Рекомбинантное получение пептидов

Рекомбинантное получение пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая группа изобретений относится к периодическим самособирающимся белкам-предшественникам, кодирующим их последовательностям нуклеиновых кислот и экспрессионным конструкциям, а также к способам рекомбинантного получения пептидов с применением таких белков-предшественников.

Уровень техники

Известны различные способы биотехнологического получения пептидов. Так как стабильность коротких полипептидных цепей в микробных клетках-хозяевах, как правило, является низкой, и так как свободные пептиды могут оказывать возможный токсичный эффект на организм хозяина (например, противомикробные пептиды), большинство способов включают продуцирование более крупных белков-предшественников, из которых пептид вырезается после того, как белок-предшественник был очищен.

Существует возможность получения стабильного белка-предшественника посредством экспрессии пептида вместе со стабильным белком в виде слитого белка. Свойства указанного слитого белка, которые сильно влияют на последующие стадии получения, определяются партнером слияния, в значительной степени независимо от пептидной последовательности, и поэтому являются легко контролируемыми и подходят для получения белков с различными последовательностями.

В WO 2008/085543 раскрывается конкретный способ поучения белков и пептидов с помощью слитого белка. Этот слитый белок содержит наряду с желаемой пептидной последовательностью партнер слияния, для которого характерен обратный фазовый переход. Эта характеристика, прежде всего, обеспечивает простую и недорогую очистку слитого белка от клеточных фрагментов. Во-вторых, партнер слияния также может быть выделен простым и недорогим образом, после того как пептид был удален посредством протеолитического расщепления. Тогда как слитый белок часто может быть получен с хорошим выходом, пептидная часть белка-предшественника, как правило, является маленькой, и поэтому эффективность способа не является оптимальной.

Другой подход относится к периодическим белкам-предшественникам, которые содержат множество копий целевого пептида, который подлежит рекомбинантному получению. В WO 03/089455 раскрывается получение мультимерных белков-предшественников, из которых целевые пептидные последовательности с противомикробными свойствами вырезаются посредством кислотного расщепления.

Существует ряд других концепций в опубликованном виде (например, Metlitskaya et al. Biotechnol Appl. Biochem 39; 339-345 (2004); Wang & Cai Appl. Biochem and Biotechnol. 141; 203-213 (2007)), которые показывают, что пептидные последовательности или семейства пептидных последовательностей могут быть получены установленным способом с помощью периодических белков-предшественников. До некоторой степени было описано применение особых вспомогательных последовательностей, которые локализованы между повторами целевых пептидных последовательностей. Более конкретно, были предложены анионные вспомогательные последовательности, которые очевидным образом уменьшают вредное воздействие катионных противомикробных пептидных последовательностей внутри периодического белка-предшественника на клетку-хозяина (смотрите, например, WO 00/31279 и US 2003/0219854). Так как белок-предшественник, согласно этой стереотипной концепции, имеет более значительную часть целевой пептидной последовательности, чем в случае со слитыми белками, последовательность целевого катионного пептида оказывает сильное влияние на свойства повторяющихся белков-предшественников.

Авторы не нашли каких-либо сведений о каком-либо ранее существующем способе получения какой-либо пептидной последовательности с помощью периодических белков-предшественников, который может быть осуществлен простым, выгодным и эффективным образом.

Различные противомикробные пептиды уже были описаны в литературе и рассмотрены в обзорах (Hancock, R.E.W. und Lehrer, R. 1998 in Trends in Biotechnology, 16: 82-88; Hancock, R.E.W. und Sahl, H.G. 2006 in Nature Biotechnology, 24: 1551-1557).

Слитые белки, в которых объединены два активных пептида, подобным образом описаны в литературе. Автор Wade с соавторами сообщают о противомикробном действии различных слияний цекропина А из Hyalophora cecropia и мелиттина пчелиного яда (Wade, D. et al., 1992, International Journal of Peptide and Protein Research, 40: 429-436). Автор Shin и его соавторы описывают противобактериальное действие слитого пептида цекропина А из Hyalophora cecropia и магаинина 2 из Xenopus laevis, содержащего 20 аминокислот. Цекропин А состоит из 37 аминокислот и проявляет активность в отношении грамотрицательных бактерий, но более низкую активность в отношении грамположительных бактерий. Магаинин 2 состоит из 23 аминокислот и проявляет активность в отношении бактерий, а также в отношении опухолевых клеточных линий. По сравнению со слитым пептидом цекропина А и мелиттина, этот слитый пептид проявляет намного более низкую гемолитическую активность при сопоставимом противобактериальном действии (Shin, S.Y. Kang, J.H., Lee, M.K., Kirn, S.Y., Kirn, Y., Hahm, K.S., 1998, Biochemistry and Molecular Biology International, 44: 1119-1126). В US 2003/0096745 A1 и в US 6,800,727 В2 раскрываются такие гибридные пептиды, состоящие из 20 аминокислот, а также раскрываются варианты такого слияния, которые являются более сильно положительно заряженными и являются более гидрофобными в результате замены аминокислот, особенно положительно заряженных аминокислот и гидрофобных аминокислот.

