Самоиндуцируемая экспрессионная система и ее применение для получения полезных метаболитов с помощью бактерии семейства enterobacteriaceae

Самоиндуцируемая экспрессионная система и ее применение для получения полезных метаболитов с помощью бактерии семейства enterobacteriaceae

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности и, в частности, к способу получения полезных метаболитов ферментацией бактерии семейства Enterobacteriaceae, отличающийся тем, что генетическая экспрессионная система бактерии, регулируемая белком типа LysR, модифицирована таким способом, что функциональность указанной экспрессионной системы опосредована коиндуктором, и, как результат, повышен уровень экспрессии гена, регулируемого указанной системой экспрессии. Более точно, экспрессионная система и способ могут быть полезны для повышения продукции метаболитов биосинтетического пути L-аминокислот, таких как L-аминокислот с разветвленной цепью (разветвленных L-аминокислот).

Уровень техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленности получают методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано много способов повышения продукции L-аминокислот, включающие, например, трансформацию микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, Патент США №4,278,765) и изменение регуляторных участков, таких как промотор, лидерная последовательность и/или аттенюаторы или другие, известные для специалиста данной области (см., например, Патентную заявку США №20060216796 A1 и WO 9615246 A1). Другие способы, повышающие выход, включают повышение активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или снятие ингибирования ключевых ферментов продуцируемой L-аминокислотой по типу обратной связи (см., например, публикацию Патента Японии №56-18596 (1981), WO 95/16042 или Патенты США №5,661,012 и 6,040,160). Например, мутантная бактериальная ацетогидроксикислотасинтетаза I (также называемая как ацетолактатсинтаза I, в дальнейшем AHAS I), которая обладает устойчивостью к ингибированию по типу обратной связи L-валином, использовалась для увеличения выхода разветвленной L-аминокислоты в соответствующих штаммах, продуцирующих L-аминокислоту (Патент РФ №2355763).

Биосинтез разветвленных L-аминокислот (branched-chain L-amino acids, BCAAs), таких как L-валин, L-лейцин и L-изолейцин осуществляется в разветвленном биосинтетическом пути. Ацетолактатсинтаза (классификационный номер фермента (ЕС) 2.2.1.6) катализирует реакцию на первом этапе биосинтетического пути, который является общим для всех трех аминокислот. Реакция включает конденсацию активированного ацетальдегида (2-(α-гидроксиэтил)тиаминдифосфата), производного пирувата, с пируватом или 2-оксобутаноатом с образованием 2-ацетолактата (AΛ) или 2-ацето-2-гидроксибутаноата (АГБ), соответственно. AΛ является предшественником L-валина и L-лейцина, а АГБ - L-изолейцина. В Escherichia coli (далее E.coli), например, реакции между молекулами пирувата, а также между пируватом и 2-оксобутаноатом катализируются изоферментами AHAS, такими как AHAS I, AHAS II и AHAS III, кодируемыми генами ilvBN, ilvGM и ilvIH, соответственно. AHAS I и AHAS III ингибируются конечным продуктом (механизм называется как ингибирование по типу обратной связи или ретройнгибирование) - L-валином. Ингибирование по типу обратной связи целевым продуктом играет важную роль в физиологическом контроле биосинтетических путей в бактериях.

