейцин и лизин, ее обратный пептид означает пептид, чья последовательность аминокислот с N-конца по направлению к C-концу представляет собой лизин, изолейцин, глутамин и аргинин. Конкретные примеры включают пептиды с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:5 или 14, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную обратной последовательностью пептида с последовательностью аминокислот из SEQ ID NO:1, и которые проникают через клеточную мембрану.

В качестве аминокислот, входящих в состав проникающих в клетку пептидов по настоящему изобретению, можно использовать аминокислоты с L-конфигурацией, которые являются природными аминокислотами, а также неприродные аминокислоты, такие как производные, полученные путем частичной модификации структуры природных аминокислот. Например, поскольку аминокислоты с D-конфигурацией вряд ли будут разрушаться протеазами и, таким образом, могут быть эффективно использованы, часть аминокислотной последовательности пептида может иметь D-конфигурацию.

Аминокислоты, которые входят в состав проникающих в клетку пептидов по настоящему изобретению, не ограничены при условии, что они представляют собой молекулы с карбоксильной группой и аминогруппой, независимо от того, существуют ли такие аминокислоты в природе, и могут также быть аминокислотами, модифицированными при помощи посттрансляционных модификаций, наблюдаемых в норме в живом организме, таких как гидроксилирование, фосфорилирование или гликозилирование. Аминокислотная последовательность предпочтительно состоит из природных аминокислот, существующих в норме в клетках млекопитающих, и/или их оптических изомеров, и примеры последовательности аминокислот включают в себя последовательности, состоящие из аргинина (Arg), лизина (Lys), аспарагиновой кислоты (Asp), аспарагина (Asn), глутаминовой кислоты (Glu), глутамина (Gln), гистидина (His), пролина (Pro), тирозина (Tyr), триптофана (Trp), серина (Ser), треонина (Thr), глицина (Gly), аланина (Ala), метионина (Met), цистеина (Cys), фенилаланина (Phe), лейцина (Leu), валина (Val), изолейцина (Ile) и/или т.п.

Проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению при необходимости можно модифицировать способами, известными специалистам в данной области, и более конкретно, эти пептиды могут быть производными, которые химически модифицированы полиэтиленгликолизацией (пегилирование), ацетилированием N-конца, амидированием C-конца и/или т.п. Следует отметить, что в случаях, когда проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению применяют для нижеописанной фармацевтической композиции, пептид предпочтительно является немодифицированным. Дополнительно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению могут быть либо линейными, либо замкнуты в кольцо.

Проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению можно использовать в сочетании с другими известными проникающими в клетку пептидами. Дополнительно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению можно использовать в формах слитых пептидов или слитых белков, полученных слиянием пептидов с другими пептидами или белками посредством способа, описанного далее, при условии, что сохраняется способность проникать через клеточную мембрану.

Проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению можно получать обычными способами химического синтеза. Примеры способа получения включают в себя способы пептидного синтеза путем общеупотребительного способа жидкой фазы или твердофазного способа. Примеры таких способов пептидного синтеза включают способ пошагового удлинения, в котором каждая аминокислота последовательно связывается, удлиняя цепь, и способ конденсации фрагментов, в котором фрагменты, состоящие из нескольких аминокислот, синтезируются предварительно, а затем соответствующие фрагменты подвергаются реакции связывания. Синтез проникающих в клетку пептидов по настоящему изобретению можно проводить любым из этих способов.

Способ конденсации, применяемый для вышеуказанного пептидного синтеза, можно также проводить согласно любому из различных известных способов. Конкретные примеры таких способов включают азидный способ, способ смешанных ангидридов, DCC способ (дициклогексилкарбодиимидный), способ активированных сложных эфиров, окислительно-восстановительный способ, способ DPPA (дифенилфосфорилазидный), DCC+добавки (например, 1-гидроксибензотриазол, N-гидроксисукцинимид и N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимид) и способ Вудворда. Растворитель, который можно использовать для любого из этих способов, может быть соответствующим образом выбран из общеупотребительных растворителей, применение которых хорошо известно для таких типов реакций конденсации пептидов. Примеры растворителя включают диметилформамид (ДМФА), диметилсульфоксид (ДМСО), гексаметилфосфорамид, диоксан, тетрагидрофуран (ТГФ), этилацетат и их смеси.

В вышеописанных реакциях пептидного синтеза карбоксильные группы аминокислот или пептидов, которые не участвуют в реакциях, можно, как правило, защитить посредством этерификации с образованием низкоалкильного сложного эфира, такого как метильный сложный эфир, этильный сложный эфир или трет-бутильный сложный эфир; или аралкильного сложного эфира, такого как бензильный сложный эфир, п-метоксибензильный сложный эфир или п-нитробензильный сложный эфир. Дополнительно, гидроксильные группы аминокислот, имеющих функциональные группы в своих боковых цепях, например гидроксильную группу тирозина, можно защитить посредством ацетильной группы, бензильной группы, бензилоксикарбонильной группы, трет-бутильной группы или т.п., но такая протекция не обязательно нужна. Дополнительно, гуанидиновую группу аргинина можно защитить соответствующей защитной группой, такой как нитрогруппа, тозильная группа, 2-метоксибензолсульфонильная группа, метилен-2-сульфонильная группа, бензилоксикарбонильная группа, изоборнилоксикарбонильная группа или адамантилоксикарбонильная группа. Реакции снятия защиты для этих защитных групп в аминокислотах, пептидах и конечных пептидах по настоящему изобретению можно также проводить общепринятыми способами, такими как способ каталитического восстановления и способы с использованием жидкого аммиака/натрия, фторида водорода, бромида водорода, хлорида водорода, трифторуксусной кислоты, уксусной кислоты, муравьиной кислоты и метансульфоновой кислоты.

