Гуманизированные fcγr мыши

Гуманизированные fcγr мыши

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Область техники, к которой относится изобретение, представляет собой генетически модифицированных животных, не относящихся к человеку, у которых отсутствуют гены эндогенного мышиного FcγR, генетически модифицированных животных, которые содержат замену генов эндогенного FcγR на гены человеческого FcγR, мышей, способных к экспрессии, по меньшей мере, двух, трех, четырех или пяти генов функционального человеческого низкоаффинного FcγR, и генетически модифицированных мышей, содержащих иммунные клетки, которые не экспрессируют гены эндогенного низкоаффинного FcγR.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Fc-рецепторы (FcR) представляют собой белки, обнаруживаемые на поверхности клеток иммунной системы, которые выполняют разнообразные функции иммунной системы у млекопитающих. FcR существуют у разнообразных типов, на разнообразных клетках и опосредуют разнообразные иммунные функции, такие как, например, связывание с антителами, которые прикрепляются к инфицированным клеткам или инвазивным патогенам, стимулируя фагоцитарные или цитотоксические клетки к разрушению микробов, или инфицированным клеткам посредством опосредованного антителом фагоцитоза или антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC).

ADCC представляет собой процесс, посредством которого эффекторные клетки иммунной системы лизируют клетку-мишень, связанную антителами. Этот процесс зависит от предшествующего подвергания воздействию чужеродного антигена или клетки, приводящего в результате к гуморальному ответу. ADCC может быть опосредована через эффекторные клетки, такие как, например, естественные клетки-киллеры (NK), посредством связывания FcR, экспрессируемого на поверхности эффекторной клетки с Fc частью антитела, которая сама является связанной с чужеродным антигеном или клеткой. Вследствие главной роли, которую FcR играют в иммунном ответе, необходимыми являются пригодные животные, не относящиеся к человеку, которые ко-экспрессируют множество человеческих FcR, включая животных, не относящихся к человеку, которые ко-экспрессируют множество человеческих низкоаффинных FcR. Существует потребность в нечеловеческих животных моделях функции человеческого FcR и человеческих процессов ADCC для исследования и выяснения терапий заболеваний человека, в особенности противоопухолевых терапий и терапий для лечения аутоиммунных заболеваний, и разработки фармацевтических лекарственных средств, особенно разработки, конструирования и тестирования фармацевтических средств на основе человеческих антител.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой схематическое изображение локуса дикого типа низкоаффинного FcγR у мыши, показывающее мышиные гены FcγRIIB, FcγRIV и FcγRIII и мышиный целенаправляющий вектор FcγR, применяемый для направленной делеции этих генов, который включает неомициновую кассету, фланкированную сайтами сайт-специфической рекомбинации.

Фиг.2 показывает гистограммы спленоцитов, имеющих порог для B-клеток (против-CD19), NK-клеток (против-NKp46) и макрофагов (против-F4/80,) включающих экспрессию генов эндогенных mFcγRII и mFcγRIII для ген-дефицитных мышей (мышей с отсутствием генов) α-цепи дикого типа и низкоаффинного FcγR (mFcγR KO).

Фиг.3A-3D показывают элиминацию in vivo B-клеток с помощью человеческого антитела к человеческому CD20, мышиной Fc (Ab 168) или человеческой Fc (Ab 735) у гуманизированных CD20 мышей (hCD20) и гуманизированных CD20 мышей, скрещенных с мышами, у которых выключен ген FcγR (hCD20/FcγR KO) в некоторых местах расположения лимфоцитов: костном мозге (фиг.3A), крови (фиг.3B), лимфатическом узле (фиг.3C) и селезенке (фиг.3D). Для каждого графика y-ось показывает процентное содержание пороговых B-клеток (B220⁺/IgM⁺ или B220⁺/CD19⁺), и x-ось показывает дозу антитела для каждой группы животных: 10 мг/кг контрольное антитело (C), 2 мг/кг человеческое антитело к человеческому CD20 (2 Ab) и 10 мг/кг человеческого антитела к человеческому CD20 (10 Ab).

Фиг.4 представляет собой схематическое изображение неомицин-целенаправленной делеции локуса низкоаффинного мышиного FcγR и второй целенаправляющий вектор для введения двух генов человеческого низкоаффинного FcγR (hFcγRIIIA и hFcγRIIA) в подвергнутый делеции мышиный локус, который включает гигромициновую кассету, фланкированную сайтами сайт-специфической рекомбинации. Для экспрессии hFcγRIIA на тромбоцитах используют удлиненную промоторную область, функционально связанную с геном hFcγRIIA целенаправляющего вектора человеческого FcγRIIIA-IIA; для предотвращения экспрессии hFcγRIIA на тромбоцитах промоторную область исключают или исключают по существу.

Фиг.5A показывает гистограммы спленоцитов с порогом для NK-клеток (против-NKp46) и макрофагов (против-F4/80), включая экспрессию человеческого FcγRIIIA у мышей дикого типа и человеческого FcγRIIIA-IIA у гомозиготных мышей (человеческие FcγRIIIA/FcγRIIA HO).

Фиг.5B показывает гистограммы спленоцитов с порогом для нейтрофилов (против-Ly6G) и макрофагов (против-F4/80), включая экспрессию человеческого FcγRIIA у мышей дикого типа и человеческого FcγRIIIA-IIA у гомозиготных мышей (человеческие FcγRIIIA/FcγRIIA HO).

Фиг.6 представляет собой схематическое изображение гигромицин-целенаправленной делеции локуса низкоаффинного мышиного FcγR, включающего вставку двух генов низкоаффинного человеческого FcγR (hFcγRIIIA и hFcγRIIA) и третий целенаправляющий вектор для введения трех дополнительных генов низкоаффинного человеческого FcγR (hFcγRIIB, hFcγRIIIB и hFcγRIIC), и неомициновую кассету, фланкированную сайтами сайт-специфической рекомбинации.

Фиг.7 показывает гистограммы спленоцитов с порогом для B-клеток (против-CD19) и нейтрофилов (против-Ly6G), включая экспрессию человеческого FcγRIIB и человеческого FcγRIIIB у мышей дикого типа и человеческого FcγRIIIA-IIIB-IIA-IIB-IIC у гомозиготных мышей (человеческие FcγRIIIA/FcγRIIIB/FcγRIIA/FcγRIIB/FcγRIIC HO).

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предоставлены генетически модифицированные клетки, не относящиеся к человеку эмбрионы, животные, не относящиеся к человеку, и способы и композиции для их получения и применения. В разнообразных аспектах животные, не относящиеся к человеку, содержат человеческий рецептор FcγR, делецию эндогенного низкоаффинного рецептора FcγR и/или замену эндогенного рецептора FcγR на человеческий рецептор FcγR в локусе эндогенного мышиного низкоаффинного FcγR.

В одном аспекте предоставлены генетически модифицированные клетки, не относящиеся к человеку эмбрионы, животные, не относящиеся к человеку, генетически модифицированные клетки, которые содержат функциональную γ-цепь FcR, где клетки, эмбрионы и животные содержат дополнительную модификацию, включающую замену генных последовательностей низкоаффинного эндогенного нечеловеческого FcγR (например, FcγRIIB, FcγRIV и FcγRIII) на одну или более генных последовательностей низкоаффинного человеческого FcγR (например, выбранного из FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB и их комбинации).

В одном варианте осуществления клетки, не относящиеся к человеку эмбрионы, животные, не относящиеся к человеку, являются мышиными. В одном варианте осуществления функциональная γ-цепь FcR представляет собой γ-цепь мышиного FcR. В одном варианте осуществления γ-цепь мышиного FcR представляет собой γ-цепь FcR, эндогенного для мыши, клетки или эмбриона.

В одном варианте осуществления клетки, эмбрионы и животные являются мышиными, и мыши экспрессируют функциональную α-цепь человеческого низкоаффинного рецептора FcγR и функциональную эндогенную мышиную γ-цепь.

В одном аспекте предоставлена генетически модифицированная мышь, где мышь не экспрессирует эндогенную α-цепь, выбранную из α-цепи FcγRIIB, α-цепи FcγRIV, α-цепи FcγRIII и их комбинации; где мышь экспрессирует функциональную эндогенную мышиную γ-цепь.

В конкретном варианте осуществления мышь не экспрессирует функциональную α-цепь FcγRIIB, не экспрессирует функциональную α-цепь FcγRIV и не экспрессирует функциональную α-цепь FcγRIII.

В одном варианте осуществления мышиный геном содержит делецию эндогенной α-цепи FcγRIIB, делецию эндогенной α-цепи FcγRIV и делецию эндогенной α-цепи FcγRIII.

В одном варианте осуществления мышь содержит делецию эндогенной α-цепи FcγRIIB, делецию эндогенной α-цепи FcγRIV и делецию эндогенной α-цепи FcγRIII и дополнительно содержит сниженную способность производить иммунный ответ на антиген по сравнению со способностью мыши дикого типа по отношению к тому же антигену. В одном варианте осуществления сниженный иммунный ответ включает уменьшенную антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC). В одном варианте осуществления сниженный иммунный ответ включает сниженную способность в анализе уничтожения клеток для достижения антителозависимого уничтожения NK-клеток. В конкретных вариантах осуществления снижение ADCC или антителозависимое уничтожение NK-клеток составляет, по меньшей мере, 50%, в одном варианте осуществления, по меньшей мере, 75%, в одном варианте осуществления, по меньшей мере, 90%.

В одном варианте осуществления мышь содержит делецию эндогенной α-цепи FcγRIIB, делецию эндогенной α-цепи FcγRIV и делецию эндогенной α-цепи FCγRIII и дополнительно содержит увеличенный гуморальный иммунный ответ при иммунизации антигеном по сравнению с мышью дикого типа, например, мышью того же или аналогичного штамма, которая не содержит делецию. В одном варианте осуществления увеличенный гуморальный иммунный ответ является 2-кратным по сравнению с мышью дикого типа. В одном варианте осуществления увеличенный гуморальный иммунный ответ является 3-кратным по сравнению с мышью дикого типа. В одном варианте осуществления увеличенный гуморальный иммунный ответ является 5-кратным по сравнению с мышью дикого типа. В одном варианте осуществления увеличенный гуморальный иммунный ответ является 7-кратным по сравнению с мышью дикого типа. В одном варианте осуществления увеличенный гуморальный иммунный ответ является 10-кратным по сравнению с мышью дикого типа. В конкретном варианте осуществления гуморальный иммунный ответ измеряют посредством микрограммов антитела, которое специфически связывает антиген (которым мышь была иммунизирована), на микрограмм белка сыворотки мыши. В одном варианте осуществления увеличенный гуморальный иммунный ответ выражают по отношению к антигену, к которому мышь дикого типа проявляет толерантность, или к антигену, который у мыши дикого типа проявляет слабый или минимальный гуморальный иммунный ответ. В конкретном варианте осуществления антиген является мышиным антигеном. В конкретном варианте осуществления антиген является человеческим антигеном, который проявляет идентичность с мышиным белком равную, по меньшей мере, приблизительно 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

В одном аспекте предоставлена генетически модифицированная мышь, содержащая замену гена α-цепи низкоаффинного мышиного FcγR на ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR, где замена происходит в локусе гена α-цепи эндогенного мышиного FcγR. В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного мышиного FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIB, FcγRIV и FcγRIII. В конкретном варианте осуществления предоставлена генетически модифицированная мышь, где мышь экспрессирует γ-цепь эндогенного FcR, и где ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR представляет собой α-цепь FcγRIIIA. В еще одном конкретном варианте осуществления генетически модифицированная мышь экспрессирует γ-цепь эндогенного FcR и функциональную α-цепь человеческого FcγRIIIA на NK-клетках. В конкретном варианте осуществления функциональность α-цепи FcγRIIIA на NK-клетках отражается на человеческом антителоопосредованным уничтожении NK (например, ADCC, опосредованной человеческим антителом).

В одном аспекте предоставлены генетически модифицированная клетка, не относящийся к человеку эмбрион или животное, не относящееся к человеку, где генетическая модификация включает в себя замену, по меньшей мере, одного гена эндогенной α-цепи низкоаффинного FcγR на ген α-цепи человеческого FcγR, и клетка, эмбрион или животное экспрессирует функциональную γ-цепь FcR. В одном варианте осуществления функциональная γ-цепь FcR является γ-цепью эндогенного FcR. В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIA, гена α-цепи FcγRIIIA и их комбинации. В конкретном варианте осуществления ген человеческого FcγRIIA содержит полиморфизм, где полиморфизм выбирают из 131His низкого респондерного полиморфизма и 131Arg высокого респондерного полиморфизма. В конкретном варианте осуществления полиморфизм FcγRIIA представляет собой 131His низкий респондерный полиморфизм. В одном варианте осуществления ген FcγRIIIA представляет собой конкретный аллельный вариант, где аллельный вариант выбирают из 158Val варианта и 158Phe варианта. В конкретном варианте осуществления аллельный вариант FcγRIIIA представляет собой 158Val вариант.