Продукты реакции, катализируемой AHAS, AΛ или АГБ, являются субстратами для 2-ацетогидроксикислотаизомероредуктазы IlvC (EC 1.1.1.86), кодируемой геном ilvC, принадлежащим к оперону ilvYC. Оперон ilvYC из E.coli является составной частью экспрессионной системы, регулируемой белком типа LysR, которая представляет собой наиболее широко распространенную положительно регулируемую экспрессионную систему бактерий и может быть найдена в бактериальных семействах прокариот от Enterobacteriaceae до Rhizobiaceae (Rhee K.Y. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1999, 96:14294-14299). Ген ilvY кодирует регуляторный белок IlvY типа LysR (транскрипционный регулятор), который связывается высококооперативным способом с двумя тандемными операторными участками в области ilvYC с разнонаправлено перекрывающимися промоторами (Фигура 1). При связывании с первым операторным участком регулятор IlvY отрицательно саморегулирует транскрипцию с промотора ilvY, ослабляя, таким образом, собственный синтез. Кроме этого, IlvY играет основную роль в активации транскрипции гена ilvC. Активация транскрипции ilvC требует связывания регулятора IlvY со вторым операторным участком и последующее связывание коиндуктора, такого как 2-ацетолактат (AΛ) или 2-ацето-2-гидроксибутаноат (АГБ) с ранее образованным комплексом IlvY/ДНК. При связывании коиндуктора происходит конформационное изменение в комплексе белок/ДНК, что вызывает изменение структуры промотора ilvC в области -35 и значительно повышает силу связывания PHK-полимеразы (Rhee K.Y. et al., J. Biol. Chem., 1998, 273:11257-11266).

В биосинтезе L-валина и L-лейцина 2-ацетолактат (AΛ) превращается под действием белка IlvC в 2,3-дигидрокси-3-метилбутаноат (другое название 2,3-дигидроксиизовалериат, ДГИВ) (Фигура 2). В биосинтезе L-изолейцина 2-ацето-2-гидроксибутаноат (АГБ) превращается под действием белка IlvC в 2,3-дигидрокси-3-метилпентаноат (другое название 2,3-дигидрокси-3-метилвалериат, ДГМВ).

Недавно самоиндуцируемые генетические системы экспрессии стали очень привлекательны для усиления экспрессии желаемого гена по сравнению с обычными генетическими подходами. Например, из литературы известна искусственно созданная система экспрессии генов, регулируемая по типу положительной обратной связи, которая может функционировать как усилитель генетического сигнала, что способствует повышению чувствительности к белку-индуктору, а также увеличению уровня экспрессии в отсутствии внешнего кофактора - ацилгомосеринлактона (АГΛ, также называемого как гомосеринлактон - ГСΛ) (Nistala G.J. et al., J. Biol. Eng., 2010, 4:4). Разработанная система использует постоянно активный вариант белка LuxR [lux оперон), регулятора кворум-сенсинга (КС) из Vibrio fischeri, который независим от самоиндуктора (АГΛ) ввиду точечной мутации Ala221Val (Sayut D.J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2007, 363:667-673; Poellinger K.A. et al., FEMS Microbiol Lett., 1995, 129:97-101). Генетическая система экспрессии, похожая за исключением небольших изменений на приведенную, была использована для изменения кинетических параметров экспрессии модельного мембранного белка цитохром bd хинолоксидазы в E.coli (Bansal К. et al., J. Biol. Eng., 2010, 4:6).

Самоиндуцируемая регулируемая по типу положительной обратной связи система активации, основанная на аппарате кворум-сенсинга из V. fischery (lux-биолюминесцентные гены) и использующая внутриклеточный пул самоиндуктора (ГСΛ), применялась для экспрессии рекомбинантных белков, таких как антигены для приготовления фармацевтических композиций (WO 2010136897 A2).

Однако, в настоящее время нет данных, описывающих генетическую экспрессионную систему, регулируемую белком типа LysR, модифицированную таким образом, что функциональность указанной экспрессионной системы опосредована коиндуктором; и применение данной системы для получения полезных метаболитов пути биосинтеза L-аминокислот, таких как разветвленные L-аминокислоты, и/или его побочного пути.

Раскрытие сущности изобретения

Цель настоящего изобретения - предоставление генетической экспрессионной системы, включающей элементы транскрипционного аппарата, регулируемого белком типа LysR, модифицированной таким образом, что регуляция указанной системы, функционирующей по принципу самоиндукции с положительной обратной связью, опосредована коиндуктором.

Другая цель настоящего исследования - предоставление бактерии семейства Enterobacteriaceae, которая может принадлежать к роду Escherichia и, более точно, к виду Escherichia coli, которая модифицирована так, чтобы содержать указанную экспрессионную систему.

Другая цель настоящего изобретения - предоставление способа получения полезных метаболитов, например, L-аминокислот, таких как L-аминоки слоты с разветвленной цепью, или их солей, в частности, L-валина, L-лейцина и L-изолейцина или их солей. Эта цель была достигнута благодаря обнаружению того факта, что модификация генов, колирующих мутантную ацетолактатсинтазу, устойчивую к ингибированию по типу обратной связи L-валином, таким образом, что экспрессия этих генов регулируется транскрипционным аппаратом, регулируемым белком типа LysR и экспрессия которого опосредована коиндуктором, получаемым реакцией с участием ацетолактатсинтазы, приводит к увеличению продукции разветвленных L-аминокислот.

Цель настоящего изобретения - предоставление генетической экспрессионной системы, включающей транскрипционный аппарат, регулируемый белком типа LysR, который включает промотор и оператор, экспрессия которых положительно регулируется регуляторным белком типа LysR и коиндуктором, и целевой(ые) ген(ы), с которым(и) транскрипционный аппарат функционально связан, причем целевой (ые) ген(ы) кодирует(ют) белок(и), вовлеченный (е) в биосинтез коиндуктора, субстрата или предшественника коиндуктора, и самоиндуцируемая положительная регуляция по типу обратной связи такой экспрессионной системы опосредована коиндуктором.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что указанная система из бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae или Pseudomonadaceae.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что указанная система из бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что указанная система из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что бактерия принадлежит к виду Escherichia coli.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что указанная система из биосинтетического пути L-аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из разветвленных L-аминокислот, L-лизина, L-цистеина, L-метионина и L-триптофана.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что указанная система из биосинтетического пути L-аминокислот с разветвленной цепью.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что промотор есть промотор P_ilvC, регуляторный белок типа LysR есть белок IlvY, и коиндуктор есть 2-ацетомолочная кислота, 2-ацето-2-гидроксимаслянная кислота или их соли.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что коиндуктор есть 2-ацетомолочная кислота или ее соль.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что целевой(ые) ген(ы) кодирует(ют) ацетогидроксикислотасинтетазу.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что указанные целевые гены кодируют белки, выбранные из группы, состоящей из:

(A) комбинации из п.п.A1 и A2:

(A1) белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, которая содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, и обладающего активностью ацетолактатсинтазы с белком A2; и

(A2) белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, или белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, которая содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, и обладающего активностью ацетолактатсинтазы с белком A1;

(B) комбинации из п.п.B1 и B2:

(B1) белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, которая содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, и обладающего активностью ацетолактатсинтазы с белком B2; и

(B2) белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, которая содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, и обладающего активностью ацетолактатсинтазы с белком B1; и

(C) комбинации из п.п.C1 и C2:

(C1) белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, или белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, которая содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, и обладающего активностью ацетолактатсинтазы с белком C2; и

(C2) белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, или белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, которая содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, и обладающего активностью ацетолактатсинтазы с белком C1.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что ацетогидроксикислотасинтетаза является мутантной ацетолактатсинтазой I, устойчивой к ингибированию по типу обратной связи L-валином.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что оператор включает участок, с которым связывается вышеописанный регуляторный белок типа LysR.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что регуляторный белок типа LysR выбран из группы, состоящей из:

(D) белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и

(E) варианта белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, которая содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, и имеющего активность регуляторного белка типа LysR.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной экспрессионной системы, отличающейся тем, что промотор включает:

(F) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 30; или

(G) вариант ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 30, которая содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких нуклеотидных остатков, и имеющий активность нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 30.

Также цель настоящего изобретения - предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae, отличающейся тем, что бактерия модифицирована таким образом, что она содержит экспрессионную систему как описано выше.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной бактерии, отличающейся тем, что бактерия содержит ген, кодирующий регуляторный белок типа LysR.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной бактерии, отличающейся тем, что бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной бактерии, отличающейся тем, что бактерия принадлежит к виду Escherichia coli.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной бактерии, отличающейся тем, что L-аминокислота есть L-аминокислота с разветвленной цепью.

