Рекомбинантная днк pa3, рекомбинантная днк pqe 30-pa3, обеспечивающие получение полипептида a3, штамм e. coli м 15-a3, трансформированный рекомбинантной плазмидной днк pqe 30-pa3 и экспрессирующий рекомбинантный полипептид a3, рекомбинантный полипептид a3, обладающий способностью селективно связывать чса, и тест-система рфа для качественного выявления микроальбуминурии, тест-система для количественного определения микроальбуминурии

Рекомбинантная днк pa3, рекомбинантная днк pqe 30-pa3, обеспечивающие получение полипептида a3, штамм e. coli м 15-a3, трансформированный рекомбинантной плазмидной днк pqe 30-pa3 и экспрессирующий рекомбинантный полипептид a3, рекомбинантный полипептид a3, обладающий способностью селективно связывать чса, и тест-система рфа для качественного выявления микроальбуминурии, тест-система для количественного определения микроальбуминурии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Рекомбинантная ДНК рА3, рекомбинантная ДНК pQE 30-рА3, обеспечивающие получение полипептида A3, штамм Е. coli М 15-А3, трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК pQE 30-рА3 и экспрессирующий рекомбинантный полипептид A3, рекомбинантный полипептид A3, обладающий способностью селективно связывать ЧСА, тест-система РФА для качественного выявления микроальбуминурии, тест-система РФА для количественного определения микроальбуминурии.

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в медицинской практике и промышленности для производства тест-систем по выявлению и количественному определению микроальбуминурии - одного из ранних признаков поражения почек у больных сахарным диабетом (СД) и эссенциальной артериальной гипертензией (АГ).

В последние годы во всем мире неуклонно растет смертность от заболеваний, приводящих к хронической почечной недостаточности (ХПН). Наиболее частыми причинами возникновения почечной недостаточности являются СД и эссенциальная АГ. Принимая во внимание значительную распространенность СД и АГ, важное значение имеет поиск ранних признаков поражения почек у больных с указанной патологией.

Лидирующей причиной смертности больных СД в мире является ХПН вследствие прогрессирования диабетической нефропатии (ДН) - специфического поражения почек при СД. В США и Японии ДН занимает первое место по распространенности среди всех заболеваний почек (35-40%), оттеснив на вторую-третью позицию такие почечные заболевания, как гломерулонефрит, пиелонефрит, поликистоз и др. В странах Европы ДН носит менее угрожающий характер, но удерживается на уровне 20-25% по потребности в заместительной терапии (хронический гемодиализ, трансплантация почки). В России смертность от ХПН при СД типа I по данным Государственного регистра не превышает 18%, что в три раза ниже уровня, регистрируемого в мире на протяжении последних 30 лет. При СД типа II смертность от ХПН в России составляет 1,5%, что в 2 раза ниже мировой. Этот парадокс можно объяснить лишь отсутствием единой методологии регистрации смертности больных СД в России.

В настоящее время сдерживающими факторами для эффективного лечения СД являются:

- отсутствие повсеместного внедрения программы скрининга ДН в диабетологических учреждениях России;

- отсутствие единой методологии скрининга ДН;

- недоступность диализных методов лечения ХПН для многих больных СД.

Одним из наиболее ранних признаков поражения почек у больных СД является микроальбуминурия. Именно поэтому, ранним и достоверным методом диагностики первичной стадии поражения почек является тест на микроальбуминурию. Под термином «микроальбуминурия» понимают экскрецию альбумина с мочой в достаточно низких концентрациях от 30 до 300 мг/сут. Такое количество белка не может быть выявлено методами традиционного рутинного исследования мочи, в связи, с чем ранняя (доклиническая) стадия развития поражения почек может быть не диагностирована и пропущена. Однако, поскольку эта стадия является единственной обратимой при своевременном назначении патогенетической медикаментозной терапии, ее выявление является обязательным условием успешной борьбы с ДН и ХПН при диабете обоих типов.

Кроме того, микроальбуминурия является важнейшим ранним признаком поражения почек, отражающим начальные стадии патологии сосудов и неизменно коррелирует с увеличением сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности. Как показывают клинические исследования, уже самые небольшие уровни повышения экскреции альбумина с мочой четко ассоциируются со значительным возрастанием риска кардиоваскулярных событий, в том числе фатальных, а прогрессирующее со временем увеличение уровня микроальбуминурии однозначно указывает на ухудшение состояния сосудов и, соответственно, обусловливает дополнительное повышение риска. В связи с этим, микроальбуминурия признана независимым фактором сердечно-сосудистого риска и наиболее ранним (доклиническим) признаком поражения таких уязвимых органов-мишеней, как почки.