Альтернативно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению можно получить общепринятыми способами с использованием технологий генетической инженерии. Полученные таким образом проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению при необходимости можно очистить способами, которые широко используются в области пептидной химии, такими как способы с использованием ионообменных смол, разделительной хроматографией, гель-хроматографией, аффинной хроматографией, высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) и способом противоточного распределения.

Альтернативно, проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению можно использовать в формах нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды. Конкретные примеры нуклеиновых кислот включают в качестве неограничивающих примеров плазмидные векторы, вирусные векторы, фагмиды и транспозоны, которые содержат рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки с пептидами по настоящему изобретению и которые позволяют экспрессировать эти пептиды. Дополнительно, рекомбинантные нуклеиновые кислоты предпочтительно используют, например, для промышленного производства проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению или слитого белка с проникающим в клетку пептидом по настоящему изобретению; введения экспрессирующего вектора, кодирующего проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению, в клетки живого организма, изъятые из организма; и введения проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению в организм для создания в организме клетки, экспрессирующей проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению или слитый с ним белок. В частности, рекомбинантные нуклеиновые кислоты предпочтительно используют для способов продукции in vitro проникающих в клетку пептидов по настоящему изобретению или слитых белков с проникающими в клетку пептидами по настоящему изобретению.

Рекомбинантная нуклеиновая кислота означает ДНК или РНК, которые получены искусственно. Примеры рекомбинантной нуклеиновой кислоты включают нуклеиновые кислоты, синтезированные путем связывания нуклеиновых кислот, таких как аденин, цитозин, гуанин, тимин и/или урацил, друг с другом; нуклеиновые кислоты, полученные путем расщепления части ДНК или РНК, содержащейся в организме, и ее модификации путем удаления части ее оснований, связывания ее с другими основаниями и/или т.п.; и нуклеиновые кислоты, полученные путем репликации этих рекомбинантных нуклеиновых кислот.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит проникающий в клетку пептид и гидрофильное физиологически активное вещество, и к способу введения гидрофильного физиологически активного вещества в живой организм за счет комбинированного применения проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению и гидрофильного физиологически активного вещества.

Поскольку фактом является не только то, что проникающие в клетку пептиды по настоящему изобретению могут проникать через клеточную мембрану сами по себе, но также то, что пептиды могут придавать гидрофильным физиологически активным веществам способность проникать через клеточную мембрану, возможна доставка in vivo гидрофильного физиологически активного вещества через клеточную мембрану за счет смешивания проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению с фармацевтической композицией, содержащей в качестве действующего компонента гидрофильное физиологически активное вещество, или за счет введения гидрофильного физиологически активного вещества и проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению в комбинации. Более конкретно, поскольку проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению может не только предпочтительно проходить через клеточные мембраны слизистой оболочки, но дает возможность абсорбироваться через слизистую гидрофильному физиологически активному веществу (предпочтительно кишечная абсорбция или интраназальная абсорбция), возможна доставка in vivo гидрофильного физиологически активного вещества через слизистую оболочку. Абсорбция гидрофильного физиологически активного вещества через слизистую оболочку означает, что гидрофильное физиологически активное вещество, вводимое на слизистую оболочку, поступает в кровь через слой слизистой, и это можно подтвердить по увеличению уровня гидрофильного физиологически активного вещества в крови или проявлению фармакологической активности. Уровень гидрофильного физиологически активного вещества в крови можно измерить способом, который обычно используют специалисты в данной области, таким как иммунологический анализ. Фармакологическую активность можно измерить с использованием индикатора, в случае фермента - его ферментативной активности или, в случае вещества, которое воздействует на клеточный рецептор, свойства изменять функцию клетки-мишени или уровень выработки маркерного вещества. Например, фармакологическую активность инсулина можно измерить, используя в качестве индикатора уровень глюкозы в крови животного, которому вводили инсулин.

Проникающий в клетку пептид, который придает гидрофильному физиологически активному веществу способность проникать через клеточную мембрану, предпочтительно, абсорбироваться через слизистую оболочку, не ограничен, при условии, что пептид представляет собой указанный выше проникающий в клетку пептид по настоящему изобретению, и его конкретные примеры включают пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1, и модифицированный пептид, полученный путем замещения, удаления, вставки и/или добавления от одной до семи, предпочтительно от одной до пяти, более предпочтительно от одной до двух основных аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, при этом модифицированный пептид может проникать через клеточную мембрану. В частности, примеры проникающего в клетку пептида по настоящему изобретению, который дает возможность интраназальной абсорбции гидрофильному физиологически активному веществу и который предпочтительно применяют для фармацевтической композиции для интраназального введения, включают пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1, и модифицированный пептид, полученный путем замещения, удаления, вставки и/или добавления одной или двух основных аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, при этом модифицированный пептид может проникать через клеточную мембрану. Конкретные примеры пептида, который является проникающим в клетку пептидом по настоящему изобретению и дает возможность интраназальной абсорбции гидрофильному физиологически активному веществу; который является модифицированным пептидом, полученным путем замещения, удаления, вставки и/или добавления одной или двух основных аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, и который может проникать через клеточную мембрану; показаны в таблице 1. В модифицированном пептиде замещение основных аминокислот(-ы) в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID