Гуманизированные антитела против tnfα

Гуманизированные антитела против tnfα

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка претендует на приоритет по отношению к заявке на патент Китая № CN 201110048505.1, поданной 28 февраля 2011; к заявке на патент Китая № CN 201210026698.5, поданной 7 февраля 2012; и к международной заявке на патент № PCT/CN2012/071079, поданной 13 февраля 2012. Полное содержание каждой из идентифицированных выше заявок включено в настоящее описание посредством ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится по меньшей мере к гуманизированному антителу против фактора некроза опухоли-α (TNFα) или к его фрагментам, включая его специфичные участки или варианты, и к нуклеиновой кислоте, кодирующей гуманизированное антитело против TNFα, и комплементарной ей нуклеиновой кислоте, к векторам, клеткам-хозяевам и к способу их получения, а также к композициям и наборам, содержащим гуманизированное антитело против TNFα, и к их применению.

Предшествующий уровень техники

Фактор некроза опухоли-α (TNFα) человека является провоспалительным цитокином, продуцируемым моноцитами и макрофагами, который исходно продуцируется в виде белка-предшественника, имеющего молекулярную массу 26 кДа, N-конец которого находится внутри клеток, а C-конец находится вне клеток, названного TNFα трансмембранного типа. Авторы Pennica et al. впервые клонировали кДНК гена TNFα в 1984 и вывели, что молекула TNFα человека состоит из 157 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 17 кДа (Pennica D. et al. Nature 1984; 312:724). TNF человека имеет две молекулярные формы, TNFα и TNFβ. TNFα продуцируется активированными макрофагами или моноцитами и вызывает геморрагический некроз опухолевых тканей, следовательно, его также называют кахектином. TNFβ секретируется, в основном, активными T лимфоцитами. Оба фактора обладают сходным механизмом развития гипертермии. TNFα действует на рецепторы на поверхности онкоцитов и разрушается в лизосоме посредством идентификации клетки, связывающей и поглощающей его посредством эндоцитоза, и, таким образом, активирует лизосомы и протеазы, вызывая гибель клетки. TNFα играет важную роль в иммунном ответе, воспалении и ответе на повреждение, значительно влияет на регуляцию пролиферации клеток и клеточного апоптоза. Кроме воздействий на опухолевую клетку, таких как цитотоксичность, цитолиз, индукция апоптоза и подавление пролиферации клеток, TNFα может также способствовать дифференциации клеток миелоидного лейкоза до макрофагов и улучшать фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов.

Соответствующее количество TNFα может активировать иммунную систему, в результате чего усиливается иммунный ответ организма, и играет важную роль в защитной системе сопротивления хозяина инвазии микроорганизмами и ингибирования опухоли. Но при гиперэкспрессии TNFα может вызывать некоторые патологические повреждения другими воспалительными факторами. Таким образом, действия TNFα могут быть подавлены или нейтрализованы на различных уровнях, чтобы блокировать доступность для него соответствующих рецепторов, избегая, в свою очередь, последствий преобразования сигнала.

В целях преодоления релевантных проблем, вызванных применением нечеловеческих антител, относительно эффективной стратегией лечения является конструирование химерного антитела человека и мыши, чтобы уменьшить иммуногенность организма, вызванную НАМА (человеческим антимышиным антителом). Такой вид химерного антитела получают путем включения вариабельной области нечеловеческого антитела в константную область человеческого антитела, сохраняя при этом аминокислотные последовательности исходных вариабельных областей тяжелой и легкой цепей нечеловеческого антитела (см. Daddona, P.E et al. PCT publication WO 92/16553, Le, J. et al., патент US №5919452, Kang, Heui H et al. PCT publication WO 2005/047329, Jin Boquan et al., публикация патента Китая № CN 1544466A). Авторами Jin Yihui et al. в заявке на патент Китая № CN 101177453 предложено химерное антитело, которое может связываться с фактором некроза опухоли человека. По сравнению с нечеловеческим антителом иммуногенность химерного антитела снижается, тем не менее, оно может вызвать ответ HAMA, который в связи с участком химерного антитела мышиного происхождения все же является в различной степени высоким, в частности, включающий реакцию слизистой оболочки и кожи, аллергическую реакцию, аритмию и стенокардию, почечную недостаточность и в тяжелом случае даже кому. Поэтому клинические применения данного вида химерных антител в высокой степени ограничены.

В клинических испытаниях показано, что данный вид химерных антител в виде гетерогенного белка может вызвать иммунологический ответ отторжения этого гетерогенного белка иммунной системой организма (то есть ответ человеческих антимышиных антител, HAMA) при введении человеку. Этот ответ приводит к быстрому клиренсу и короткому периоду полувыведения мышиного антитела в организме человека. Повторное введение может даже привести в результате к анафилактическому шоку. Кроме того, "чужеродное" антитело может быть атаковано иммунным антителом, поэтому оно может быть нейтрализовано до проявления фармацевтических эффектов.

Авторы изобретения на основе упомянутых выше патентов разработали новый метод получения гуманизированного антитела путем применения генетической технологии с целью сокращения до минимума участка мышиного происхождения в химерном антителе. Этот метод включает встраивание в каркасную область (FR) антитела человека участков, определяющих комплементарность (CDR), вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи мышиного антитела по отдельности. Полученное гуманизированное антитело насколько возможно является сходным по структуре с человеческой последовательностью, в то же время, оно может также сохранять конформацию CDR, подобную родительскому нечеловеческому антителу. По сравнению с родительским нечеловеческим антителом и химерным антителом участок родительской нечеловеческой аминокислотной последовательности в сконструированном гуманизированном антителе уменьшен и, с одной стороны, сохраняется способность антитела к распознаванию антигена; с другой стороны, иммуногенность мышиного антитела значительно снижена. Следовательно, повышена безопасность антитела в клинических применениях.

Следовательно, в настоящем изобретении предложено гуманизированное антитело, которое является более безопасным, имеет более длительный период полувыведения, более значительные эффекты в организме человека по сравнению с мышиным химерным антителом предшествующего уровня техники.

Краткое изложение сущности изобретения

В одном аспекте в настоящем изобретении предложено по меньшей мере одно гуманизированное моноклональное антитело против фактора некроза опухоли или его конкретные участки, определяющие комплементарность, вариабельная область тяжелой цепи или легкой цепи, константная область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасная область или любые другие произвольные участки. Антитело по настоящему изобретению может быть получено от любых млекопитающих, например, включающих, но не ограниченных ими, человека, мышь, крысу, грызуна, примата или любую их комбинацию.

Антитело по настоящему изобретению специфично связывается по меньшей мере с одним эпитопом белков TNF, их субъединицей, фрагментом, участком или любой их комбинацией. По меньшей мере один эпитоп может включать по меньшей мере одну область связывания антитела. По меньшей мере один эпитоп может необязательно включать по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность (CDR) (например, вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи), и/или по меньшей мере одну константную или вариабельную каркасную область (FR) или любой произвольный участок. Аминокислотная последовательность по меньшей мере одного антитела может дополнительно необязательно включать вставку, делецию или консервативную замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложена по меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты, включающая полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одно гуманизированное антитело против фактора некроза опухоли по настоящему изобретению, либо комплементарная или гибридизующаяся с полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одно гуманизированное антитело против фактора некроза опухоли по настоящему изобретению, причем это антитело включает по меньшей мере одну его специфичную последовательность, домен, участок или вариант.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гуманизированное антитело против фактора некроза опухоли, клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту и/или рекомбинантный вектор, и способ получения и/или применения нуклеиновой кислоты, вектора и/или клетки-хозяина.

По меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению обладает по меньшей мере одной активностью, например, но не ограниченной ими, активностью, нейтрализующей токсичность rhTNFα для клетки-мишени L929, подавляющей связывание и/или конкурирующей за связывание TNF с рецептором и/или другим моноклональным антителом, например, но не ограниченным, антителом Хумира.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложено применение антитела и/или композиции по настоящему изобретению при ингибировании активностей hTNFα, где заболевание, обусловленное hTNFα, выбрано из группы, состоящей из пиемии, аутоиммунных заболеваний, злокачественной опухоли, расстройства функции легких, отторжения трансплантата, бактериального менингита, церебральной малярии, СПИД и СПИД-ассоциированного комплекса (ARC, AIDS-related complex), вторичной цитомегаловирусной инфекции после трансплантации.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложено применение при получении лекарственного средства при диагностическом анализе hTNFα, причем гуманизированное антитело против фактора некроза опухоли также может быть меченным молекулой обнаружения и/или может быть немеченым, и метка включает радиоактивный изотоп; флуоресцентную метку; различные виды меток, представляющих собой субстраты ферментов.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложено применение антитела и/или композиции по настоящему изобретению в способе анализа, включающем анализ конкурентного связывания, прямой или непрямой сэндвич-анализ или анализ иммунопреципитации.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложена по меньшей мере одна композиция, содержащая гуманизированное антитело против фактора некроза опухоли и/или его кодирующую аминокислоту, одно или более чем одно вспомогательное вещество, выбранное, но не ограниченное ими, из фармацевтически приемлемого носителя, эксципиента, разбавителя или добавки. Композиция может дополнительно необязательно содержать по меньшей мере одно другое антитело, нуклеиновую кислоту, вспомогательные вещества или любую их комбинацию.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен набор, содержащий предопределенное количество реагентов и инструкцию, где реагенты включают антитело, нуклеиновую кислоту и/или композицию по настоящему изобретению. Набор дополнительно включает другие добавки, например, включающие, но не ограниченные ими, стабилизатор и буфер.

Краткое описание графических материалов

Специалистам в данной области техники может быть понятно, что приведенные ниже графические материалы предназначены в целях иллюстрации настоящего изобретения, которая никоим образом не ограничивает объем настоящего изобретения.

На фиг.1 показана кривая нейтрализации антителом киллинг-эффекта TNFα в отношении клеток U937.

На фиг.2 показаны баллы степени отека сустава крысы, индуцированного коллагеном типа II.

На фиг.3A показан балл артрита мышей Tg197, на фиг.3B показана гистологическая оценка группы обработки мышей Tg197, на фиг.3C показано действие обработки группы на балл артрита (AS) и гистологическую оценку (HS) мышей Tg197.

Подробное описание изобретения

Антитело против фактора некроза опухоли

Антитело по настоящему изобретению включает аминокислотную последовательность антитела, кодируемую любым подходящим полинуклеотидом, либо любое выделенное антитело или препарат антитела. Гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент предпочтительно связывается с фактором некроза опухоли человека и в результате частично, существенно или полностью нейтрализует по меньшей мере одну активность фактора некроза опухоли человека, следовательно, ингибирует процесс преобразования сигнала и физиологический процесс, опосредованный связыванием TNF с рецептором TNF.

Гуманизированное антитело по настоящему изобретению может иметь любой тип (lgG, lgA, lgM, lgE, lgD и т.д.) или изотип и может включать легкие цепи к или λ и тяжелые цепи α, µ, y, ε или δ.

По меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению связывается по меньшей мере с одним эпитопом белка TNF, его субъединицей, фрагментом, участком или любой их комбинацией.

По меньшей мере одно моноклональное антитело против фактора некроза опухоли включает приведенную ниже аминокислотную последовательность, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела показана в виде SEQ ID NO: 1 и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела показана в виде SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 1:

QVQLVQSGPELKKPGASVKISCKASGYTFTHYGMHWVKQTPGRGLKWVGWINTYTGEPTYDADFQGRFTFSLETSVSTAFLQINSLKDEDLATYFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSS

SEQ ID NO: 2:

ENVLTQSPPILSASPGERVTMTCRASSSITFNYLHWYQQKSGDSPKVWIYST SNLVSGVPSRFSGSGSGTSYSLTISSLEAEDAATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIK

где участок, определяющий комплементарность, CDR-H1 вариабельной области тяжелой цепи имеет последовательность SEQ ID NO: 3; CDR-H2 имеет последовательность SEQ ID NO: 4; CDR-H3 имеет последовательность SEQ ID NO: 5; где в пределах каркасной области FR-H1 A может быть заменен E в положении аминокислотного остатка 16, S может быть заменен T в положении 17, I может быть заменен V в положении 20 (например, как показано в SEQ ID NO: 11); в пределах FR-H2 K может быть заменен R в положении 3, G может быть заменен S в положении 9 (например, как показано в SEQ ID NO: 12); в пределах FR-H3 T может быть заменен V в положении 3, E может быть заменен D в положении 7, V может быть заменен T в положении 10, F может быть заменен Y в положении 14, S может быть заменен T в положении 19, T может быть заменен V в положении 27 (например, как показано в SEQ ID NO: 13); и участок, определяющий комплементарность, CDR-L1 имеет последовательность SEQ ID NO: 6; CDR-L2 имеет последовательность SEQ ID NO: 7; CDR-L3 имеет последовательность SEQ ID NO: 8; где в пределах каркасной области FR-L1 L может быть заменен М в положении 11, R может быть заменен E в положении 18, M может быть заменен I в положении 21 (например, как показано в SEQ ID NO: 14); в пределах FR-L2 W может быть заменен L в положении 13 (например, как показано в SEQ ID NO: 15); в пределах FR-L3 S может быть заменен A в положении 4, L может быть заменен V в положении 22, A может быть заменен F в положении 27 (например, как показано в SEQ ID NO: 16).

SEQ ID NO: 3:

HYGMH

SEQ ID NO: 4:

WINTYTGEPTYDADFQG

SEQ ID NO: 5:

YDFDGFDY

SEQ ID NO: 6:

RASSSITFNYLH

SEQ ID NO: 7:

STSNLVS

SEQ ID NO: 8:

QQYSDYPYT

SEQ ID NO: 9:

QVQLVQSGPELKKPG(E/A)(T/S)VK(I/V)SCKASGYTFTHYGMHWV(K/R)QTPGR(S/G)LKVWGWINTYTGEPTYDADFQGRF(T/V)FSL(E/D)TS(T/V)STA(F/Y)LQIN(T/S)LKDEDLA(T/V)YFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSS

SEQ ID NO: 10:

ENVLTQSPPI(M/L)SASPGE(E/R)VT(M/I)TCRASSSITFNYLHWYQQKSGDSPKV(W/L)IYSTSNLVSGVP(A/S)RFSGSGSGTSYSLTISS(V/L)EAED(A/F)ATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO: 11:

QVQLVQSGPELKKPG(E/A)(T/S)VK(I/V)SCKASGYTFT

SEQ ID NO: 12:

WV(K/R)QTPGR(S/G)LKWVG

SEQ ID NO: 13:

RF(T/V)FSL(E/D)TS(T/V)STA(F/Y)LQIN(T/S)LKDEDLA(T/V)YFCAR

SEQ ID NO: 14:

ENVLTQSPPI(M/L)SASPGE(E/R)VT(M/I)TC

SEQ ID NO: 15:

WYQQKSGDSPKV(W/L)IY

SEQ ID NO: 16:

GVP(S/A)RFSGSGSGTSYSLTISS(V/L)EAED(A/F)ATYYC

В воплощении настоящего изобретения последовательность константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела против фактора некроза опухоли представляет собой константную область тяжелой цепи lgG1 человека.

В воплощении настоящего изобретения последовательность константной области легкой цепи гуманизированного антитела против фактора некроза опухоли представляет собой константную область легкой цепи антитела человека.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения аминокислотная последовательность гуманизированного моноклонального антитела против фактора некроза опухоли человека может быть модифицирована путем инсерции, делеции или консервативной замены одного или более чем одного аминокислотного остатка, предпочтительно 1-5 аминокислотных остатков.

Моноклональное антитело, модифицированное или мутированное путем одной или более чем одной инсерции, делеции или консервативной замены в любых комбинированных формах, может иметь отличия в аминокислотной последовательности. В предпочтительном варианте модификацию получают путем консервативной замены аминокислоты вышеуказанного моноклонального антитела по настоящему изобретению. Консервативная замена означает, что определенная аминокислота заменена другой аминокислотой, обладающей подобными свойствами. Консервативно заменяемыми (обладающими подобными свойствами) считают аминокислоты, перечисленные ниже, но не ограниченные ими: a) аланин, серин и треонин; b) глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту; c) аспарагин и глутамин; d) аргинин и лизин; e) изолейцин, лейциловую кислоту, метионин и валин; и f) фенилаланин, тирозин и триптофан.

Функционально эквивалентное моноклональное антитело по настоящему изобретению представляет собой вариант, в котором один или более чем один аминокислотный остаток, предпочтительно 1-5 аминокислотных остатков, консервативно заменен. Консервативная замена включает следующие замены: любая из алифатических аминокислот Ala, Val, Leu и Ile может быть заменена другой; гидроксильные остатки Ser и Thr являются заменяемыми; кислотные остатки Asp и Glu являются заменяемыми; амидные остатки Asn и Gln являются заменяемыми; основные остатки Lys и Arg являются заменяемыми; ароматические остатки Phe и Tyr являются заменяемыми.

Кроме того, в настоящем изобретении описаны аминокислотные последовательности, обладающие по меньшей мере 50% идентичностью аминокислотным последовательностям по настоящему изобретению или их фрагментам и аминокислотным последовательностям с эквивалентными функциями. В одном воплощении аминокислотные последовательности обладают по меньшей мере 75% идентичностью, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью, даже более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью, даже более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью, даже более предпочтительно по меньшей мере 97% идентичностью, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или 2 согласно настоящему изобретению.