В одном варианте осуществления ген низкоаффинного человеческого FcγR выбирают из гена FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIB и их комбинации. В конкретном варианте осуществления ген человеческого FcγRIIB содержит аминокислотную замену, где замену выбирают из 232Ile или 232Thr замены. В еще одном конкретном варианте осуществления аминокислотная замена представляет собой замену 232Ile. В конкретном варианте осуществления ген FcγRIIIB представляет собой конкретный аллельный вариант, где аллельный вариант выбирают из NA1 варианта и NA2 варианта. В еще одном конкретном варианте осуществления аллельный вариант FcγRIIIB представляет собой NA2 вариант.

В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB и их комбинации.

В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного мышиного FcγRIV и ген α-цепи FcγRIII заменяют на, по меньшей мере, один ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR. В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного мышиного FcγRIV и ген α-цепи FcγRIIB заменяют на, по меньшей мере, один ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR. В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного мышиного FcγRIIB и ген α-цепи FcγRIII заменяют на, по меньшей мере, один ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR. В конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, один ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB и их комбинации. В еще одном конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, один ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIA, гена α-цепи FcγRIIIA и их комбинации. В еще одном конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, один ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIB и их комбинации. В еще одном конкретном варианте осуществления гены низкоаффинного мышиного FcγR заменяют на ген α-цепи человеческого FcγRIIA и ген α-цепи человеческого FcγRIIIA. В еще одном конкретном варианте осуществления гены α-цепи низкоаффинного человеческого FcγRIIA и FcγRIIIA содержат варианты, где ген α-цепи FcγRIIA содержит 131His вариант и ген α-цепи FcγRIIIA содержит 158Val вариант. В еще одном конкретном варианте осуществления гены α-цепи низкоаффинного мышиного FcγR заменяют на следующие гены α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR: FcγRIIB, FcγRIIC и FcγRIIIB. В еще одном конкретном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγRIIB и ген α-цепи FcγRIIIB содержат варианты, где ген α-цепи FcγRIIB содержит 232Ile вариант и ген α-цепи FcγRIIIB содержит NA2 вариант.

В одном варианте осуществления генетические модификации содержат замену геномных последовательностей группы сцепления мышиной и человеческой хромосомы 1. В конкретном варианте осуществления генетические модификации содержат замену геномного фрагмента, содержащего гены эндогенного низкоаффинного мышиного FcγR, на геномный фрагмент, содержащий гены низкоаффинного человеческого FcγR. В еще одном конкретном варианте осуществления мышиный геном от хромосомы 1:172,889,983 до хромосомы 1:172,989,911 заменяют на человеческий геномный фрагмент, содержащий фрагмент от человеческой хромосомы 1:161,474,729 до хромосомы 1:161,620,458.

В одном аспекте предоставлены генетически модифицированные клетка, не относящийся к человеку эмбрион или животное, не относящееся к человеку, где генетическая модификация содержит нокаут одного или нескольких генов α-цепи эндогенного низкоаффинного рецептора, и присутствие эписомы, содержащей один или более генов α-цепи человеческого FcγR. В конкретном варианте осуществления клетка, эмбрион или животное экспрессируют функциональную γ-цепь FcR. В конкретном варианте осуществления эписома представляет собой минихромосому. В одном варианте осуществления функциональная γ-цепь FcR является эндогенной для клетки, эмбриона или животного.

В одном аспекте предоставлена генетически модифицированная мышь, содержащая замену гена α-цепи низкоаффинного мышиного FcγR на ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR, мышь содержит ген γ-цепи мышиного FcR, и мышь экспрессирует функциональный человеческий низкоаффинный рецептор FcγR. В одном варианте осуществления функциональный низкоаффинный рецептор FcγR экспрессируется на клеточном типе, в котором низкоаффинный рецептор FcγR экспрессируется у людей. В конкретном варианте осуществления функциональный человеческий низкоаффинный рецептор FcγR представляет собой FcγRIIIA, и FcγRIIIA экспрессируется на NK-клетках.

В одном варианте осуществления мышь содержит делецию двух генов α-цепи мышиного FcγR. В еще одном варианте осуществления мышь содержит делецию трех генов α-цепи мышиного FcγR.

