Экспресс-способ определения атерогенности иммунных комплексов сыворотки крови человека

Экспресс-способ определения атерогенности иммунных комплексов сыворотки крови человека

Реферат

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для определения атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛПНП) в сыворотке крови человека.

В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют доступные для рутинных исследований методы определения атерогенности ИК-ммЛПНП. Учитывая важную патогенетическую роль иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности, при атеросклерозе, остается актуальной разработка простых, доступных для лабораторных исследований способов определения атерогенности ИК-ммЛПНП [1, 3, 4].

Известен способ определения атерогенности сыворотки крови по ее способности вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках [5]. Недостатком этого способа являются трудоемкость, высокая себестоимость, сложность и длительность проведения исследования.

В качестве прототипа использован способ оценки атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротены низкой плотности [2].

В прототипе преципитат иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности, из сыворотки крови человека готовят путем обработки буфером, содержащим 8,3% ПЭГ 3350 и 3,3% ПВП 12600, в соотношении 1:1,2, инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Преципитат, содержащий ИК-ммЛПНП, отделяют центрифугированием при 3100g в течение 10 мин при 23°С, растворяют в буфере без ПЭГ и ПВП, определяют содержание холестерина в иммунных комплексах (ХИК) с использованием ферментативного набора, степень связывания комплемента (ССК) морской свинки, рассчитывают атерогенность иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, как отношение ССК к ХИК.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа экспресс-определения атерогенности иммунных комплексов сыворотки крови человека для рутинных исследований с высокой точностью и с минимальной затратой времени.

Эта задача решается тем, что специфическую преципитацию циркулирующих иммунных комплексов сыворотки, содержащих ммЛПНП, проводят путем обработки сыворотки буферным раствором, содержащим препарат ПЭГ-3350, инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре, затем образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждают центрифугированием, декантируют, полученный преципитат ИК растворяют в буфере без ПЭГ-3350, определяют содержание холестерина в преципитированных иммунных комплексах (ХИК) с использованием коммерческого набора «Холестерин» и степень связывания комплемента морской свинки, после чего рассчитывают атерогенность ИК как отношение ССК к ХИК. При величине этого показателя ниже 4 ЕД констатируют повышенную атерогенность ИК-ммЛПНП.

Способ определения атерогенности ИК-ммЛПНП включает:

1. Буфер-1 для преципитации ИК содержит 10% полиэтиленгликоль с молекулярной массой 3350 («Sigma», США) в 0,01 М трис-HCl-буфере с рН 7,4, содержащем 0,15М NaCl;

2. Буфер-2 для растворения преципитата ИК, представляет собой 0,01М Трис-HCl-буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 M NaCl.

Способ экспресс-определения атерогенности ИК сыворотки крови осуществляют следующим образом. Проводят забор крови натощак из локтевой вены человека, отделяют сыворотку и определяют уровень холестерина и степень связывания комплемента морской свинки в ПЭГ-преципитатах путем обработки сыворотки крови Буфером-1 в соотношении 1:3,5 для преципитации ИК, инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре, осаждением преципитата центрифугированием, декантацией и последующим растворением его в исходном объеме в Буфере-2. Холестерин в ИК определяют с использованием коммерческого набора «Холестерин». Комплемент-связывающую способность иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные ЛПНП, исследуют с помощью гемолитического теста с использованием комплемента морской свинки, стандартизованных (1,5×10⁸ кл/мл) эритроцитов барана, сенсибилизированных кроличьими антителами (ЕА), в вероналовом солевом буфере, содержащем 0,5 мМ MgCl₂ и 0,15 мМ CaCl₂ (VBS²⁺).

Рассчитывают атерогенность ИК в ЕД как отношение ССК к холестерину в преципитированных иммунных комплексах (ХИК). При величине ССК/ХИК менее 4 ЕД констатируют повышенную атерогенность иммунных комплексов сыворотки крови человека.

Этап 1. Определение содержания холестерина в иммунных комплексах в сыворотке крови доноров и больных с атеросклерозом коронарных артерий. Приготовление преципитата иммунных комплексов из сыворотки: к 50 мкл сыворотки крови добавляют 125 мкл буфера-1 и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждают центрифугированием при 3000 g в течение 10 мин при 23°С. Супернатант тщательно декантируют и осадок растворяют в 50 мкл буфера-2. Содержание холестерина определяют с использованием коммерческого набора «Холестерин» фирмы «ЗАО Эколаб» (Россия). Полученные результаты представлены в таблице.

Этап 2. Определение степени связывания комплемента морской свинки иммунными комплексами, содержащими ммЛПНП. К 10 мкл растворов преципитатов, разбавленных 1:99 буфером VBS²⁺, добавляют 12 мкл разбавленного 1:19 раствора комплемента морской свинки. Общий объем доводят до 0,3 мл буфером VBS²⁺ и инкубируют 20 мин при 37°С. После инкубации добавляют 200 мкл ЕА и повторно инкубируют 30 мин при 37°С. После инкубации реакцию останавливают добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15М NaCl, центрифугируют и определяют величину лизиса эритроцитов по выходу гемоглобина в супернатант. Контрольная проба не содержит преципитата иммунных комплексов. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствует о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяют по формуле;

У(%)=[(Х-R)/(Н-R)×100],

где H, R и Х - величины оптической плотности А₄₀₅ в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяют по формуле:

ССК(%)=100-У.