Автор Shin и его соавторы в 1999 г. описали другие разработки в отношении этого слитого пептида цекропина А и магаинина 2. Они продемонстрировали, что пептид, имеющий SEQ ID N0:6, обладает более низкой гомолитической активностью по сравнению с исходным слиянием, однако противобактериальная активность в отношении Escherichia coli и Bacillus sub-tilis не была понижена (Shin et al. 1999 Journal of Peptide Research, 53: 82-90).

Сущность изобретения

Таким образом, объектом настоящего изобретения является широко применяемый способ получения пептидов с помощью периодических белков-предшественников.

Данный объект обеспечивается благодаря новому подходу к биотехнологическому получению пептидов посредством получения периодических белков-предшественников, которые содержат высокую долю целевой пептидной последовательности и которые содержат вспомогательные последовательности, которые управляют свойствами белка-предшественника прогнозируемым образом. Указанный способ может применяться для получения различных пептидных последовательностей, без необходимости коренным образом заново устанавливать условия экспрессии молекулы-предшественника или процедуры последующей обработки для каждой из различных пептидных последовательностей. Более того, также возможно получать пептиды, для которых ранее применяемые способы не были эффективными.

Описание чертежей

На приведенных чертежах:

Фиг.1 показывает изображение проекции структуры альфа-спирали в виде диаграммы "зубчатое колесо" аминокислотных последовательностей. Аминокислотные последовательности, содержащиеся в периодическом белке-предшественнике, А1-А7 (А), изображены на круге (В). Это расположение позволяет визуализировать положение аминокислот в альфа-спирали;

Фиг.2 показывает обращение - фазовую хроматограмму для пептида "ZnO" после кислотного расщепления;

Фиг.3 показывает масс-спектр для пептида "ZnO" после кислотного расщепления и обращенно-фазовой ВЭЖХ; приведенные числа показывают величину m/z соответствующего моноизотопического пика;

Фиг.4 показывает обращено-фазовую хроматограмму для пептида "Р18" после кислотного расщепления и катионообменной хроматографии;

Фиг.5 показывает масс-спектр для пептида "Р18" после кислотного расщепления, катионообменной хроматографии и обращенно-фазовой ВЭЖХ;

приведенные числа показывают величину m/z конкретного моноизотопического пика;

Фиг.6 показывает обращенно-фазовую хроматограмму для пептида "Min" после кислотного расщепления;

Фиг.7 показывает масс-спектр для пептида "Min" после кислотного расщепления и обращенно-фазовой ВЭЖХ; приведенные числа показывают величину m/z конкретного моноизотопического пика;

Фиг.8 показывает обращенно-фазовую хроматограмму для пептида SEQ ID NO: 6 после кислотного расщепления и катионообменной хроматографии;

Фиг.9 показывает масс-спектр для пептида SEQ ID NO: 6 после кислотного расщепления, катионообменной хроматографии и обращено-фазовой ВЭЖХ; приведенные числа показывают величину m/z конкретного моноизотопического пика;

Фиг.10 показывает хроматограмму, полученную после ВЭЖХ и катионообменной хроматографии, для пептида "Р18" до и после амидирования согласно примеру 6; хроматограмма химически синтезированного и амидированного контрольного пептида с последовательностью пептида "Р18" показана для сравнения;

Фиг.11 показывает хроматограмму, полученную после ВЭЖХ и катионообменной хроматографии, для пептида "Р18" до и после амидирования согласно примеру 7; хроматограмма химически синтезированного и амидированного контрольного пептида с последовательностью пептида "Р18" показана для сравнения;

Предпочтительные варианты выполнения изобретения

Настоящая группа изобретений, в частности, относится к следующим вариантам выполнения изобретения:

1. Синтетический, в частности рекомбинантно полученный, белок-предшественник, содержащий ферментативно и/или химически расщепляемую повторяющуюся последовательность повторяющихся звеньев целевых пептидных элементов (Pep) и вспомогательных пептидных элементов (Aux) общей формулы:

(Pep-Aux)_x или

(Aux-Pep)_x,

где x>1, причем

элементы Aux являются идентичными или различными и содержат элементы аминокислотной последовательности, которые обеспечивают свойства самосборки указанного белка-предшественника; и

элементы Pep являются идентичными или различными и содержат аминокислотную последовательность идентичных или различных пептидных молекул.

2. Белок-предшественник согласно варианту выполнения изобретения 1, где элементы Pep и Aux пептидно связаны друг с другом напрямую или через расщепляемую пептидную последовательность, и пептидная связь специфически расщепляется химическим или ферментативным путем, то есть является исключительно или по существу расщепляемой по определенной аминокислоте или череде аминокислот последовательности.

3. Белок-предшественник согласно любому из предшествующих вариантов выполнения изобретения, который обладает свойствами самосборки, так чтобы образовываться самопроизвольно, то есть самостоятельно, или образует индуцируемые стабильные нековалентные ассоциаты, которые являются нерастворимыми в стандартных условиях, таких как, в частности, 0.2 М NaOH в течение одного часа или 2 М мочевина или 1 М гидрохлорид гуанидина, в каждом случае, в течение 10 минут, при комнатной температуре. Стабильный ассоциат согласно изобретению образуется в результате удовлетворения по меньшей мере одного из этих трех критериев.

4. Белок-предшественник согласно любому из предшествующих вариантов выполнения изобретения, где по меньшей мере один элемент Aux содержит самособирающийся пептидный элемент (SA), причем указанный элемент SA содержит по меньшей мере один мотив последовательности из по меньшей мере 8, как например, 8-10, 8-12, 8-14, 8-16, 8-18 или 8-20, примыкающих друг к другу аминокислот, которые содержат по меньшей мере 50%, например, 50-100%, 60-90% или 70-80%, остатков аланина, по меньшей мере 50%, например, 50-100%, 60-90% или 70-80% остатков валина, или по меньшей мере 50%, например, 50-100%, 60-90% или 70-80% остатков глутамина, или по меньшей мере 80% которых составляет по меньшей мере один из этих остатков; элемент SA может содержать, например, в частности, по меньшей мере один из следующих мотивов последовательности:

An	(мотив 1)
(GA)m	(мотив 2)
Vn	(мотив 3)
(VA)m	(мотив 4)
(WAA)o	(мотив 5)

где А представляет собой аланин, G представляет собой глицин, V представляет собой валин, n представляет собой целое число от 2 до 12, m представляет собой целое число от 2 до 10, и о представляет собой целое число от 1 до 6, где, более конкретно, n=5-10, m=4-8 и о=2-4, например, n=7-9, m=6-7 и о=2-3.

Указанные SA последовательности могут быть продолжены на С- и/или N-концах, в каждом случае, на еще 1-3 случайных аминокислотных остатка. Примерами подходящих N-терминальных продолжений являются мотивы последовательностей "G-", "GS-", "GAG-", "GPG-", "GPS-", "GAS-", "GQQ-" и "GSS-"; примерами подходящих С-терминальных продолжений являются мотивы последовательностей "-SGP", "-GGA", "-GPG", "-SGA", "-GGQ", "-GGY" и "-GGL".

5. Белок-предшественник согласно варианту выполнения изобретения 4, где элемент SA содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5 или SED ID No: 73.

6. Белок-предшественник согласно любому из предшествующих вариантов выполнения изобретения, где по меньшей мере один пептид Aux содержит защитный пептидный элемент (SU).

7. Белок-предшественник согласно варианту выполнения изобретения 6, где элемент SU обладает "повышенной долей" заряженных аминокислотных остатков, то есть (например, при рН=7) общий заряд отличен от О, например, составляет от +20 до -20 или от +10 до -10, или от +5 до -5, в частности отрицательно заряженных аминокислотных остатков, когда, например, при рН=7 общий заряд отличен от 0 и, например, составляет от -1 до -20, в частности от -4 до -10.

8. Белок-предшественник согласно варианту выполнения изобретения 7, где элемент SU в белке-предшественнике способен образовывать амфифильную спиральную структуру.

9. Белок-предшественник согласно варианту выполнения изобретения 8, где элемент SU представляет собой амфифильный пептид, содержащий сегмент последовательности из по меньшей мере семи пептидно связанных аминокислот, способных образовывать амфифильную альфа-спираль, причем указанная спираль в ее вертикальной проекции показывает разделение аминокислотных остатков на гидрофобную половину и гидрофильную половину спирали, причем гидрофобная половина спирали в ее вертикальной проекции имеет по меньшей мере 3, например, 3 или 4 идентичных или различных смежных гидрофобных аминокислотных остатка, и гидрофильная половина спирали в ее вертикальной проекции имеет по меньшей мере 3, например, 3 или 4 идентичных или различных смежных гидрофильных аминокислотных остатка.

10. Белок-предшественник согласно варианту выполнения изобретения 7, 8 или 9, где доля заряженных аминокислотных остатков элемента SU выбирается таким образом, что общий суммарный заряд белка-предшественника при рН=7 больше -10 и меньше +10, например больше -8 и меньше +8; больше -5 и/или меньше +5, больше -2 и меньше +2.

11. Белок-предшественник согласно вариантам выполнения изобретения 7-10, где элемент SU содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 16-SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 68.

12. Белок-предшественник согласно любому из предшествующих вариантов выполнения изобретения, где элемент Pep содержит противомикробную пептидную последовательность, имеющую общий катионный положительный заряд.

13. Белок-предшественник согласно варианту выполнения изобретения 12, где элемент Pep содержит аминокислотную последовательность, выбранную из катионных аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6-SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 72 или любой из их C-терминально и/или N-терминально модифицированных форм, указанных ниже.

14. Белок-предшественник согласно вариантам выполнения изобретения 1-5, где пептид Pep содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 29-67 или любой из их C-терминально и/или N-терминально модифицированных форм, указанных ниже.

15. Белок-предшественник согласно любому из предшествующих вариантов выполнения изобретения, где элементы Aux независимо друг от друга имеют одно из следующих значений:

SA,

SA-SU,

SU-SA,

SA-SU-SA,

SU-SA-SU,

где элементы SA и SU пептидно связаны друг с другом, и элементы Aux терминально пептидно связан с по меньшей мере одним элементом Pep, то есть напрямую или через расщепляемую пептидную последовательность, где по меньшей мере пептидная связь с элементами Pep специфически расщепляется химическим или ферментативным путем.

16. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере один белок-предшественник согласно одному из предшествующих вариантов выполнения изобретения.

17. Последовательность нуклеиновой кислоты согласно варианту выполнения изобретения 16, содержащая по меньшей мере одну кодирующую последовательность SEQ ID NO: 21, 24, 27, 74 и 76.

18. Экспрессионная кассета, содержащая по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты согласно варианту выполнения изобретения 16 или 17, оперативно связанную с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью нуклеиновой кислоты.

19. Рекомбинантный вектор для трансформации эукариотического или прокариотического хозяина, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов выполнения изобретения 16 и 17, или экспрессионную кассету согласно варианту выполнения изобретения 18.

20. Способ получения целевого пептида (Pep), который содержит

a) получения белка-предшественника согласно одному из вариантов выполнения изобретения 1-15;

b) удаление пептидов Pep из белка-предшественника; и

с) при необходимости ферментативную или химическую модификацию, как например, амидирование, этерифицирование с образованием сложных эфиров, окисление, алкилирование пептида или связывание его с другой молекулой (например, с помощью естественного химического лигирования или посредством добавления по Михаэлю); где, например, пептид модифицируют молекулой, которая повышает гидрофобность указанного пептида, например, модифицируют молекулой, содержащей алкильный радикал; где указанную модификацию возможно осуществлять перед или после необязательной очистки пептида, далее приводятся соответствующие примеры в целях иллюстрации.

Примерами подходящих алкильных радикалов являются С₂-С₁₆-алкильные радикалы, такие как этил, изопропил или н-пропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил или трет-бутил, н-пентил или изопентил; а также н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил, н-ундецил, н-додецил, н-тридецил, н-тетрадецил, н-пентадецил и н-гексадецил, или их однократно или многократно разветвленные аналоги, и их при необходимости замещенные модификации, которые могут иметь один или более заместителей, как, например, 1, 2 или 3 галогена (как, например, F, Cl, Br), гидрокси, меркапто, амино, C₁-C₄-алкиламино, или могут прерываться одним или более, например, 1, 2 или 3, гетероатомами, такими как О или N, в алкильной цепи. Более конкретно, C₁-C₄-алкил представляет собой метил, этил, изопропил или н-пропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил или трет-бутил.