В одном варианте осуществления мышь включает в себя замену трех генов α-цепи мышиного FcγR на, по меньшей мере, один ген α-цепи человеческого FcγR. В еще одном варианте осуществления мышь включает в себя замену двух генов α-цепи мышиного FcγR на, по меньшей мере, один ген α-цепи человеческого FcγR. В конкретном варианте осуществления мышь включает в себя замену трех генов α-цепи мышиного FcγR на, по меньшей мере, два гена α-цепи человеческого FcγR. В еще одном конкретном варианте осуществления три гена α-цепи мышиного FcγR заменяют на три гена α-цепи человеческого FcγR. В еще одном конкретном варианте осуществления мышь включает в себя замену двух генов α-цепи мышиного FcγR на, по меньшей мере, два гена α-цепи человеческого FcγR. В еще одном другом конкретном варианте осуществления два гена α-цепи мышиного FcγR заменяют на, по меньшей мере, три гена α-цепи человеческого FcγR.

В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного мышиного FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIB, FcγRIV, FcγRIII и их комбинации.

В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB и их комбинации. В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIA, FcγRIIIA и их комбинации. В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного человеческого FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIB и их комбинации.

В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного мышиного FcγRIV и ген α-цепи FcγRIII заменяют на, по меньшей мере, один ген α-цепи человеческого FcγR. В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного мышиного FcγRIV и ген α-цепи FcγRIIB заменяют на, по меньшей мере, один ген α-цепи человеческого FcγR. В одном варианте осуществления ген α-цепи низкоаффинного мышиного FcγRIIB и ген α-цепи FcγRIIIB заменяют на, по меньшей мере, один ген α-цепи человеческого FcγR. В конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, один ген α-цепи человеческого FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB и их комбинации. В еще одном конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, один ген α-цепи человеческого FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIA, FcγRIIIA и их комбинации. В еще одном конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, один ген α-цепи человеческого FcγR выбирают из гена α-цепи FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIB и их комбинации. В еще одном конкретном варианте осуществления гены мышиной α-цепи заменяют на следующие гены α-цепи человеческого FcγR: FcγRIIA и FcγRIIIA. В еще одном другом конкретном варианте осуществления гены мышиной α-цепи заменяют на следующие гены α-цепи человеческого FcγR: FcγRIIB, FcγRIIC и FcγRIIIB.

В одном аспекте предоставлена генетически модифицированная мышь, содержащая α-цепь низкоаффинного человеческого FcγR и субъединицу γ-цепи мышиного FcR, где мышь экспрессирует α-цепь человеческого FcγR на клетке, выбранной из нейтрофила, эозинофила, базофила, моноцита, макрофага, тромбоцита, клетки Лангерганса, дендритной клетки, NK-клетки, тучной клетки, В-клетки, T-клетки и их комбинации. В одном варианте осуществления мышь экспрессирует α-цепь человеческого FcγRIIA на клетке, выбранной из нейтрофила, макрофага, эозинофила, тромбоцита, дендритной клетки, клетки Лангерганса и их комбинации. В одном варианте осуществления мышь обладает способностью к фагоцитозу, ADCC и клеточной активации, инициированным или опосредованным через экспрессируемую α-цепь человеческого FcγRIIA. В одном варианте осуществления мышь экспрессирует α-цепь человеческого FcγRIIIA на клетке, выбранной из макрофага, NK-клетки, моноцита, тучной клетки, эозинофила, дендритной клетки, клетки Лангерганса, по меньшей мере, одного типа T-клеток и их комбинации. В одном варианте осуществления мышь обладает способностью к ADCC, опосредованной через α-цепь человеческого FcγRIIIA, экспрессируемой на NK-клетках. В конкретном варианте осуществления мышь проявляет hFcγRIIIA-опосредованную ADCC в ответ на антитело, содержащее человеческий Fc.

В одном варианте осуществления мышь экспрессирует как α-цепь человеческого FcγRIIA, так и α-цепь человеческого FcγRIIIA. В одном варианте осуществления α-цепь человеческого FcγRIIA экспрессируется на тромбоцитах, и α-цепь человеческого FcγRIIIA экспрессируется на NK-клетках. В одном варианте осуществления мышь обладает способностью к ADCC, опосредованной антителом, содержащим человеческое Fc, где опосредованное действие производится через или α-цепь человеческого FcγRIIA, или через α-цепь человеческого FcγRIIIA, экспрессируемые на поверхности антигенпрезентирующих клеток. В одном варианте осуществления α-цепь человеческого FcγRIIA не экспрессируется на тромбоцитах. В конкретном варианте осуществления где α-цепь человеческого FcγRIIA не экспрессируется на тромбоцитах, у мыши отсутствует или по существу отсутствует последовательность человеческого промотора, которая функционально связывается с α-цепью человеческого FcγRIIA в человеческом геноме.