В настоящее изобретение включено несколько видов антител. Например, антитело против hTNFα может представлять собой полноразмерное антитело (например, включающее полноразмерную область Fc человека); или фрагмент антитела (например, Fv, scFv, Fab, Fab' и (Fab')₂). Кроме того, антитело может быть меченным обнаружимыми метками, фиксированным на твердофазном носителе и/или связанным с гетерологичными соединениями (такими, как цитотоксические вещества).

Фрагмент Fab получают путем обработки молекулы антитела lgG протеазой/папаином. Этот фрагмент представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу, составляющую приблизительно 50000, и обладающий антигенсвязывающей активностью, причем во фрагменте, полученном путем обработки папаином (расщепляющим H цепь при аминокислотном остатке 224), примерно половина H цепи от N-конца и полноразмерная L цепь связаны вместе дисульфидными связями. Фрагмент Fab по настоящему изобретению также может быть получен путем вставки ДНК, кодирующей Fab антитела, в прокариотические экспрессионные векторы и/или эукариотические экспрессионные векторы.

Фрагмент Fab' представляет собой фрагмент антитела, обладающий антигенсвязывающей активностью, полученный путем расщепления дисульфидных связей в шарнирной области (Fab')₂ и имеющий молекулярную массу, составляющую приблизительно 50000. Фрагмент Fab по настоящему изобретению также может быть получен путем вставки ДНК, кодирующей Fab' антитела, в прокариотические экспрессионные векторы и/или эукариотические экспрессионные векторы и последующего введения этих векторов в прокариоты и/или эукариоты для экспрессии Fab.

Фрагмент (Fab')₂ представляет собой фрагмент антитела, обладающий антигенсвязывающей активностью, имеющий молекулярную массу, составляющую приблизительно 50000, где во фрагменте, полученном путем обработки протеазой/пепсином (расщепляющим H цепь при аминокислотном остатке 234) антитела lgG, фрагмент антитела Fab имеет несколько больший размер за счет связывания вместе дисульфидными связями в шарнирной области. Фрагмент (Fab')₂ по настоящему изобретению может быть получен путем обработки антитела пепсином. Кроме того, фрагмент (Fab')₂ по настоящему изобретению также может быть получен путем сшивания Fab' тиоэфирными связями или дисульфидными связями.

Фрагмент scFv представляет собой фрагмент антитела, обладающий антигенсвязывающей активностью, состоящий из цепи V_H и цепи V_L, которые соединены соответствующими пептидными связями. Фрагмент scFv по настоящему изобретению может быть получен путем получения кДНК, кодирующих V_H и V_L антитела, составления ДНК, кодирующей scFv, вставки ДНК, кодирующей scFv, в прокариотические экспрессионные векторы и/или эукариотические экспрессионные векторы и последующего введения этих векторов в прокариоты и/или эукариоты для экспрессии scFv.

Нуклеиновая кислота

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 1-16, их специфичные фрагменты, варианты или по меньшей мере 70-100% непрерывные аминокислотные последовательности консенсус-последовательностей. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие по меньшей мере одно антитело против TNF, могут быть получены способами, описанными в настоящем изобретении или известными в данной области техники.

Молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут находиться в форме РНК, такой как мРНК, гяРНК (гетерогенная ядерная РНК), тРНК или в любой другой форме, либо в форме ДНК, включающей, но не ограниченной ими, кДНК и геномную ДНК, полученную путем клонирования или полученную синтетическим путем, или любую их комбинацию. ДНК может быть трехнитевой, двунитевой или однонитевой либо представлять собой любую их комбинацию. Любой участок по меньшей мере одной нити ДНК или РНК может представлять собой кодирующую нить, также известную как смысловая нить, или может представлять собой некодирующую нить, также называемую антисмысловой нитью.

Как указано в настоящем описании, молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, включающие нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против TNF, могут включать, но не ограничены ими, следующие молекулы: молекулы, как таковые кодирующие аминокислотную последовательность фрагмента антитела; кодирующие последовательность полноразмерного антитела или его участка; кодирующую последовательность антитела, фрагмента или участка, а также дополнительные последовательности, такие как кодирующая последовательность по меньшей мере одного сигнального лидера слитого пептида, с вышеупомянутыми дополнительными кодирующими последовательностями, такими как по меньшей мере один интрон, или без этих последовательностей, вместе с дополнительными некодирующими последовательностями, включающими, но не ограниченными ими, некодирующие 5' и 3' последовательности, такие как транслируемые, нетранслируемые последовательности, играющие роль в транскрипции, процессинге мРНК, включая сплайсинг и сигналы полиаденилирования (например, связывание рибосомы и стабильность мРНК); дополнительную кодирующую последовательность, которая кодирует дополнительные аминокислоты, например, обеспечивающие дополнительные функции. Таким образом, последовательность, кодирующая антитело, может быть слита с маркерной последовательностью, такой как последовательность, кодирующая пептид, облегчающий очистку слитого антитела, включая фрагмент или участок антитела.

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть получены с использованием следующих способов: (a) рекомбинантных способов, (b) синтетических методов, (c) методов очистки или их комбинации, как хорошо известно в данной области техники.

Композиции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, таких как РНК, кДНК, геномная ДНК или любая их комбинация, могут быть получены из биологических источников с использованием любого многообразия методов клонирования, известных специалистам в данной области техники. В некоторых воплощениях для идентификации нужной последовательности в библиотеке кДНК или геномной ДНК используют олигонуклеотидные зонды, которые селективно гибридизуются в жестких условиях с полинуклеотидами по настоящему изобретению. Выделение РНК и конструирование библиотек кДНК и геномных библиотек хорошо известны специалистам в данной области техники.

Скрининг библиотеки кДНК или геномной библиотеки можно осуществлять, используя зонд, основанный на последовательности полинуклеотида по настоящему изобретению, такого как описано в данной работе. Зонды можно использовать для гибридизации с последовательностями геномной ДНК или кДНК, чтобы выделить гомологичные гены в одном или в различных организмах. Специалистам в данной области техники понятно, что в анализе можно использовать гибридизацию различной степени жесткости; и либо среда для гибридизации, либо среда для отмывки может быть жесткой. Если условия гибридизации становятся более жесткими, между зондом и мишенью должна быть более высокая степень комплементарности, чтобы происходило образование дуплекса. Степень жесткости можно регулировать с помощью одного или более чем одного из следующих параметров: температуры, ионной силы, pH и присутствия частично денатурирующего растворителя, такого как формамид. Жесткость гибридизации, например, удобно варьировать с помощью изменения полярности раствора реагента путем, например, манипуляций с концентрацией формамида в диапазоне от 0% до 50%. Степень комплементарности (идентичности последовательности), необходимая для обнаружимого связывания, варьирует в соответствии с жесткостью среды для гибридизации и/или среды для отмывки. Степень комплементарности оптимально составляет 100%, либо 70-100%, либо любой диапазон или значение в пределах данного диапазона. Тем не менее, понятно, что минорные изменения последовательности в зондах и праймерах можно компенсировать путем снижения жесткости среды для гибридизации и/или среды для отмывки.

Способы амплификации РНК или ДНК хорошо известны в данной области техники и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением без лишнего экспериментирования на основе идеи и руководства, приведенного в настоящей работе.

Изолированные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть также получены путем прямого химического синтеза известными способами. В результате химического синтеза обычно получают однонитевый олигонуклеотид, который можно преобразовать в двунитевую ДНК путем гибридизации с комплементарной последовательностью или путем полимеризации ДНК полимеразой, использующей одну нить в качестве матрицы.

Конструирование экспрессионного вектора гуманизированного моноклонального антитела

5' фрагмент, включающий ген вариабельной области тяжелой цепи (V_H) гуманизированного антитела и 7 аминокислот на 5'-конце константной области тяжелой цепи (C_y1) lgG₁ человека, получают путем использования в качестве матрицы плазмиды (pHu-V_H), содержащей фрагмент гена вариабельной области тяжелой цепи V_H гуманизированного антитела, 5' праймера FVHX (5'-CGCGCAAG-CTTCCTCGAG-3', SEQ ID NO: 17) и 3' праймера RVCG (5'-CGATGGGCCCTTGGTGGA-3', SEQ ID NO: 18). В то же время, ген A, включающий кодирующую последовательность константной области тяжелой цепи (C_y1) lgG₁ человека, получают из РНК, выделенной из лейкоцитов человека, путем обратной транскрипции и ПЦР, используя 5' праймер HuCGF (5'-ACCAAGGGCCCATCGGTCTTC-3', SEQ ID NO: 19) и 3' праймер HUCGE (5'-CGGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGA 3', SEQ ID NO: 20). Наконец, фрагмент, представляющий собой вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела, и ген C_y1 человека сшивают с помощью ПЦР, используя 5' праймер (FVHX, SEQ ID NO: 17) и 3' праймер (HUCGE, SEQ ID NO: 20), с получением фрагмента гена, длина которого составляет приблизительно 1400 п.о., включающего кодирующую последовательность тяжелой цепи. Этот фрагмент гена обрабатывают эндонуклеазой Hind III и EcoR1, а затем встраивают в векторы, такие как PUC19 (ссылка: Yanisch-Perron, С, Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene, 33, 103-119).