21. Способ согласно варианту выполнения изобретения 20, где белок-предшественник продуцируется в рекомбинантном микроорганизме, несущем по меньшей мере один вектор согласно варианту выполнения изобретения 19.

22. Способ согласно варианту выполнения изобретения 21, где белок-предшественник продуцируется в рекомбинантном штамме Е.coli.

23. Способ согласно любому из вариантов выполнения изобретения 20-22, где экспрессированный белок-предшественник, при необходимости, после того как был превращен в стабильную ассоциированную форму, подвергают очистке и химическому или ферментативному расщеплению с высвобождением целевого пептида (Pep).

24. Белок-предшественник, содержащий расщепляемую последовательность целевых пептидных элементов (Pep) и вспомогательных пептидных элементов (Aux') общей формулы:

(Pep-Aux')_x или

(Aux'-Pep)_x,

где x>1, причем

элементы Aux' являются идентичными или различными и содержат амфифильный пептид, образующий альфа-спираль, причем указанный амфифильный пептид содержит сегмент последовательности из по меньшей мере семи пептидно связанных аминокислот, способных образовывать амфифильную альфа-спираль, причем указанная спираль в ее вертикальной проекции показывает разделение аминокислотных остатков на гидрофобную половину и гидрофильную половину спирали, причем гидрофобная половина спирали в ее вертикальной проекции имеет по меньшей мере 3, например, 3 или 4 смежных идентичных или различных гидрофобных аминокислотных остатка, и гидрофильная половина спирали в ее вертикальной проекции имеет по меньшей мере 3, например, 3 или 4 смежных идентичных или различных гидрофильных аминокислотных остатка;

и элементы Pep являются идентичными или различными и содержат аминокислотную последовательность идентичных или различных пептидных молекул.

25. Белок-предшественник согласно варианту выполнения изобретения 24, где элементы Aux' содержат по меньшей мере один самособирающийся пептидный элемент (SA), как определено в любом из вариантов выполнения изобретения 4 и 5.

26. Белок-предшественник согласно варианту выполнения изобретения 24 или 25, где целевым пептидом (Pep) является катионный противомикробный пептид, и элементом Aux' является анионный пептид, формирующий амфифильную альфа-спираль.

27. Применение амфифильного пептида в качестве защитного пептида для рекомбинантного получения противомикробного целевого пептида, отличного от него; где указанный амфифильный пептид содержит участок последовательности из по меньшей мере семи пептидно связанных аминокислот, способных образовывать амфифильную альфа-спираль, причем указанная спираль в ее вертикальной проекции показывает разделение аминокислотных остатков на гидрофобную половину и гидрофильную половину спирали, причем гидрофобная половина спирали (в ее вертикальной проекции) имеет по меньшей мере 3 смежных идентичных или различных гидрофобных аминокислотных остатка, и гидрофильная половина спирали (в ее вертикальной проекции) имеет по меньшей мере 3 смежных идентичных или различных гидрофильных аминокислотных остатка;

28. Применение согласно варианту выполнения изобретения 27, где целевой пептид (Pep) представляет собой катионный противомикробный пептид, и элемент Aux' представляет собой анионный пептид, формирующий амфифильную альфа-спираль.

29. Способ согласно любому из вариантов выполнения изобретения 20-22, где получают белок-предшественник согласно варианту выполнения изобретения 12 или 13, как, например, белок-предшественник, содержащий Р18 пептидные строительные блоки согласно SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 6.

30. Способ согласно варианту выполнения изобретения 29, который включает следующие стадии:

- промывание ассоциатов белка-предшественника растворителем, который растворяет содержащиеся белки, но не растворяет или по существу не растворяет указанные ассоциаты, как, например, 0.1 М-1.0 М NaOH;

- расщепление белков-предшественников, например, кислотой, если целевой пептид, например, Р18, включен в белок-предшественник посредством расщепляемых кислотой групп.