Также цель настоящего изобретения - предоставление вышеописанной бактерии, отличающейся тем, что L-аминокислота с разветвленной цепью выбрана из группы, состоящей из L-валина, L-лейцина и L-изолейцина.

Цель настоящего изобретения - предоставление способа получения L-аминокислоты с разветвленной цепью, включающего:

(i) выращивание вышеописанной бактерии в питательной среде, так что указанная L-аминокислота с разветвленной цепью накапливается в культуральной жидкости; и

(ii) выделение L-аминокислоты с разветвленной цепью из культуральной жидкости.

Также цель настоящего изобретения - предоставление способа получения вышеописанной L-аминокислоты с разветвленной цепью, отличающийся тем, что указанная L-аминоки слота с разветвленной цепью выбрана из группы, состоящей из L-валина, L-лейцина и L-изолейцина.

Краткое описание фигур

Фигура 1 показывает схему регуляции транскрипции генов ilvY и ilvC. IlvY означает транскрипционный регулятор типа LysR, AΛ или АГБ - коиндуктор 2-ацетолактат или 2-ацето-2-гидроксибутаноат, O1 и O2 - операторы 1 и 2, TS_ilvC - старт транскрипции гена ilvC, TS_ilvY - старт транскрипции гена ilvY, знаки минус (-) и плюс (+) - отрицательное и положительное влияние на транскрипцию гена, соответственно.

Фигура 2 показывает схему биосинтеза L-валина из пирувата. AΛ означает 2-ацетолактат, ДГИВ - 2,3-дигидроксиизовалериат, AHAS -ацетолактатсинтазу, IlvC - изомероредуктазу

Описание последовательностей

SEQ ID NO: I - нуклеотидная последовательность гена ilvB.

SEQ ID NO: 2 - аминокислотная последовательность большой субъединицы ацетолактатсинтазы I дикого типа.

SEQ ID NO; 3 - нуклеотидная последовательность гена ilvN.

SEQ ID NO: 4 - аминокислотная последовательность малой субъединицы ацетолактатсинтазы I дикого типа.

SEQ ID NO: 5 - нуклеотидная последовательность гена ilvI.

SEQ ID NO: 6 - аминокислотная последовательность большой субъединицы ацетолактатсинтазы III дикого типа.

SEQ ID NO: 7 - нуклеотидная последовательность гена ilvH.

SEQ ID NO: 8 - аминокислотная последовательность малой субъединицы ацетолактатсинтазы III дикого типа.

SEQ ID NO: 9 - нуклеотидная последовательность гена ilvY.

SEQ ID NO: 10 - аминокислотная последовательность белка IlvY.

SEQ ID NOs: 11-29 - нуклеотидные последовательности праймеров P1-P19.

SEQ ID NO: 30 - нуклеотидная последовательность промотора PilvC.

SEQ ID NO: 31 - нуклеотидная последовательность гена ilvG.

SEQ ID NO: 32 - аминокислотная последовательность большой субъединицы ацетолактатсинтазы II дикого типа.

SEQ ID NO: 33 - нуклеотидная последовательность гена ilvM.

SEQ ID NO: 34 - аминокислотная последовательность малой субъединицы ацетолактатсинтазы II дикого типа.

Наилучший способ осуществления изобретения

1. Бактерия

Используемый в настоящем изобретении термин «полезный метаболит» не ограничен каким-либо образом при условии, что этот метаболит может быть получен ферментативной реакцией или биосинтетическим путем и может включать L-аминоки слоты, высшие спирты и D-пантотеновую кислоту.

Термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» может означать бактерию семейства Enterobacteriaceae, которая способна продуцировать и вызывать накопление L-аминокислоты в культуральной жидкости, когда указанная бактерия выращивается (культивируется) в питательной среде. Способность бактерии продуцировать L-аминокислоту может означать способность бактерии продуцировать L-аминокислоту в питательной среде или в бактериальных клетках, что приводит к накоплению L-аминокислоты в количествах, достаточных для ее выделения из культуральной жидкости или из бактериальных клеток, когда указанная бактерия выращивается (культивируется) в питательной среде.

Термин «L-аминокислота» может означать L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, глицин L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.