5' фрагмент, включающий ген вариабельной области легкой цепи (V_L) и 7 аминокислот на 5'-конце константной области легкой цепи (C_K) человека, получают путем использования в качестве матрицы плазмиды (pHu-V_L), содержащей фрагмент гена вариабельной области легкой цепи V_L гуманизированного антитела, 5' праймера FVHX (SEQ ID NO: 17) и 3' праймера VKCKO (5'-AGA TGG TGC AGO САС AGT TCG CTT GAT CTO CAG CTT GGT GCC-3', SEQ ID NO: 21). В то же время, ген A, включающий кодирующую последовательность константной области легкой цепи к (C_K) человека, получают из РНК, выделенной из лейкоцитов человека, путем обратной транскрипции и ПЦР, используя 5' праймер HuCKF (5'-GTG GCT GCA CCA ТСТ GTC ТТС-3', SEQ ID NO: 22) и 3' праймер HUCKB (5'-TGC GGA ТСС СТА АСА СТС ТСС ССТ GTT GAA-3', SEQ ID NO: 23). Наконец, фрагмент, представляющий собой вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела, и ген C_K человека сшивают с помощью ПЦР, используя 5' праймер (FVHX, SEQ ID NO: 17) и 3' праймер (HUCKB, SEQ ID NO: 23), с получением фрагмента гена, длина которого составляет приблизительно 700 п.о., включающего кодирующую последовательность легкой цепи. Этот фрагмент гена обрабатывают эндонуклеазой Hind III и Bam H1, а затем встраивают в векторы, такие как PUC19 (ссылка: Yanisch-Perron, С, Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene, 33, 103-119).

кДНК, кодирующую тяжелую цепь или легкую цепь, или кДНК, кодирующую продукты их модификации, полученные вышеуказанными способами, встраивают в вектор pcDNA3 (Invitrogen USA, Carlsbad, CA, U.S.A.) для конструирования экспрессионного вектора гуманизированного антитела Hu_анти-TNFα. Экспрессионная векторная плазмида содержит промотор-энхансер раннего гена цитомегаловируса, необходимый для высокого уровня экспрессии в клетках млекопитающих. В то же время, векторная плазмида также содержит необязательный маркерный ген, чтобы обладать устойчивостью к ампициллину в бактериях и обладать устойчивостью к G418 в клетках млекопитающих. Кроме того, векторная плазмида содержит ген DHFR. В большинстве клеток-хозяев ген антитела и ген DHFR можно совместно амплифицировать метотрексатом (МТХ, Sigma) (см., например, Axel, R., et al. Патент US 5179017; Kaufman. R. and Sharp. P., J. Mol. Biol. 159:601-621, 1982).

Клетка-хозяин, экспрессирующая антитело

Настоящее изобретение также относится к получению по меньшей мере одного антитела против TNF путем использования клетки-хозяина, сконструированной генно-инженерным способом с помощью рекомбинантного вектора, и рекомбинантного метода в данной области техники.

Полинуклеотиды могут быть необязательно сшиты с вектором, включающим возможные метки для амплификации в клетке-хозяине. Как правило, плазмидный вектор вводят в преципитат, такой как кальцийфосфатный преципитат, либо вводят в комплекс, содержащий заряженный липид.

Подходящие культуральные среды и условия для описанных выше клеток-хозяев известны в данной области техники. Подходящие векторы будут легко очевидными для специалистов в данной области техники. Введение векторной конструкции в клетку-хозяина может быть выполнено с помощью кальцийфосфатной трансфекции, трансфекции, опосредованной ДЭАЭ-декстраном, трансфекции, опосредованной катионным липидом, электропорации, трансдукции, инфекции или других известных способов.

