Анти-icos антитела и их применение в лечении онкологических, связанных с трансплантацией и аутоиммунных заболеваний

Анти-icos антитела и их применение в лечении онкологических, связанных с трансплантацией и аутоиммунных заболеваний

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Введение

Настоящее изобретение относится к анти-ICOS антителам с повышенной эффекторной функцией. Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией, которая может опосредовать один или несколько из следующих признаков: комплементзависимую клеточно опосредованную цитотоксичность (КЗЦ), антигензависимую клеточно опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ) и антителозависимый фагоцитоз (опсонизацию). Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим анти-ICOS антитела изотипа IgG1 и/или IgG3 человека, а также к композициям, включающим анти-ICOS антитела изотипа IgG2 и/или IgG4 человека, которые могут опосредовать АЗКЦ, КЗЦ и/или антителозависимый фагоцитоз.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения и предупреждения опосредованных Т-клетками заболеваний и расстройств. Например, хронических инфекций, аутоиммунных заболеваний и расстройств, воспалительных заболеваний или расстройств, болезни трансплантат-против-хозяина (БТПХ), отторжения трансплантата и пролиферативного расстройства Т-клеток, но не только их, используя терапевтические анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией, в которых используют терапевтические анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией.

Предпосылки создания изобретения

ICOS является трансмембранным белком I типа, включающим внеклеточный (Ig)V-подобный домен. ICOS служит рецептором для ко-стимулирующей молекулы B7h. Экспрессия ICOS происходит на низком уровне в не подвергнутых какому-либо воздействию Т-клетках, но регуляция экспрессии повышается в течение нескольких часов после контакта с Т-клеточным рецептором. Экспрессия ICOS сохраняется в субпопуляциях активированных Т-клеток, например, клеток Th1, Th2, и Th17 CD4⁺.

Поскольку экспрессия ICOS концентрируется в популяциях активированных клеток Т-хелперов, терапевтическое применение анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией способствует улучшению эффективности лечения и предупреждения опосредованных Т-клетками заболеваний и расстройств, например, хронических инфекций, аутоиммунных заболеваний и расстройств, воспалительных заболеваний или расстройств, болезни трансплантат-против-хозяина (БТПХ), отторжения трансплантата и пролиферативного расстройства Т-клеток, но не только их, используя терапевтические анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение также относится к анти-ICOS антителам с повышенной эффекторной функцией, которые связываются с молекулой ICOS человека, а также к композициям, включающим эти антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают JMab-136 анти-ICOS антитела (см. US 6803039), которые могут опосредовать эффекторную функцию антитела более эффективно, чем исходное антитело JMab-136. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти- ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело настоящего изобретения включает гликозилирование, отличное от гликозилирования исходного антитела.

Настоящее изобретение также предусматривают фармацевтические композиции, включающие анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения или предупреждения опосредованных Т-клетками заболеваний и расстройств, например, хронических инфекций, аутоиммунных заболеваний и расстройств, воспалительных заболеваний или расстройств, болезни трансплантат-против-хозяина (БТПХ), отторжения трансплантата и пролиферативного расстройства Т-клеток, используя терапевтические анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией.

Определения

В контексте настоящего изобретения понятия «антитело» и «антитела» (иммуноглобулины) охватывают моноклональные антитела (включая моноклональные антитела полной длины), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), формируемые по меньшей мере из двух интактных антител, антитела человека, гуманизированные антитела, камелизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, антитела с одним доменом, доменные антитела, фрагменты Fab, фрагменты F(ab')₂, фрагменты антител, которые проявляют желаемую биологическую активность, область Fv с дисульфидными связями (sdFv) и анти-идиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id антитела к антителам по настоящему изобретению), внутриклеточные антитела и эпитоп-связывающие фрагменты каких-либо из указанных выше антител. В частности, к антителам относятся молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулина, т.е. молекулы, содержащие сайт связывания антигена. Молекулы иммуноглобулина могут быть какого-либо типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.

Нативные антитела обычно являются гетеротетрамерными гликопротеинами массой примерно 150000 Дн, состоящими из двух идентичных легких цепей (light - L) и двух идентичных тяжелых цепей (heavy - Н). Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, хотя число дисульфидных связей варьирует у тяжелых цепей разных иммуноглобулиновых изотипов. Каждая тяжелая и легкая цепь также содержит регулярно расположенные дисульфидные мостики между цепями. Каждая тяжелая цепь с одного конца содержит вариабельный домен (VH) за которым, следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен с одного конца (VL) и константный домен с другого конца; константный домен легкой цепи выравнивают с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выравнивают с вариабельным доменом тяжелой цепи. Легкие цепи классифицируют в качестве лямбда и каппа цепей, основываясь на аминокислотной последовательности константной области легкой цепи. Вариабельный домен легкой цепи каппа также может обозначаться в настоящем изобретении «VK». Понятие «вариабельная область» также может применяться для описания вариабельного домена тяжелой цепи и легкой цепи. Полагают, что определенные аминокислотные остатки формируют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей. Такие антитела могут быть получены из организмов каких-либо млекопитающих, например, людей, обезьян, свиней, лошадей, кроликов, собак, кошек, мышей, а также из других видов млекопитающих.

Понятие «вариабельный» применимо с учетом того обстоятельства, что определенные части вариабельных доменов существенно отличаются по последовательности от других частей антител и ответственны за специфичность связывания каждого конкретного антитела с его соответствующим антигеном. Однако вариабельность распределена неравномерно по вариабельным доменам антител. Она сосредоточена в сегментах, называемых комплементарно детерминируемыми областями (Complementarity Determining Regions - CDR) вариабельных доменов и в легкой цепи, и в тяжелой цепи. Более высоко консервативные части вариабельных доменов называются каркасными участками (framework regions - FW). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелой и легкой цепей включают четыре участка FW, в значительной степени адаптируя β-складчатую конфигурацию, соединенную тремя областями CDR, которые формируют петли, соединяющие и, в некоторых случаях, формирующие часть β-складчатой структуры. В каждой цепи CDR локализованы вместе в тесной близости к участкам FW и с областями CDR из другой цепи, тем самым, участвуя в формировании сайта связывания антигена у антител (см. кн.: Kabat и др. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5-е изд., Национальный институт здоровья, общественное здравоохранение, Бетесда, Мэриленд). Константные домены обычно не участвуют непосредственно в связывании антигена, но могут влиять на связывающее сродство с антигеном и могут проявлять различные эффекторные функции, например, участие антитела в АЗКЦ, КЗЦ, антитело-зависимом фагоцитозе и/или апоптозе.

Понятие «гипервариабельная область» в контексте настоящего изобретения относится к остаткам аминокислот в антителе, которые ассоциированы со связыванием с антигеном. Гипервариабельные области охватывают аминокислотные остатки «комплементарно детерминируемых областей» или «CDR» (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) вариабельного домена легкой цепи и остатки 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) вариабельного домена тяжелой цепи, кн.: Kabat и др. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5-е изд., Национальный институт здоровья, общественное здравоохранение, Bethesda, MD) и/или указанные остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи, Chothia и Lesk, J. Mol. Biol., 196, 1987, cc.901-917). Остатками «каркасного участка» или «FW» являются остатки вариабельного домена, фланкирующие области CDR. Остатки FW содержатся в химерных, гуманизированных, человеческих, доменных антителах, двойных антителах, антителах vaccibodies, линейных антителах и биспецифических антителах.

В контексте настоящего изобретения понятие «область Fc» включает полипептиды, содержащие константную область антитела, исключающую первый домен константной области иммуноглобулина. Таким образом, Fc относится к двум последним доменам константной области иммуноглобулинов IgA, IgD и IgG, и трем последним доменам константной области иммуноглобулинов IgE и IgM, и гибкому шарнирному N-концу к этим доменам. Область Fc в IgA и IgM может включать цепь J. У иммуноглобулина IgG область Fc включает домены иммуноглобулина Сгамма2 и Сгамма3 (Сγ2 и Сγ3) и шарнирную область между Сгамма1 (Сγ1) и Сгамма2 (Сγ2). Хотя границы области Fc могут варьировать, область Fc тяжелой цепи IgG человека обычно определяют по включению остатков С226 или Р230 с С-концов, причем нумерация соответствует индексу EU по Kabat и др. (1991, NIH Publication 91-3242, Служба национальной технической информации, Спрингфилд, Виржиния). Понятие «индекс EU, установленный по Kabat» относится к нумерации EU остатков IgG1 антитела человека по описанию в работе Kabat и др., приведенной выше. Fc может относиться отдельно к определенной области, или этой области в составе антитела, фрагмента антитела или гибридного белка Fc. Вариант белка Fc может быть антителом, Fc гибридом или каким-либо белком или белковым доменом, включающим область Fc. Особенно предпочтительными являются белки, включающие варианты области Fc, которые являются неприродными вариантами области Fc. Аминокислотная последовательность неприродной области Fc (также обозначаемой в настоящем изобретении «вариантом области Fc») включает замещение, инсерцию и/или делецию, по меньшей мере одного аминокислотного остатка по сравнению с аминокислотной последовательностью дикого типа. Какой-либо новый аминокислотный остаток, появляющийся в последовательности варианта области Fc в результате инсерции или замещения, может рассматриваться в качестве неприродного аминокислотного остатка. Примечание: полиморфизмы были установлены в ряде положений в Fc, включая, но ими не ограничиваясь, положения 270, 272, 312, 315, 356 и 358 по Kabat, и поэтому небольшие отличия между представленной последовательностью и последовательностями в предшествующем уровне техники могут существовать.

Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, полученному из популяции в существенной степени гомогенных антител, т.е. индивидуальных антител, составляющих популяцию, являются идентичными за исключением возможных естественно встречающихся мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направленными против единственного антигенного участка. Кроме того, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на антигене. Дополнительно к их специфичности моноклональные антитела полезны тем, что их можно синтезировать гибридомными клетками без примесей иных клеток, вырабатывающих иммуноглобулин. Другие способы получения известны специалистам в данной области, например, моноклональное антитело может быть получено клетками, которые временно или постоянно трансфецированы генами тяжелых или легких цепей, кодирующими моноклональное антитело.

Понятие модифицирующее «моноклональное» указывает на характер антитела, получаемого из популяции антител, которая в существенной степени гомогенна, и не следует считать, что антитела получают каким-то особым способом. Понятие «моноклональное» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, которое формируется в популяции клеток клона, в том числе эукариотического, прокариотического или фагового клона, но не к способу, с помощью которого указанное антитело конструируют. Например, моноклональные антитела, применяемые по настоящему изобретению, можно получить на основе гибридомной технологии, впервые описанной Kohler и др., Nature, 256, 1975, cc.495, или их можно получить посредством методов рекомбинантных ДНК (см., например, US 4816567), включая, например, выделение из библиотек фаговых антител методами, описанными Clackson и др., Nature, 352, 1991, cc.624-628, и Marks и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, cc.581-597. Эти методы могут применяться для получения моноклональных антител млекопитающих, химерных антител, гуманизированных антител, антител человека, доменных антител, двухвалентных антител, антител vaccibodies, линейных антител и биспецифических антител.

«Антитело человека» может быть антителом, полученным от человека, или антителом, полученным из трансгенного организма, который был «сконструирован» для выработки специфических антител человека в ответ на введение антигена, и который может быть получен каким-либо методом, известным в данной области. В некоторых методах элементы локусов тяжелой и легкой цепей человека внедряют в штаммы организма, полученные из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат целевые разрывы эндогенных локусов тяжелой и легкой цепей. Трансгенный организм может синтезировать антитела человека, специфичные в отношении антигенов человека, и такой организм может применяться для получения гибридом, секретирующих антитела человека. Антитело человека также может быть антителом, в котором тяжелая и легкая цепи кодируются нуклеотидной последовательностью, полученной из одного или нескольких источников ДНК человека. Антитело, являющееся полностью антителом человека, может быть получено также при конструировании методами генетической или хромосомальной трансфекции, а также методом фагового дисплея или активированной in vitro экспрессии ICOS Т-клетками, известными в данной области.

Понятие «антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЗКЦ)» относится к опосредуемой клетками реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки (например, природные клетки-киллеры (NK - natural killer), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такие клетки являются клетками человека. Не стремясь ограничиться каким-либо определенным механизмом действия, следует отметить, что такие цитотоксические клетки, которые опосредуют АЗКЦ, обычно экспрессируют рецепторы Fc (FcR). Основные клетки для опосредования АЗКЦ, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, а моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII, FcγRIII и/или FcγRIV. Экспрессия FcR в гемопоэтических клетках представлена в обобщенном виде Ravetch и Kinet в Annu. Rev. Immunol., 9, 1991, cc.457-492. Для оценки АЗКЦ-активности молекулы можно провести АЗКЦ-анализ in vitro, например, описанный в патентах US 5500362 или 5821337. Соответствующие эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). В другом варианте или дополнительно АЗКЦ-активность интересующей молекулы можно оценить in vivo, например, в экспериментальной модели на животных, например, описанной Clynes и др. в PNAS (США), 95, 1998, cc.652-656.

«Комплемент-зависимая цитотоксичность (КЗЦ») относится к способности молекулы инициировать активацию комплемента и лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента начинается со связывания первого компонента комплементарной системы (C1q) с молекулой (например, антителом), образующей комплекс с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента можно провести КЗЦ-анализ, например, по описанию Gazzano-Santoro и др. в J. Immunol. Методы, 202, 1996, с.163.

Понятие «антителозависимый фагоцитоз» или «опсонизация» в контексте настоящего изобретения относится к опосредуемой клетками реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы FcγR, распознают связанное антитело на клетке-мишени и в результате вызывают фагоцитоз клеток-мишеней.

«Эффекторными клетками» являются лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и проявляют эффекторные функции. Клетки экспрессируют, по меньшей мере FcγRI, FCγRII, FcγRIII и/или FcγRIV и проявляют АЗКЦ эффекторную функцию. К примерам лейкоцитов человека, которые опосредуют АЗКЦ, относятся мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы.

Понятия «Fc рецептор» или «FcR» используют для описания рецептора, который связывается с областью Fc антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения FcR является естественной последовательностью FcR человека. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рецептор FcR является тем рецептором, который связывает IgG антитело (гамма рецептор) и представляет рецепторы FcγRI, FcγRII, FcγRIII и FcγRIV подклассов, включая аллельные варианты и иным образом сплайсированные формы указанных рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, отличающиеся в основном по их цитоплазматическим доменам. Активирующий FcγRIIA-рецептор в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторный активаторный мотив, основанный на тирозине (ITAM - immunoreceptor tyrosine-based activation motif). Ингибирующий FcγRIIB-рецептор в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторный ингибиторный мотив, основанный на тирозине (ITIM - immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif). (См. обзор М. Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15, 1997, cc.203-234). Обзор по FcR представлен Ravetch и Kiner в Annu. Rev. Immunol., 9, 1991, cc.457-492, Capel и др., Immunomethods, 4, 1994, cc.25-34 и de Haas и др., J. Lab. Clin. Med., 126, 1995, cc.330-341. Понятием «FcR» объединяют в настоящем описании и другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем. Это понятие также включает неонатальный рецептор FcRn, который ответственен за передачу материнских IgG плоду (Guyer и др., J. Immunol., 117, 1976, с.587, Kim и др., Eur. J. Immunol., 24, 1994, с.249).

Понятие «сродства» антитела с эпитопом по отношению к эпитопу, применяемому в лечении (лечениях) и описанному в настоящем изобретении, является термином, хорошо известным в данной области, и означает протяженность или прочность связывания антитела с эпитопом. Сродство может быть измерено и/или выражено разными способами, известными в данной области, включая, но, не ограничиваясь ими, константу равновесной диссоциации (KD или Kd), очевидную константу равновесной диссоциации (KD' или Kd') и IC50 (количество, требуемое для 50% подавления в конкурентном анализе). Очевидно, что для целей настоящего изобретения сродство означает среднее сродство для данной популяции антител, связывающихся с эпитопом. Величина KD' в настоящем изобретении выражена в мг IgG на мл (или мг/мл) и означает количество Ig, выраженное в мг/мл сыворотки, хотя также может быть в мг/мл плазмы. Если сродство с антителом используют в качестве основы для применения способов лечения, описанных в настоящем изобретении, или выбора способов лечения, описанных в настоящем изобретении, сродство с антителом может быть измерено до и/или во время лечения, и полученные значения могут быть использованы врачом при оценке, является ли больной человек соответствующим кандидатом для применения указанного лечения.

В контексте настоящего изобретения понятие «авидность антител» означает измерение общей связывающей силы (т.е., обеих частей антитела), с которой антитело связывается с антигеном. Авидность антител может быть измерена по определению диссоциации связи антигена-антитела при избытке антигена, используя какие-либо средства, известные в данной области, например, модификацию непрямой флуоресценции антитела, описанную Gray и др., J. Virol. Meth., 44, 1993, cc.11-24, а также другие методы.

Понятие «эпитоп» широко применяется в данной области и означает какую-либо часть молекулы, которая проявляет специфическое связывание с антителом. Понятие «антиген» означает часть молекулы или молекулу, которая содержит эпитоп и, таким образом, также специфически связывается с антителом.

Понятие «период полураспада антитела» в контексте настоящего изобретения означает фармакокинетическое свойство антитела, которое является показателем среднего времени сохранения молекул антитела после их введения. Период полураспада антитела может быть выражен в виде периода, необходимого для элиминации 50% известного количества иммуноглобулина из организма человека или его специфического компартмента, например, измеренного в сыворотке или плазме, т.е., период полураспада циркулирующего антитела, или в других тканях. Полураспад может варьировать в зависимости от вида и класса иммуноглобулина. Обычно повышение периода полураспада антитела приводит к повышению среднего времени удержания в организме (СВУ) при циркуляции введенного антитела.

Понятие «изотип» относится к классификации константной области тяжелой и легкой цепей антитела. Константные домены антител не участвуют в связывании с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи данное антитело человека или иммуноглобулин может быть отнесено к одному из пяти крупных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из этих классов могут быть дополнительно поделены на подклассы (изотипы), например, IgG1 (гамма 1), IgG2 (гамма 2), IgG3 (гамма 3) и IgG4 (гамма 4), а также IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и µ, соответственно. Структуры и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Известно, что из разных классов иммуноглобулинов человека только IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgM человека активируют комплемент. Известно, что IgG1 и IgG3 человека опосредуют АЗКЦ у людей. Константные области легкой цепи человека могут быть классифицированы на два крупных класса - каппа и лямбда.

В контексте настоящего изобретения понятие «иммуногенность» означает, что соединение способно возбуждать иммунный ответ (стимулируя выработку специфических антител и/или пролиферацию специфических Т-клеток).

В контексте настоящего изобретения понятие «антигенность» означает, что соединение распознается антителом или может связываться с антителом и индуцировать иммунный ответ.

Понятия «лечить» или «лечение» (или их грамматические эквиваленты) подразумевают, что тяжесть состояния субъекта снижается или по меньшей мере частично улучшается или облегчается, и/или что достигается некоторое облегчение, смягчение или снижение, по меньшей мере одного клинического признака, и/или подавление или отсрочка прогрессирования состояния, и/или предупреждение или отсрочка начала заболевания или болезненного состояния. Таким образом, понятия «лечить» или «лечение» (или их грамматические эквиваленты) относятся и к профилактическим, и к терапевтическим режимам лечения.

В контексте настоящего изобретения понятия «достаточное количество» или «количество, достаточное для» достижения определенных результатов, относится к количеству антитела или композиции по настоящему изобретению, которое достаточно для получения желаемого результата, который является необязательно терапевтическим эффектом (т.е. путем введения терапевтически эффективного количества). Например, понятия «достаточное количество» или «количество, достаточное для» может относиться к количеству, которое эффективно для истощения Т-клеток, экспрессирующих белок ICOS.

Понятие «терапевтически эффективное количество» в контексте настоящего изобретения означает количество, которое предусматривает некоторое улучшение состояние субъекта или приносит пользу субъекта. Иначе говоря, «терапевтически эффективное» количество является количеством, которое предусматривает некоторое смягчение, уменьшение и/или снижение, по меньшей мере одного клинического симптома. Клинические симптомы, связанные с расстройствами, могут быть вылечены способами настоящего изобретения, хорошо известными специалистам в данной области. Кроме того, специалисты в данной области могут оценить, что терапевтические эффекты не обязательно должны быть полными или целебными, до тех пор, пока некоторая польза проявляется в отношении субъекта.

Краткое описание фигур

Фиг.1. Аминокислотная последовательность доменов VH (А) и VL (Б) JMab-136 анти-ICOS антитела. Остатки CDR, определенные по Kabat, помещены в рамки и выделены жирным шрифтом. Потенциальные сайты O-гликозилирования (Т или S остатки) и сайты деамидирования (DS или DG остатки) отмечены серым цветом.

Фиг.2. Повышенное связывающее сродство IC9G1-aFuc с FcgRIIIa человека и макаки крабоеда. Связывающее сродство (нМ) IC9G1-aFuc с рекомбинантными FcγR человека и макаки крабоеда измеряют, сравнивая с контрольными антителами (IC009 и IC9G1), и суммируют на настоящей фигуре.

Фиг.3. IC9G1-aFuc ингибирует CD3/ICOSL индуцированную пролиферацию Т-клеток человека. Т-клетки человека инкубируют в течение 72 ч в планшете, покрытом B7h-Fc (50 мкл при концентрации 4 мкг/мл) и анти-CD3 антителом (50 мкл при концентрации 0,2 мкг/мл) в присутствии повышенных количеств IC9G1-aFuc антитела. Показана пролиферация Т-клеток в качестве функции концентрации IC9G1-aFuc антитела. Данные, полученные из контрольных экспериментов, используя антитела IC009 и IC9G1, также показаны.

Фиг.4. IC9G1-aFuc не ингибирует пролиферацию Т-клеток миндалин человека, опосредованную анти-CD3/анти-CD28 антителом. Выделенные Т-клетки миндалин человека инкубируют в течение 72 ч в планшете с покрытием из анти-CD3 и/или анти-CD28 антител. Показывают клеточную пролиферацию, выявляемую в присутствии 10 мкг/мл IC9G1.

Фиг.5. Активность АЗКЦ антитела IC9G1-aFuc выше активности антител IC9G1 или IC009. Активность АЗКЦ измеряют, используя стабильно трансфецированные клетки (A) HPB-ALL клетки (HPB-ALL h-ICOS) и (Б) Jurkat клетки (Jurkat h-ICOS), экспрессирующие ICOS человека, в качестве клеток-мишеней. Величина активности ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 на клетки HPB-ALL h-ICOS составляет 138 пМ и 648 пМ, соответственно. Активность ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 на трансгенные клетки Jurkat h-ICOS составляет 5,7 пМ и 61 пМ, соответственно.

Фиг.6. Экспрессия ICOS в миндалинах человека ограничивается CD4+ T_FH клетками памяти. Показывают анти-ICOS-окрашенный вариант CD4+CD45RO-CXCR5- исходных Т-клеток и CD4+CD45RO+CXCR5+ T_FH клеток памяти.

Фиг.7. АЗКЦ действие антитела IC9G1-aFuc выше соответствующего действия антител IC9G1 или IC009. АЗКЦ действие измеряют, используя выделенные Т-клетки миндалин человека в качестве клеток-мишеней. Величина ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 составляет 8,2 пМ и 60,4 пМ, соответственно, в данном исследовании.

Фиг.8. Антитело IC9G1-aFuc опосредует действие АЗКЦ на свежевыделенные Т-клетки-мишени селезенки макаки крабоеда. (А) Профиль экспрессии ICOS выделенных CD4+CD45RA+ исходных Т-клеток и CD4+CD45RA- Т-клеток памяти селезенки макаки крабоеда определяют, используя жидкостную цитометрию. Показано по точкам окрашивание методом жидкостной цитометрии. Уровень экспрессии ICOS CD4+CD45RA- Т-клеток памяти существенно выше по сравнению с CD4+CD45RA+ исходными Т-клетками. (Б) Показаны кривые цитотоксичности АЗКЦ антител IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc, измеренные по выделенным Т-клеткам селезенки макаки крабоеда. Действие АЗКЦ антитела IC9G1-aFuc выше, чем у антител IC009 или IC9G1. В настоящем исследовании величина ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 составляет 14,6 пМ и 236 пМ, соответственно.