31. Способ согласно варианту выполнения изобретения 30, который включает по меньшей мере одну из следующих дополнительных стадий:

- обработка ассоциата белка-предшественника осаждающим агентом, таким как, например, фосфорная кислота, после разрушения клетки;

- очистка пептида от продуктов расщепления с помощью хроматографического способа;

- промывание очищенного и высушенного пептида кислотным растворителем или смесью растворителей.

32. Способ согласно любому из вариантов выполнения изобретения 20-23 и 29-31 для получения пептида SEQ ID NO: 23, где способ включает следующие стадии:

- обработка ассоциатов белка-предшественника после разрушения клетки путем добавления 85% сильной фосфорной кислоты до рН=3;

- промывание ассоциатов белка-предшественника раствором гидроксида натрия, например 0.4 М NaOH;

- расщепление белка-предшественника фосфорной кислотой или муравьиной кислотой, например, 2% фосфорной кислотой;

- при необходимости промывание высушенного пептида капроновой кислотой или смесью из 99 частей гексана и одной части уксусной кислоты.

33. Способ согласно любому из вариантов выполнения изобретения 20-23 и 29-31 для получения пептида SEQ ID NO: 6, где способ включает следующие стадии:

- гидролиз или расщепление гранул, например, посредством 5% H3PO4;

- центрифугирование;

- доведение pH супернатанта до около 4.0, например, с помощью 25% NaOH;

- очищение супернатанта посредством катионообменной хроматографии;

- осаждение целевого пептида, например, путем добавления NaOH к элюату;

- центрифугирование;

- ресуспендирование гранул в воде;

- растворение пептида, например, путем добавления уксусной кислоты;

- лиофилизация.

34. Изобретение, кроме того, относится к пептиду Р18 (SEQ ID NO: 23) и пептиду SEQ ID NO: 6, а также к их получению согласно изобретению, и к их применению в косметических или фармацевтических средствах для лечения или предотвращения шелушения, в частности, перхоти; или для ингибирования роста и/или активности липофильных грибов, в частности Malassezia ssp., конкретно Malassezia furfur. Это также описывается, например, в другой международной заявке РСТ/ЕР2008/010912, поданной 19 декабря 2008 г., описание которой включено в настоящую заявку в полном объеме посредством ссылки.

Подробное описание отдельных объектов изобретения

1. Пептиды

Пептиды (Pep) согласно настоящему изобретению, которые также могут упоминаться как "желаемые пептиды" или "целевые пептиды", представляют собой аминокислотные цепочки, в которых от 2 до 100, например, 5-70 и, в частности, 7-50, например, 10-40, 12-35 или 15-25, аминокислот связаны пептидными связями. Пептиды могут состоять из любых α-аминокислот, в частности протеиногенных аминокислот.

Пептиды могут иметь конкретные желательные биологические или химические и, в частности, также фармацевтические свойства. Примерами таких свойств являются: противомикробная активность, специфическое связывание с конкретными поверхностями, свойства образовывать зародыш в процессах кристаллизации и при образовании частицы, контроль кристаллических структур, связывание металлов или металлических ионов, свойства поверхностно-активных веществ, эмульгирующие свойства, свойства стабилизации пены, влияние на клеточную абсорбцию.

Указанные пептиды могут иметь одно или более из этих свойств.

В одном варианте выполнения изобретения наше изобретение относится к способу получения противомикробных пептидов. Такие "противомикробные пептиды" характеризуются способностью ингибировать рост и/или размножение по меньшей мере одного вида грамположительных или грамотрицательных бактерий и/или по меньшей мере одного вида дрожжей и/или по меньшей мере одного вида мицелиальных грибов и/или по меньшей мере одного вида водорослей, и и/или разрушать клетки соответствующих организмов, при концентрациях противомикробного пептида ≤100 мкМ.

В одном варианте выполнения изобретения, изобретение обеспечивает катионные противомикробные пептиды. Катионные противомикробные пептиды отличаются противомикробном действием, как указано выше, и имеют суммарный заряд более 0 при рН 7.

Катионные пептиды этого вида содержат, например, следующую последовательность:

X₁X₂KX₃X₄X₅KIPX₁₀KFX₆X₇X₈AX₉KF (SEQ ID NO: 7), где

Х10 представляет собой пептидную связь или любой один или два основных или гидрофобных аминокислотных остатка, или один или два остатка пролина, и

Х1-Х9 представляют собой любой из основных или отличных от пролина гидрофобных аминокислотных остатков;

и/или ее мутанты или производные,

где соответствующие мотивы последовательности, присутствующие в белке-предшественнике, могут быть идентичными или различными.