В одном варианте осуществления мышь экспрессирует α-цепь человеческого FcγRIIB на клетке, выбранной из В-клетки, тучной клетки, базофила, макрофага, эозинофила, нейтрофила, дендритной клетки, клетки Лангерганса и их комбинации. В конкретном варианте осуществления мышь экспрессирует α-цепь человеческого FcγRIIB на В-клетке и тучной клетке. В еще одном конкретном варианте осуществления мышь обладает способностью к эндоцитозу иммунных комплексов, опосредованному через экспрессируемую α-цепь человеческого FcγRIIB. В одном варианте осуществления мышь экспрессирует α-цепь человеческого FcγRIIC на клетке, выбранной из нейтрофила, макрофага, эозинофила, тромбоцита, дендритной клетки, клетки Лангерганса и их комбинации. В конкретном варианте осуществления мышь обладает способностью к фагоцитозу, ADCC и клеточной активации, инициируемым через экспрессируемую α-цепь человеческого FcγRIIC.

В одном варианте осуществления мышь экспрессирует α-цепь человеческого FcγRIIIB на нейтрофилах и эозинофилах. В конкретном варианте осуществления мышь обладает способностью к клеточной активации, фагоцитозу, ADCC и дегрануляции, где активация, фагоцитоз, ADCC и дегрануляция опосредованы через экспрессируемую α-цепь человеческого FcγRIIIB.

В одном аспекте предоставлена мышь, которая содержит делецию эндогенных генов FCγRIIB, FcγRIV и FcγRIII и вставку генов человеческого FcγRIIA, FCγRIIB, FCγRIIC, FCγRIIIA и FcγRIIIB, и где мышь содержит ген функциональной γ-цепи мышиного FcR.

В одном варианте осуществления мышь содержит делецию α-цепей, кодируемых эндогенными генами FCγRIIB, FCγRIV и FcγRIII, и вставку генов α-цепей, кодируемых генами человеческого FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA и FcγRIIIB.

В одном варианте осуществления вставка генов α-цепей человеческого FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA и FcγRIIIB происходит в случайное расположение внутри мышиного генома.

В одном варианте осуществления вставка генов α-цепей человеческого FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA и FcγRIIIB происходит в локус α-цепи эндогенного мышиного низкоаффинного FcγR.

В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий FcγRIIIA на NK-клетках и макрофагах. В конкретном варианте осуществления все или по существу все NK-клетки из образца спленоцитов мыши экспрессируют человеческий FcγRIIIA. В конкретном варианте осуществления все или по существу все макрофаги из образца спленоцитов мыши экспрессируют человеческий FcγRIIIA.

В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий FcγR, выбранный из человеческого FcγRIIA, человеческого FcγRIIIA и их комбинации, на клеточном типе, выбранном из нейтрофилов, макрофагов и их комбинации. В конкретном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий FcγRIIA и человеческий FcγRIIIA на всех или по существу всех нейтрофилах и макрофагах образца спленоцитов из мыши.

В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий FcγRIIB и человеческий FcγRIIIB на B-клетках и нейтрофилах из B-клеток из образца спленоцитов мыши с порогом для В-клеток. В конкретном варианте осуществления мышь экспрессирует FcγRIIIB и FcγRIIB на всех или по существу всех B-клетках и нейтрофилах из B-клеток из образца спленоцитов мыши с порогом для В-клеток.

В одном варианте осуществления мышь дополнительно содержит гуманизированный ген CD20. В одном варианте осуществления мышь, которая дополнительно содержит гуманизированный ген CD20 после обработки связывающим белком против-CD20, который содержит Fc, проявляет элиминацию (in vivo) B-клеток. В одном варианте осуществления элиминация происходит в органе или ткани, выбранных из костного мозга, крови, лимфатического узла, селезенки и их комбинации. В одном варианте осуществления Fc представляет собой человеческую Fc. В одном варианте осуществления Fc представляет собой мышиную Fc. В одном варианте осуществления связывающий белок против-CD20 представляет собой антитело против-CD20.