Фиг.9. Антитело IC9G1-aFuc опосредует действие АЗКЦ в отношении свежевыделенных Т-клеток-мишеней из брыжеечного лимфоузла (mesenteric lymph node - БЛУ) макаки крабоеда. (А) Профиль экспрессии ICOS в выделенных из макаки крабоеда БЛУ CD4+CD45RA+неподвергнутых какому-либо воздействию Т-клеток определяют с помощью жидкостной цитометрии. Показаны результаты жидкостной цитометрии окрашенных клеток. Уровень экспрессии ICOS в CD4+CD45RA-активированных Т-клетках существенно выше, чем в CD4+CD45RA+ неподвергнутых какому-либо воздействию Т-клетках. (Б) Показаны кривые АЗКЦ цитотоксичности антител IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc, измеренные с применением выделенных из макаки крабоеда БЛУ Т-клеток. Действие АЗКЦ антитела IC9G1-aFuc выше по сравнению с соответствующим показателем антител IC009 или IC9G1. Величина ЕС50 действия антител IC9G1-aFuc и IC9G1 в данном исследовании составляет 17,1 пМ и 198 пМ, соответственно.

Фиг.10. Фармакокинетический профиль IC9G1-aFuc у макак крабоедов. Одна доза 0,1 мг/кг, 1 мг/кг или 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc вводится внутривенно макакам крабоедам. Концентрацию антитела IC9G1-aFuc измеряют в течение 4 недель после введения. Показана концентрация в сыворотке IC9G1-aFuc в виде функции времени.

Фиг.11. Одна внутривенная доза IC9G1-aFuc существенно истощает уровень CD3+CD4+CD45RA_ICOS+ Т-клеток памяти in vivo у макак крабоедов. Одну дозу 0,01 мг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг или 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc вводят внутривенно макакам крабоедам. Уровень CD3+CD4+CD45RA-ICOS+ Т-клеток памяти подвергают мониторингу. Уровни нормализованных Т-клеток памяти показаны в виде функции времени после введения IC9G1-aFuc. Введение одной дозы 0,1 мг/кг, 1 мг/кг или 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc приводит практически к полной элиминации CD3+CD4+CD45RA_ICOS+ Т-клеток памяти на 4 сутки. Выделение ICOS+ Т-клеток памяти является доза-зависимым.

Фиг.12. Описание по данным жидкостной цитометрии В-клеток зародышевого центра. В-клетки зародышевого центра макаки крабоеда идентифицируют в виде или CD3-CD20+IgM-CD95+ клеток, или CD3-CD20+IgM-CD27+ клеток.

Фиг.13. Одна внутривенная доза антитела IC9G1-aFuc существенно снижает уровень ICOS+ Т-хэлперных клеток памяти брыжеечного лимоузла (БЛУ) и В-клеток зародышевого центра БЛУ in vivo у макак крабоедов. Одну дозу 0,1 мг/кг или 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc вводят внутривенно макакам крабоедам. Контрольных животных лечат дозой 10 мг/кг IC009 или ФСБ. Проводили мониторинг уровней ICOS+ Т-хэлперных клеток памяти брыжеечного лимоузла (БЛУ) и В-клеток зародышевого центра БЛУ. Идентифицируют Т-хэлперные клетки памяти БЛУ в качестве CD3+CD4+CD45RA-ICOS+ клеток. В-клетки зародышевого центра БЛУ идентифицируют в качестве CD20+CD95+IgM- клеток. (А) Показано общее число БЛУ Т-клеток и БЛУ В-клеток зародышевого центра на 8 сутки после лечения. (Б) Показан процент истощения ICOS+ Т-клеток и процент разрушения В-клеток зародышевого центра на 8 сутки после лечения. Введение антитела IC9G1-aFuc приводит к доза-зависимому истощению ICOS+ Т-хэлперных клеток памяти и В-клеток зародышевого центра из брыжеечного лимфоузла (БЛУ).

Фиг.14. Одна внутривенная доза антитела IC9G1-aFuc существенно снижает уровень ICOS+ Т-хэлперных клеток памяти селезенки и В-клеток зародышевого центра у макак крабоедов in vivo. Одну дозу 0,1 мг/кг или 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc вводят внутривенно макакам крабоедам. Контрольных животных лечат 10 мг/кг IC009 или ФСБ. Проводят мониторинг уровня ICOS+ Т-клеток памяти и В-клеток зародышевого центра селезенки на протяжении исследования. Идентифицируют Т-хэлперные клетки памяти селезенки в качестве CD3+CD4+CD45RA-ICOS+ клеток, В-клетки зародышевого центра в качестве CD3-CD20+CD95+IgM- клеток. (А) Показаны общее число Т-хэлперных клеток памяти селезенки и В-клеток зародышевого центра на 8 и 30 сутки после лечения. (Б) Показаны проценты истощения Т-клеток и распад В-клеток зародышевого центра на 8 и 29 сутки после лечения. Введение IC9G1-aFuc приводит к существенному истощению Т-хэлперных клеток памяти и В-клеток зародышевого центра из селезенки. Уровни истощения существенно выше у животных, получающих антитело IC9G1-aFuc, по сравнению с контрольными животными, получающими антитело IC009. Максимальное истощение Т-клеток достигается на 8 сутки после введения IC9G1-aFuc. Максимальный уровень истощения В-клеток зародышевого центра наблюдают на 29 сутки после введения IC9G1-aFuc.