В следующем конкретном варианте выполнения изобретения, изобретение относится к получению пептидов, содержащих следующую последовательность

X₁X₂KX₃X₄X₅KIPX₁₁X₁₂KFX₆X₇X₈AX₉KF (SEQ ID NO: 8),

где

X1 представляет собой лизин, аргинин или фенилаланин,

Х2 представляет собой лизин или триптофан,

X3 представляет собой лейцин или лизин,

Х4 представляет собой фенилаланин или лейцин,

Х5 представляет собой лейцин или лизин,

X6 представляет собой лейцин или лизин,

Х7 представляет собой гистидин или лизин,

Х8 представляет собой аланин, лейцин, валин или серин,

Х9 представляет собой лейцин или лизин,

X11 представляет собой пролин или химическую связь, и

Х12 представляет собой пролин или химическую связь,

и/или ее мутанты или производные;

где соответствующие мотивы последовательности, присутствующие в белке-предшественнике, могут быть идентичными или различными.

Неограничивающими примерами последовательностей или повторяющихся мотивов последовательностей являются SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9-SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, и/или их мутанты или производные.

Другие подходящие пептиды описываются, например, в международной заявке того же заявителя, РСТ/ЕР2008/010912, поданной 19 декабря 2008, которая включена в настоящую заявку в полном объеме посредством ссылки.

2. Периодические белки-предшественники

Периодические белки-предшественники согласно настоящему изобретению отличаются тем, что по меньшей мере 60%, в частности по меньшей мере 80% их аминокислотной последовательности, например 60-99%, 70-95%, 75-85%, в каждом случае от общей длины последовательности, состоит из повторяющихся пептидных звеньев (как определено далее). Оставшаяся часть может содержать, например, неповторяющиеся пептиды, такие как, например, сигнальные пептиды, метки и тому подобное.

3. Повторяющиеся звенья

Повторяющиеся пептидные звенья содержат по меньшей мере один пептид, предпочтительно полученный согласно настоящему изобретению предпочтительным образом, и, фактически, сконструированы следующим образом:

(Pep-Aux)_x или

(Aux-Pep)_x,

где x>1, и Pep представляет собой пептид, отмеченный выше, и Aux является таким, как определено выше.

Повторяющееся звено (Pep-Aux или Aux-Pep) согласно настоящему изобретению представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую 10-200, например, 20-130 и/или 30-80 аминокислот в длину, которая присутствует в белке-предшественнике множество раз, либо в виде идентичных последовательностей, либо в виде вариантов конкретной последовательности, обладающих по меньшей мере 70%, например, по меньшей мере 80% и, в частности, по меньшей мере около 90% идентичностью, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности. Периодические белки-предшественники согласно настоящему изобретению могут, таким образом, содержать, например, идентичные копии или варианты одной аминокислотной последовательности или множества различных аминокислотных последовательностей, например Pep и/или Aux строительные блоки.

Более того, многие из указанные повторяющихся звеньев, например, 1-100, 1-50 или 2-32 и, в частности, 4-16 могут быть соединены вместе в периодическом белке-предшественнике.

Доля пептида согласно настоящему изобретению в повторяющемся звене, на основе молярной массы, составляет 20%-80%, например 30%-70% или 40-60%. Оставшаяся часть повторяющегося звена состоит из Aux последовательностей, в частности SA и SU последовательностей, определенных выше, и при необходимости специфически расщепляемых последовательностей для селективного удаления Pep строительного блока.

4. Вспомогательные последовательности

Вспомогательные последовательности в самом широком смысле представляют собой аминокислотные последовательности в белке-предшественнике согласно изобретению, которые влияют на свойства белка-предшественника, улучшая экспрессию, стабильность и/или обработку белка-предшественника. Вспомогательные последовательности в периодическом белке-предшественнике могут быть частью повторяющегося звена (Aux строительные блоки указаны выше) или могут быть присоединены к амино-концу или карбокси-концу белка-предшественника, как, например, 6 × His-Tag (HHHHHH), Т7-Tag (MASMTGGQQMG), S-Tag (KETAAAKFERQHMDS), c-Myc-Tag (EQKLISEEDL), Strep-Tag (WSHPQFEK) или НА-Tag (YPYDVPDYA), глутатион S-трансфераза, связывающий мальтозу белок, связывающий целлюлозу белок. Эти и другие вспомогательные последовательности описываются в Terpe; AppI Microbiol Biotechnol; 60(5): 523-33 (2003). Корме того, вспомогательная последовательность CanA (Maijn Vitro Untersuchungen zum extrazellularen Netzwerk von Pyrodictium abyssi TAG11" Dissertation, Universitat Regensburg (1998)) и yaaD (Wohlleben Eur Biophys J, (2009) онлайн публикация) полезны для присоединения к амино-концу или карбокси-концу белка-предшественника.