Термин «разветвленная L-аминокислота» может включать L-валин, L-лейцин и L-изолейцин.

Бактерия может обладать способностью к продукции полезного метаболита, такого как L-аминокислота, изначально, в соответствии со своими природными характеристиками, или может быть модифицирована с помощью мутаций (мутагенеза) или технологий рекомбинантных ДНК так, чтобы она получила способность к продукции.

Бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae, может быть выбрана из бактерий, относящихся к родам, входящим в состав этого семейства, таких как Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Yersinia и т.д., и способных продуцировать L-аминокислоту. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543). Примеры бактерий, которые могут быть модифицированы согласно настоящему изобретению, включают бактерии, относящиеся к роду Escherichia, Enterobacter или Pantoea.

Выбор штаммов бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть модифицированы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, в качестве примеров бактерии рода Escherichia, описанные в книге Neidhardt et al. (Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E.coli K-12, p.2460-2488. In F.C. Neidhardt et al. (ed.), E.coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2^nd ed. ASM Press, Washington, D.C., 1996), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению. В качестве конкретного примера могут быть взяты штаммы E.coli., такие как E.coli W3110 (ATTC 27325), E.coli MG1655 (ATCC 47076) и т.д., которые происходят из исходного штамма дикого типа, т.е. штамма E.coli K-12. Этот штамм может быть получен, в частности, из Американской коллекции типовых культур «American Type Culture Collection, (ATCC)» (P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). Каждому штамму присвоен индивидуальный регистрационный номер, и штаммы могут быть заказаны согласно регистрационному номеру (см. ссылку www.atec.org). Регистрационные номера штаммов находятся в списке каталога Американской коллекции типовых культур «American Type Culture Collection, ATCC».

Примеры бактерий Enterobacter включают Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes и т.д. Примеры бактерии Pantoea включают Pantoea ananatis и т.д. Недавно некоторые виды Enterobacter agglomerans были реклассифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis или Pantoea stewartii на основе анализа нуклеотидной последовательности 168 рРНК и других доказательств. Бактерии, относящиеся к роду Enterobacter или Pantoea, могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, так как принадлежат к семейству Enterobacteriaceae. Полученные с использованием технологий генной инженерии штаммы Pantoea ananatis, такие как штамм Pantoea ananatis AJ 3355 (PERM BP-6614), штамм AJ 3356 (FERM BP-6615), штамм AJ 3601 (PERM BP-7207) и их производные могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. Эти штаммы были классифицированы как Enterobacter agglomerans при выделении, и они депонированы как Enterobacter agglomerans. Однако позднее они были реклассифицированы как Pantoea ananatis на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S pPHK и других доказательств.

Примеры бактерий, принадлежащих к семейству Pseudomonadaceae, могут происходить из рода Pseudomonas. Примеры бактерий рода Pseudomonas включают Pseudomonas putida, P. aeruginosa, and P. syringae.

Термин «бактерия, которая модифицирована так, чтобы содержать генетическую экспрессионную систему» может означать бактерию, например, бактерию-продуцент L-аминокислоты, принадлежащую к семейству Enterobacteriaceae, в которой генетическая экспрессионная система, регулируемая белком типа LysR, модифицирована таким образом, что функциональность указанной самоиндуцируемой системы с положительной обратной регуляцией опосредована коиндуктором. Например, термин «бактерия, которая модифицирована так, чтобы содержать генетическую экспрессионную систему», может означать бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к продукции L-аминокислоты, такой как разветвленная L-аминокислота, которая модифицирована таким образом, что она имеет один или несколько генов указанной системы экспрессии.

Бактерия-продуцент L-аминокислоты с разветвленной цепью Термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты с разветвленной цепью» может означать бактерию, которая способна продуцировать и вызывать накопление разветвленной L-аминокислоты в культуральной жидкости, такую как L-валин, L-лейцин и L-изолейцин, когда указанная бактерия выращивается (культивируется) в питательной среде.