Полученные результаты представлены в таблице.

Этап 3. Определение атерогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП (АИК-ммЛПНП). АИК-ммЛПНП рассчитывают в сыворотке крови обследуемых индивидуумов как отношение степени связывания комплемента к холестерину преципитированных иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП (ХИК). Полученные данные представлены в таблице.

Как видно из данных, представленных в таблице, содержание ХИК в сыворотке крови здоровых доноров в 100% случаев было ниже 10 мг/дл (разброс от 2,3 до 9,2 мг/дл), в то время как ХИК в сыворотке крови кардиологических больных, с инструментально подтвержденным атеросклерозом коронарных артерий, был в среднем в 4,7 раза выше нормальных величин и варьировал от 13,8 до 67,5 мг/дл. Степень связывания комплемента морской свинки ПЭГ-преципитатом в группе здоровых доноров была значительно выше, чем в группе больных (в среднем 62% и 47%, соответственно).

Полученные результаты по оценке атерогенности иммунных комплексов свидетельствуют однозначно о том, что иммунные комплексы больных с атеросклерозом коронарных артерий обладают сниженной комплемент-активирующей способностью, в данном случае гетерогенного комплемента морской свинки. И как следствие - повышенный уровень иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, в крови у больных с атеросклерозом каротидных артерий из-за нарушения их солюбилизации и элиминации с участием аутологичной системы комплемента. Сниженная комплемент-активирующая способность иммуноглобулинов в иммунных комплексах больных с атеросклерозом также приводит к незавершенному фагоцитозу и, как следствие, - образованию «пенистых» клеток при данной патологии.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить функциональную оценку атерогенности иммунных комплексов с минимальной затратой времени и средств, а также проводить широкие скрининговые обследования, диагностировать атеросклероз на доклинической стадии, прогнозировать течение атеросклеротического процесса у больных в динамике. Выявление повышенного уровня ХИК при широких скрининговых обследованиях может быть предиктором атеросклероза на доклинической стадии. Доступность реагентов и простота способа определения ХИК в лабораторной практике позволяет проводить углубленное исследование патогенеза атеросклеротических заболеваний. С другой стороны, внедрение способа определения атерогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, в лабораторную практику позволит разрабатывать новые методы терапии атеросклероза и контролировать эффективность проводимого лечения.

Литература

1. Собенин И.А., Карагодин В.П., Мельниченко А.А., Орехов А.Н. Холестерин иммунных комплексов как индикатор атеросклероза // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - №3. - С.99-103;

2. Шойбонов Б.Б., Кравченко М.А., Шабалина А.А., Костырева М.В., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф. Оценка атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Неинфекционные заболевания и здоровье населения России» 16-17 мая 2013 г. Москва. Тез. Докладов. / /Профилактическая медицина. - 2013. - Т.16, №2 (выпуск 2). - С.150.

3. Burut D.F.P., Karim Y., Ferns G.A.A. The Role of Immune Complexes in Atherosclerosis // Angiology. - 2010. - V.61, №7. - P.679-689].

4. Lopes-Virella M.F., Brent McHenry M., Lipsitz S., et al. Immune complexes containing modified lipoproteins are related to the progression of internal carotid intima-media thickness in patients with type 1 diabetes // Atherosclerosis. - 2007. - V.190. - P.359-369.

5. Tertov V.V., Orekhov A.N., Nikitina N.A. et al. Peritoneal macrophages: a model for detecting atherogenic potential in pattens′ blood serum // Ann. Med. - 1989. - V.21(6). - P.455-459

Таблица
Содержание холестерина иммунных комплексов (ХИК), степень связывания комплемента (ССК) и атерогенность иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП (АИК-ммЛПНП) в ПЭГ-преципитатах сывороток крови доноров и кардиологических больных
Доноры	ХИК, мг/дл	ССК, %	АИК-ммЛПНП	Больные	ХИК, мг/дл	ССК, %	АИК-ммЛПНП
1	5,2	56	108	1	16,6	43	2,6
2	6,4	70	109	2	15,6	52	3,3
3	2,3	27	117	3	33,4	74	2,2
4	4,5	80	178	4	13,8	18	3,5
5	9,2	78	85	5	44,5	8	0,2
6	5,0	41	82	6	67,5	22	0,3
7	5,3	53	100	7	34,2	19	0,6
8	5,7	82	144	8	17,5	45	2,6
9	6,8	73	107	9	27,7	89	3,2
10	7,8	69	89	10	24,9	78	3,1
11	8,4	49	58	11	18,6	74	4,0
M±m	6,1±2,0	62±18	107±32	M±m	28,6±16,1	47±28	2,3±1,4

Экспресс-способ определения атерогенности иммунных комплексов (ИК) сыворотки крови человека путем обработки ее в течение 10 мин буфером, содержащим полиэтиленгликоль (ПЭГ), осаждением ИК центрифугированием, определением холестерина в иммунных комплексах (ХИК) и степени связывания комплемента (ССК), отличающийся тем, что обработку сыворотки ведут 10% раствором ПЭГ-3350 в 0,01М Трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при объемном соотношении сыворотка: ПЭГ-3350 (1:3,5), рассчитывают атерогенность ИК как отношение ССК к ХИК и при величине менее 4 ЕД констатируют повышенную атерогенность крови.