В одном аспекте предоставлена клетка, содержащая генетическую модификацию, как описано здесь. В одном варианте осуществления клетку выбирают из эмбриональной стволовой (ES) клетки, плюрипотентной клетки, индуцированной плюрипотентной клетки и тотипотентной клетки. В одном варианте осуществления клетки выбирают из мышиной клетки и крысиной клетки. В конкретном варианте осуществления клетка представляет собой ES-клетку. В более конкретном варианте осуществления клетка представляет собой мышиную ES-клетку.

В одном аспекте предоставлен эмбрион, не относящийся к человеку, содержащий генетическую модификацию, как описано здесь. В одном варианте осуществления эмбрион, не относящийся к человеку, выбирают из мышиного эмбриона и крысиного эмбриона.

В одном аспекте предоставлен способ определения эффективности действия терапевтического средства. В одном варианте осуществления терапевтическое средство представляет собой антитело (например, моно-, би-, три-, мультиспецифическое), содержащее человеческое Fc. В одном варианте осуществления терапевтическое средство представляет собой человеческое антитело. В одном варианте осуществления эффективность действия представляет собой эффективность действия, терапевтически опосредованного уничтожения клеток (например, ADCC). В конкретном варианте осуществления терапевтическое средство для человека представляет собой гибридный белок, содержащий Fc тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. В одном варианте осуществления терапевтическое средство вводят мыши, как описано здесь, и измеряют уровень терапевтически зависимой ADCC. В одном варианте осуществления мышь используют для оценки активности ADCC терапевтического средства посредством введения терапевтического средства мыши и затем обнаружения (например, in vitro из образца (например, крови), взятого из животного) связывания терапевтического средства с человеческим низкоаффинным FcγR на FcγR-экспрессирующей клетке. В конкретном варианте осуществления антигенпрезентирующие клетки мыши выделяют из мыши и тестируют на предмет способности, в присутствии и в отсутствие терапевтического средства, к опосредованию терапевтически зависимой ADCC.

В одном аспекте предоставлен способ определения того, ассоциирован ли низкоаффинный FcγR с человеческим заболеванием или нарушением, включающий стадию определения признака, ассоциированного с человеческим заболеванием или нарушением у мыши в соответствии с изобретением. В одном варианте осуществления признак представляет собой фенотип, ассоциированный с отсутствием или потерей функции одного или нескольких низкоаффинных FcγR. В конкретном варианте осуществления заболевание или нарушение представляет собой аутоиммунное заболевание или нарушение. В конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание или нарушение выбирают из ревматоидного артрита (RA), системной красной волчанки (SLE), диабета типа I, синдрома Гийена-Барре, склероза, рассеянного склероза, синдрома Гудпасчера, гранулематоза Вегенера и экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE). В конкретном варианте осуществления мышь содержит полиморфизм в низкоаффинном FcγR, и признак выбирают из усиленной способности опосредовать ADCC в сравнении с большинством человеческого населения, которое не несет полиморфизм, и сниженной способности опосредовать ADCC в сравнении с большинством человеческого населения, которое не несет полиморфизм.

В одном аспекте предоставлен способ получения антитела против α-цепи человеческого FcR у мыши, включающий подвергание мыши в соответствии с изобретением воздействию человеческого FcR, как описано здесь. В одном варианте осуществления антитело, которое распознает человеческий FcR, выделяют из мыши. В еще одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует всю вариабельную область антитела или его часть, которая распознает человеческий FcR, идентифицируют и клонируют.

В одном аспекте предоставлен способ определения способности антител против человеческого FcR направлять молекулы на FcR-экспрессирующие клетки для фагоцитоза целевой молекулы, включающий подвергание мыши, как описано здесь, воздействию агента, содержащего антитело против человеческого FcR, и измерение фагоцитоза целевой молекулы.

В одном аспекте предоставлен способ получения антитела у мыши к антигену, который является слабо иммуногенным, у мыши, которая принадлежит к дикому типу по отношению к одному или более FcγR, включающий подвергание мыши, как описано здесь, у которой отсутствует мышиный низкоаффинный FcR, но которая экспрессирует γ-цепь FcγR, воздействию антигена, который является слабо иммуногенным, у мыши, которая принадлежит к дикому типу по отношению к одному или более FcγR, и идентификацию антитела, которое распознает слабо антигенный антиген. В одном варианте осуществления способ включает выделение антитела из мыши. В еще одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует всю вариабельную область антитела или ее часть, идентифицируют и клонируют.