Разветвленные L-аминокислоты помимо L-валина, L-лейцина и L-изолейцина также могут включать неприродные разветвленные L-аминокислоты, такие как L-гомолейцин и L-гомоизолейцин. Способность бактерии к продукции разветвленной L-аминокислоты может быть сообщена бактерии или повышена путем отбора бактерии при выращивании (breeding). Термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты с разветвленной цепью» также может означать бактерию, которая способна продуцировать и вызывать накопление разветвленной L-аминоки слоты в культуральной жидкости в большем количестве, чем немодифицированный штамм, например, штамм дикого типа или родительский штамм, и также может означать бактерию, которая способна продуцировать и вызывать накопление разветвленной L-аминокислоты в культуральной жидкости в количестве, не менее чем 0,5 г/л или даже не менее чем 1,0 г/л.

Бактерия-продуцент L-аминокислоты с разветвленной цепью может быть бактерией семейства Enterobacteriaceae, которая содержит регуляторный участок, положительно влияющий на экспрессию генов ацетолактатсинтазы комплексом, который включает транскрипционный регуляторный белок и коиндуктор, являющийся продуктом реакции, катализируемой ацетолактатсинтазой. Более того, бактерия может быть бактерией семейства Enterobacteriaceae, в которой активность мутантной ацетолактатсинтазы повышена. Более точно, бактерия может быть бактерией-продуцентом разветвленной L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, отличающейся тем, что продукция разветвленной L-аминокислоты повышена за счет увеличенной активности мутантной ацетолактатсинтазы введением регуляторного участка в бактерию. Бактерия является бактерией-продуцентом разветвленной L-аминокислоты, принадлежащей к роду Escherichia, отличающаяся тем, что продукция бактерией разветвленной L-аминокислоты повышена за счет увеличенной активности мутантной ацетолактатсинтазы, устойчивой к ингибированию по типу обратной связи L-валином.

Бактерия-продуцент разветвленной L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae не ограничивается бактерией, описанной выше. Более точно, бактерией-продуцентом разветвленной L-аминокислоты также может быть бактерия, продуцирующая L-валин, L-лейцин и/или L-изолейцин.

Бактерия-продуцент L-валина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-валина в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются ими, штаммы, имеющие модификации, приводящие к сверхэкспрессии генов оперона ilvGMEDA (Патент США №5,998,178). Желательно удалить фрагмент оперона ilvGMEDA, отвечающий за ослабление экспрессии, с тем, чтобы экспрессия оперона не ослаблялась образующимся L-валином. Далее, в опероне может быть разрушен ген ilvA для того, чтобы снизить активность треониндезаминазы.

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-валина, также включают мутантные штаммы, имеющие мутацию в аминоацил-тРНК-синтетазе (Патент США №5,658,766). Например, может использоваться штамм Е.coli VL1970, который имеет мутацию в гене ileS, кодирующем изолейцин-тРНК-синтетазу. Штамм Е.coli VL1970 депонирован в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 г. с инвентарным номером ВКПМ В-4411. Далее, в качестве родительских штаммов также могут использоваться мутантные штаммы, для роста которых требуется липоевая кислота, и/или с недостаточным количеством H⁺-АТФазы (WO 96/06926).

В качестве родительского штамма могут использоваться бактерии-продуценты L-валина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как H-81 (ВКПМ В-8066), NRRL В-12287 и NRRL В-12288 (Патент США №4,391,907), ВКПМ В-4411 (Патент США №5,658,766), ВКПМ В-7707 (Европейская Патентная заявка EP 1016710 A2), NS1610 (ссылка на Патент ЕР1942183, Пример 7 или примеры, упомянутые там же) и подобные им.

Бактерия-продуцент L-лейцина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-лейцина, включают, но не ограничиваются ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы Е.coli, устойчивые к лейцину (например, штамм 57 (ВКПМ В-7386, Патент США №6,124,121)) или аналогам лейцина, включающие р-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин, 5,5,5-трифторлейцин (JP 62-34397B и JP 8-70879A); штаммы E.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов и описанные в WO 96/06926; Е.coli H-9068 (JP 8-70879 A), и подобные им.