В одном варианте выполнения изобретения белок-предшественник содержит вспомогательные последовательности, которые влияют на стабильность указанного белка-предшественника.

В предпочтительном варианте выполнения изобретения вспомогательные последовательности влияют на свойства "самосборки" белка-предшественника. Указанные свойства самосборки белка-предшественника отличаются тем, что указанный белок-предшественник уже в ходе экспрессии "самопроизвольно" формирует стабильные ассоциаты, то есть самостоятельно, без дополнительно требуемых средств, или образование таких стабильных ассоциатов из растворимых белков-предшественников может быть запущено "индуцируемым образом", то есть через «запускающие» агенты. Белки-предшественники, обладающие свойствами самосборки, имеют преимущества по сравнению с другими белками-предшественниками, благодаря тому, что они могут быть очищены простым и эффективным образом. Ассоциаты такого вида, как правило, содержат исключительно или по существу нековалентные связи, такие как, например, водородные связи, ионные и/или гидрофобные взаимодействия.

Самособирающиеся последовательности могут составлять, например, 8 последовательных аминокислот в длину. Подходящие последовательности могут быть локализованы, например, в известных белках, в которых ранее уже была обнаружена сборка в высокомолекулярные ассоциаты. Примерами таких ассоциатов являются амилоидные фибриллы, актиновая или миозиновая нить, белковые волокна, такие как волокна эластина, волокна коллагена, биссусные нити мидий, волокна кератина или нити шелка. Эти и другие белки, содержащие самособирающиеся последовательности, описываются в документе Scheibel, Current Opinion in Biotechnology 16; 1-7 (2005), который включен в настоящую заявку в полном объеме посредством ссылки.

Растворы космотропных солей могут применяться в качестве "запускающих агентов". В качестве примеров космотропных солей можно упомянуть, например, соли, содержащие по меньшей мере один тип иона, который имеет более выраженные космотропные свойства, чем ион натрия или хлоридный ион в соответствии с так называемым рядом Гофмейстера. Примерами таких солей являются фосфат калия и сульфат аммония. Примерами таких растворов солей являются 0.5 М раствор фосфата калия и 0.8 М раствор сульфата аммония.

Подходящие ассоциаты белков-предшественников по изобретению отличаются возможностью сохранения их ассоциированной формы в течение определенного периода времени, в ходе обработки растворами, как правило, способными солюбилизировать множество агрегированных белков, и, таким образом, могут быть отделены от белковых загрязнителей. Примерами таких растворов являются растворы оснований, кислот, мочевины, солей и детергентов. Более конкретно, стабильные ассоциаты согласно изобретению нерастворимы в течение определенного периода времени в растворах гидроксидов щелочных металлов, мочевины, солей гуанидина или заряженных детергентов, таких как, например, соли алкилтримети-ламмония или алкилсульфаты.

Более конкретно, стабильные ассоциаты нерастворимы в течение определенного периода времени в растворах ≥0.2 М гидроксида натрия, ≥2 М мочевины, ≥1 М гидрохлорида гуанидина, ≥1 М тиоцианата гуанидина или ≥0.1% додецилсульфата натрия, или ≥0.1% бромида цетилтриметиламмония. Более конкретно, стабильные ассоциаты белков-предшественников являются стабильными в вышеописанных растворах в течение ≥10 минут, например ≥30 минут и, в частности, ≥60 минут.

Стабильный ассоциат, в частности, не растворяется

a) 0.2 М раствором NaOH в течение одного часа, и/или

b) 2 М раствором мочевины и/или

c) 1 М раствором гидрохлорида гуанидина в течение 10 минут при комнатной температуре (то есть, около 20°C).

В следующем конкретном варианте выполнения изобретения, белок-предшественник содержит вспомогательные последовательности (SU), которые защищают клетку-хозяина от вредных воздействий периодического белка-предшественника.

В конкретном варианте выполнения