Фиг.15. Зародышевые центры селезенки атрофируются на 29 сутки после введения одной дозы антитела IC9G1-aFuc макакам крабоедам. Морфологию белой пульпы селезенки исследуют после введения одной дозы антитела IC9G1-aFuc. Показывают гистологические срезы селезенки, выделенной на 8 сутки (А) и 29 сутки (Б) после введения антитела IC9G1-aFuc. Введение IC9G1-aFuc приводит к тяжелой атрофии фолликул селезенки на 29 сутки.

Фиг.16. Выравнивание длинной и короткой изоформ аминокислотной последовательности ICOS человека (SEQ ID NO:32 и 33, соответственно).

Фиг.17. Комплементарность нуклеотидной последовательности иРНК ICOS (SEQ ID NO:34) и выбранных микромолекул РНК.

Фиг.18. Уровень относительной экспрессии miR-101 в образцах мышц больных спонгиоформным миозитом с включениями (СМВ), полимиозитом (ПМ) и дерматомиозитом (ДМ) по сравнению со здоровыми нормальными контролями по данным измерений методом TaqMan КРВ-ПЦР.

Фиг.19. Относительные уровни иРНК (A) ICOS и ICOS-L, (Б) CD4 и (В) CD3ε в образцах мышечной ткани больных спонгиоформным миозитом с включениями (СМВ), полимиозитом (ПМ) и дерматомиозитом (ДМ) по сравнению со здоровыми нормальными контролями по данным измерений методом Affymetrix выстраивания целого генома. (Г) Уровни экспрессии ICOS и ICOS-L иРНК в образцах цельной крови, выделенных из больных спонгиоформным миозитом с включениями (СМВ), полимиозитом (ПМ) и дерматомиозитом (ДМ) по сравнению со здоровыми нормальными контролями по данным измерений методом TaqMan количественной реального времени ПЦР.

Фиг.20. Относительные уровни экспрессии иРНК (А) ICOS и ICOSL, (Б) CD4 и (В) CD3ε в очагах кожных повреждений больных СКВ, сравниваемые с нормальными контролями, по результатам ПЦР реального времени TaqMan.

Фиг.21. Относительные уровни экспрессии иРНК (A) CD28, CTLA4, ICOS, ICOS-L, (Б) CD4 и (В) CD3ε в цельной крови больных СКВ, сравниваемые с нормальными контролями, по результатам ПЦР реального времени TaqMan.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам выработки анти-ICOS антител с повышенной эффекторной функцией. С помощью способов настоящего изобретения исходное анти-ICOS антитело модифицируют для получения анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией, например, повышенной АЗКЦ, повышенной КЗЦ и повышенным антителозависимым фагоцитозом, а также с другими функциями. Какое-либо анти-ICOS антитело, которое специфически связывается с антигеном ICOS человека, может служить в качестве исходного антитела для осуществления на практике способа настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела, описанные в US 6803039, действуют в качестве исходного антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения JMAb-136 (IgG2) анти-ICOS антитело действует в качестве исходного антитела.

Настоящее изобретение предусматривает анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует антителозависимую эффекторную функцию более эффективно по сравнению с исходным анти-ICOS антителом. В одном из специфических вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует антителозависимую эффекторную функцию более эффективно, чем JMAb-136 (см. US 6803039).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, описанное в настоящем изобретении, опосредует антителозависимую эффекторную функцию более эффективно, чем исходное анти-ICOS антитело, причем указанную эффекторную функцию выбирают из группы, состоящей из антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ), комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ), антителозависимого фагоцитоза. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело настоящего изобретения опосредует антителозависимую клеточно-опосред