Бактерия может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD, которые могут быть представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ретро-ингибированием L-лейцином (Патент США №6,403,342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминоки слоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены Ь2682 и Ь2б83 (гены удаZH) (Европейская Патентная заявка EP 1239041 A2).

В качестве родительского штамма могут использоваться бактерии-продуценты L-лейцина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как H-9070 (FERM ВР-4704) и Н-9072 (FERM BP-4706) (Патент США №5744331), ВКПМ В-7386 и ВКПМ В-7388 (Патент РФ №2140450), W1485atpA401/pMWdAR6, W14851ip2/pMWdAR6, AJ12631/pMWdAR6 (Европейская Патентная заявка EP 0872547) и подобные им.

Бактерия-продуцент L-изолейцина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-изолейцина, включают, но не ограничиваются ими, мутантные штаммы с устойчивостью к 6-диметиламинопурину (заявка Японии 5-304969А), мутантные штаммы с устойчивостью к аналогу изолейцина, такому как тиаизолейцин и гидроксамат изолейцина, и мутантные штаммы, дополнительно имеющие устойчивость к DL-этионину и/или гидроксамату аргинина (заявка Японии 5-130882A). Кроме того, в качестве родительских штаммов также могут использоваться рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, вовлеченные в биосинтез L-изолейцина, такие как треониндезаминаза и ацетогидроксатсинтаза (заявка Японии 2-458A, Европейская Патентная заявка EP 0356739 и Патент США №5,998,178).

Бактерия-продуцент высших спиртов и D-пантотеновой кислоты

Бактерия-продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae и, более точно, бактерия-продуцент разветвленной L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae может быть использована для получения высших спиртов и органических кислот, или их производных. Например, высшие спирты, такие как изобутанол, 2-метил-1-бутанол и 3-метил-1-бутанол, и органическая кислота, такая как D-пантотеновая кислота (витамин B5) могут быть получены с использованием подобной бактерии.

Известно из области техники, что в бактерии семейства Enterobacteriaceae биосинтетический путь L-валина, L-лейцина и L-изолейцина проходит через кето-кислотные интермедиаты. Более точно, 2-оксовалериат (2-кетовалериат, 2-КИВ) является предшественником для L-валина и L-лейцина; а 2-оксобутаноат является предшественником для L-изолейцина. Также, из уровня техники известно, что кето-кислотные интермедиаты или их производные могут быть предшественниками для высших спиртов с длиной углеродной цепи более чем 2 углеродных атома ввиду наличия пути деградации Эрлиха (Yan Y. and Liao J.C. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2009, 36:471-479). Например, 2-оксоизовалериат является предшественником для изобутанола, а его производное 4-метил-2-оксопентаноат является предшественником для 3-метил-1-бутанола; 2-оксобутаноат является предшественником для пропан-1-ола, а его производное 3-метил-2-оксопентаноат является предшественником для 2-метил-1-бутанола.

Способность к продукции высших спиртов может быть сообщена штаммам E.coli, которые изначально не способны продуцировать высшие спирты, путем введения генов kivd и adh2 из донорных микроорганизмов, кодирующих, соответственно, кетокислотадекарбоксилазу (КДК) с широкой субстратной специфичностью и алкогольдегидрогеназу (АДГ). Например, могут использоваться ген kivd из Bacillus subtilis и ген adh2 из Lactococcus lactis. В этом аспекте можно сослаться на Connor M.R. and Liao J.C., Appl. Env. Mocrobiol., 2008, 74:5769-5775; и Патентную заявку WO 2009046370 A2.

Таким образом, способность бактерии продуцировать высшие спирты, такие как изобутанол, 3-метил-1-бутанол и 2-метил-1-бутанол может быть сообщена бактерии за счет введения в бактерию-продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae генетической экспрессионной системы и подходящих гетерологичных генов, например, kivd и adh2 или их вариантов из донорных микроорганизмов.

Также известно из уровня техники, что в бактерии семейства Enterobacteriaceae 2-оксовалериат является предшественником D-пантотеновой кислоты. Таким образом, способность к продукции D-пантотеновой кислоты может быть сообщена бактерии путем модификации бактерии семейства Enterobacteriaceae генетической экспрессионной системой.