Клетки-хозяева для гуманизированного моноклонального антитела против фактора некроза опухоли по настоящему изобретению, имеющие происхождение от клеток яичника китайского хомячка, получают путем трансфекции плазмидой, содержащей кодирующую последовательность гена анти-TNFα, после чего следует серия жестких специфичных скринингов, включающая скрининг лекарственным препаратом, амплификацию гена и клонирование отдельных клеток с получением конечной линии клеток. Клетка-хозяин по настоящему изобретению, представляющая собой клетку яичника китайского хомячка линии CHO HUAT 132, была депонирована в CCTCC 7 марта 2011 под депозитным номером C201117.

Клетку этой линии клеток можно размножать в суспензии в среде без сыворотки; при культивировании в 2 л ферментере уровень секретируемого антитела против TNFα в среде будет составлять не ниже 1 г/л по окончании цикла культивирования, составляющего 16-20 суток. Антитело против TNFα, продуцируемое этими клеточными линиями, представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.

Активность связывания с TNFα

Гуманизированное моноклональное антитело против фактора некроза опухоли по настоящему изобретению обладает только специфичным сродством к рекомбинантному фактору некроза опухоли человека (молекулам-мишеням rhTNFα), но не связывается перекрестно с молекулами какого-либо другого белка. В конкурентном анализе сродства к его молекулам-мишеням определено, что моноклональное антитело против фактора некроза опухоли по настоящему изобретению обладает аналогичным сродством с антителом Хумира.

Гуманизированное моноклональное антитело против фактора некроза опухоли по настоящему изобретению также обладает активностью нейтрализации токсичности rhTNFα для клетки-мишени L929, и ее значение EC50 является сходным со значением для антитела Хумира, составляющим от 20,4 нг/мл до 50 нг/мл.

Терапевтическое применение

Антитело к hTNFα можно применять для лечения и/или предупреждения заболеваний, обусловленных hTNFα, где заболевание, обусловленное hTNFα, может представлять собой, например, пиемию, аутоиммунные заболевания, злокачественную опухоль, расстройство функции легких, отторжение трансплантата, бактериальный менингит, церебральную малярию, СПИД и СПИД-ассоциированный комплекс (ARC, AIDS-related complex), вторичную цитомегаловирусную инфекцию после трансплантации. Применение антитела и компонентов антитела по настоящему изобретению при лечении заболеваний, обусловленных hTNFα, дополнительно обсуждается ниже.

1) Сепсис

Роль фактора некроза опухоли в патологии сепсиса и его биологические эффекты включают гипотензию, угнетение миокарда, синдром транссудации сосудов, некроз органов (см., например, патент US 5231024). Следовательно, гуманизированные антитела по настоящему изобретению и компоненты антител можно применять для лечения любого сепсиса с клиническим фоном, включающего септический шок, эндотоксический шок, грамотрицательный сепсис и синдром токсического шока.

2) Аутоиммунные заболевания

Обнаружено, что фактор некроза опухоли играет роль в патофизиологии ряда аутоиммунных заболеваний, например обнаружено, что TNFα вовлечен в активацию воспаления ткани и приводит к разрушению суставов при ревматоидном артрите (см., например, патент US 5231024; Moeller, A. et al. (1990) Cytokine 2:162-169). Также обнаружено, что TNFα вовлечен в клеточную гибель клеток островков Лангерганса при диабете, а также опосредует цитотоксичность в отношении олигодендроцитов и индуцирует образование воспалительных бляшек.

Гуманизированные антитела и компоненты антител по настоящему изобретению можно применять для лечения аутоиммунных заболеваний, в частности, ассоциированных с воспалением, включающих ревматоидный артрит, ревматоидный миелит, остеоартрит и подагрический артрит, аллергию, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет, аутоиммунный глазной увеит и нефротический синдром.

3) Злокачественные опухоли

Обнаружено, что фактор некроза опухоли, находящийся в злокачественных опухолях, вовлечен в индукцию кахексии, стимуляцию роста опухоли, повышение метастатического потенциала и посредничество цитотоксичности. Следовательно, антитела и компоненты антител по настоящему изобретению можно применять для лечения злокачественных опухолей, ингибирования роста и метастазов опухоли и/или уменьшения злокачественной вторичной кахексии. Антитело или компонент антитела можно вводить системно или местно в сайт опухоли.

4) Расстройства функции легких

Известно, что фактор нек