В одном аспекте предоставлен способ получения мыши, способной к получению антител, содержащих человеческие вариабельные области, включающий стадию скрещивания первой мыши, как описано здесь, со второй мышью, которая содержит (a) один или более генных сегментов вариабельной области человеческого иммуноглобулина и один или более генов человеческой константной области или (b) один или более генных сегментов вариабельной области человеческого иммуноглобулина, функционально связанных с геном мышиной константной области, где человеческие генные сегменты заменяют генные сегменты вариабельной области в локусе генного сегмента мышиной вариабельной области.

В одном варианте осуществления вторая мышь (a) содержит трансген, который содержит один или более генных сегментов вариабельной области легкой цепи человеческого иммуноглобулина и ген константной человеческой легкой цепи, и трансген, который содержит один или более генных сегментов вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина и один или более генов константной человеческой тяжелой цепи. В одном варианте осуществления трансген, который содержит один или более генных сегментов вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, содержит два или более генов константной человеческой тяжелой цепи и обладает способностью к переключению класса. В конкретном варианте осуществления мышь содержит инактивированный локус эндогенной легкой цепи и/или инактивированный локус эндогенной тяжелой цепи. В конкретном варианте осуществления мышь содержит делецию локуса эндогенной легкой цепи и/или делецию локуса эндогенной тяжелой цепи.

В одном варианте осуществления вторая мышь (b) содержит генные сегменты человеческой тяжелой и человеческой легкой вариабельной области в тяжелых и легких мышиных локусах, соответственно.

В одном аспекте предоставлен способ отбора противоопухолевого антитела, включающий стадию определения способности антитела опосредовать ADCC, где способность антитела к опосредованию ADCC тестируют посредством определения ADCC, опосредованной клеткой мыши, как описано здесь, и антитело отбирают, если оно опосредует ADCC, с использованием клетки генетически модифицированной мыши, как описано здесь. В конкретном варианте осуществления определяют связывание антитела с клеткой генетически модифицированной мыши и противоопухолевое антитело отбирают по его способности связывать человеческий FcγR на клетке. В конкретном варианте осуществления человеческий FcγR представляет собой низкоаффинный FcγR.

В одном варианте осуществления противоопухолевое антитело идентифицируют по его усиленной способности к опосредованию ADCC через клетку мыши по сравнению со способностью противоопухолевого антитела к опосредованию ADCC через клетку мыши дикого типа. В конкретном варианте осуществления противоопухолевое антитело идентифицируют по его способности к опосредованию ADCC через NK-клетки. В конкретном варианте осуществления NK-клетки экспрессируют человеческий FcγRIIIA.

В одном варианте осуществления предоставлен способ отбора противоопухолевого агента, включающий стадию введения агента, содержащего человеческую Fc или модифицированную человеческую Fc, первому не относящемуся к человеку животному, где первое животное, не относящееся к человеку, является генетически модифицированным в соответствии с изобретением и содержит человеческую опухоль; стадию введения агента второму не относящемуся к человеку животному, содержащему опухоль; и определение способности первого не относящегося к человеку животного и второго не относящегося к человеку животного замедлять рост человеческой опухоли после введения агента, где агент отбирают в качестве противоопухолевого агента, если он проявляет усиленную способность замедлять рост человеческой опухоли у первого не относящегося к человеку животного, но не у второго не относящегося к человеку животного.

В одном варианте осуществления первое животное, не относящееся к человеку, модифицируют, чтобы оно содержало делецию эндогенной α-субъединицы FcR, и модифицируют, чтобы оно содержало α-субъединицу человеческого FcR, выбранную из группы, состоящей из α-субъединицы FcγRIIA, α-субъединицы FcγRIIB, α-субъединицы FcγRIIC, α-субъединицы FcγRIIIA, α-субъединицы FcγRIIIB и их комбинации. В одном варианте осуществления второе животное представляет собой животное дикого типа. В одном варианте осуществления первое животное, не относящееся к человеку, экспрессирует эндогенную γ-цепь FcR.

В одном варианте осуществления первое животное, не относящееся к человеку, экспрессирует функциональный эндогенный FcγRI.

В одном аспекте предоставлен способ получения мыши, у которой отсутствует низкоаффинный мышиный FcγR, которая экспрессирует функциональную γ-цепь FcR и содержит гены, кодирующие α-цепи человеческих FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA и FcγRIIIB, включающий стадию замены α-цепей низкоаффинного мышиного FcγR на α-цепи челове