2. Генетическая экспрессионная система

Экспрессионная система может быть регуляторной системой транскрипции одного или нескольких целевых генов, которая включает элементы транскрипционного аппарата, регулируемого белком типа LysR. Элементы транскрипционного аппарата, регулируемого белком типа LysR, могут включать промотор, оператор, экспрессия которых положительно регулируется регуляторным белком типа LysR и коиндуктором.

Система экспрессии также может включать один или несколько целевых генов, которые функционально связаны с вышеупомянутым транскрипционным аппаратом. Термин «функционально связан» может означать, что целевой ген связан с регуляторной последовательностью(ями), такой как промотор или оператор таким способом, что возможна экспрессия этого гена.

Один или несколько целевых генов могут кодировать белки, вовлеченные в биосинтез коиндуктора, субстрата или предшественника указанного коиндуктора.

В соответствии с вышеописанной схемой экспрессионной системы, экспрессия системы может быть самоиндуцируемой и положительно регулируемой по типу обратной связи, опосредованной коиндуктором, полученным с участием продукта(ов) экспрессии целевого(ых) гена(ов). Такая экспрессионная система может называться «самоиндуцируемая регулируемая по типу обратной связи экспрессионная система», но с целью упрощения также может называться здесь как «экспрессионная система» или «система экспрессии». Система экспрессии может саморегулироваться по принципу положительной обратной связи коиндуктором, который может быть субстратом или предшественником для полезного метаболита в биосинтетическом пути, более точно, в биосинтетическом пути разветвленных L-аминокислот и/или его побочном пути.

«Регуляторный белок типа LysR» также может иметь название «транскрипционный регулятор типа LysR (LTTR)», «транскрипционный регулятор семейства LysR» или просто «регулятор». Регуляторный белок типа LysR может принадлежать к разнообразным семействам олигомерных бактериальных транскрипционных факторов, которые регулируют широкий спектр элементов транскрипции в ответ на широкий спектр внешних сигналов. Представители этого семейства могут выступать в качестве транскрипционных активаторов и/или транскрипционных репрессоров и иметь несколько общих структурных характеристик, таких как i) ДНК-связывающий домен, имеющий мотив спираль-поворот-спираль (остатки могут быть из положений с 1 по 65 с N-конца LTTR), (ii) домены, вовлеченные в распознавание коиндуктора и/или отклика (остатки могут быть из положений с 100 по 173 и с 196 по 206), и (iii) домен, необходимый для связывания ДНК и отклика (остатки могут быть из положений с 227 по 253), как описано в работе Schell M.A., Ann. Rev. Microbiol., 1993, 47:597-626. В отсутствие коиндуктора, LTTR могут связываться с регулируемыми промоторами посредством двойного двуцепочечного участка длиной 15 п.н., имеющего общую структуру, и участком ДНК в позиции около -65, как описано в работе Schell M.A., Ann. Rev. Microbiol., 1993, 47:597-626. В присутствие коиндуктора могут происходить дополнительные взаимодействия LTTR с участками связывания РНК-полимеразы (около -35) и/или изгиб ДНК, что приводит к активации транскрипции (Schell M.A., Ann. Rev. Microbiol., 1993, 47:597-626). Более того, некоторые представители семейства регуляторных белков типа LysR могут иметь другие четыре функциональные характеристики, такие как: (i) быть коиндуктор-зависимым транскрипционным регулятором различного размера от 276 до 324 аминокислотных остатков, (ii) независимо от присутствия коиндуктора связываться с операторными участками ДНК, имеющими схожую позицию и структурный мотив, (iii) разнонаправлено транскрибироваться с промотора, который расположен близко или даже перекрывается с промотором регулируемого гена, и (iv) подавлять собственную транскрипцию в различной степени, например, от 3 до 10 раз, т.е. быть отрицательно саморегулируемыми, как описано в работе Schell M.A., Ann. Rev. Microbiol., 1993, 47:597-626.

В качестве примера, но не ограничиваясь им, система экспрессии может вклю