Микроальбуминурия не определяется обычными методами, например, путем осаждения белка сульфосалициловой кислотой.

Применяемые в настоящее время диагностические тест-системы для выявления микроальбуминурии являются, в основном, зарубежными и предназначены для иммунологического полуколичественного и количественного определения концентрации альбумина в моче. Полуколичественные - это индикаторные полоски или латекс-системы, в которых применяются различные реагенты с альбумином. Общим принципом является регистрация ″положительного″ результата только при выявлении в образце мочи концентрации альбумина, соответствующей диапазону микроальбуминурии (20-200 мг/мл).

Известен диагностический набор ″Micro-Bumin test″ (Mile′s Ins Ekkhart, FIN). Он основан на применении с альбумином голубого бромфенола, фиксированного на щелочном матриксе. Окрашивание происходит, если концентрация альбумина в образце превышает 40 мг/л. Низкая специфичность данного теста (<80%) обусловлена способностью реагента связываться с другими белками плазмы.

Известны диагностические наборы ″Albu Screen″ и ″Albusure″ (″Cambridge Life Siences″, Cambridge, UK), которые представляют собой латекс-агглютинирующий ингибиционный тест на основе использования антисыворотки к альбумину человека и латекс-частиц с альбумином. Если концентрация альбумина в образце мочи менее 30 мг/л, наблюдается латекс-агглютинация. Специфичность и чувствительность данного теста 90%.

Известен диагностический набор ″Micral-test″ (Boehringer Mannheim, Indiana-polis, Germany), который основан на использовании моноклональных антиальбуминовых антител, меченных галактозидазой, и фиксированных на тест-полоске. Оценка реакции производится спустя 5 минут путем визуального сравнения окрашивания зоны реакции тест-полоски с прилагаемой цветной шкалой, деления которой соответствуют концентрации альбумина 0, 10, 20, 50, 100 мкг/л.

Использование тест-полосок вполне допустимо при скрининге для полуколичественного выявления микроальбуминурии. Однако тест нуждается в количественной оценке экскреции альбумина с мочой.

Для количественного определения уровня экскреции альбуминов с мочой используются радиоиммунные, иммуноферментные и иммунотурбидиметрические методы, основанные на взаимодействии «антиген-антитело». Однако специфичность антител относительна, они могут взаимодействовать с рядом других антигенов и давать так называемую «неспецифическую» реакцию.

1. Прямой иммунотурбидиметрический. Он основан на реакции альбумина с антителом и преципитации иммунных комплексов в присутствии этиленгликоля. В условиях избытка антител преципитат вызывает турбидность (поглощение света), степень которой зависит от концентрации альбумина в исследуемом образце. Турбидность определяют фотометрически при длине световой волны 340 нм.

2. Иммунохимический метод с помощью системы HemoCue ® Альбумин Мочи. Система основана на реакции с античеловеческими антителами. Комплекс антиген-антитело образует осадок, который улавливается фотометрически в диапазоне 610 нм.

Таким образом, в настоящее время применяемые для выявления микроальбуминурии методы являются:

- дорогостоящими для масштабных программ скрининга и мониторинга микроальбуминурии в больших группах больных СД и АГ;

- основанными на иммунологическом определении концентрации альбумина в моче;

- трудоемкими, т.к. комплекс антиген-антитело образует осадок, поэтому обязательным условием проведения исследования является предварительное центрифугирование образцов, так как любое загрязнение мочи, т.е. любой уровень ее помутнения приводит к ложноположительным результатам;

Известна группа изобретений по заявке №2011125752, по которой принято решение о выдаче патента, которая представляет собой рекомбинантный полипептид А2, характеризующийся аминокислотной последовательностью из 333 аминокислот, ковалентно связанной с 13 аминокислотными остатками, кодируемыми плазмидой pQE 32, обладающий способностью селективно связывать человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), рекомбинантную ДНК ра2, кодирующую рекомбинантный полипептид А2 и являющуюся ЧСА-связывающим фрагментом хромосомной ДНК штамма DG 13 стрептококков группы G-CTG, рекомбинантную плазмидную ДНК pQE 32-ра2, представляющую собой плазмидную ДНК pQE 32, несущую рекомбинантную ДНК, штамм Е. coli М 15, трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК pQE 32-ра2 и экспрессирующий полипептид А2, рецепторноферментный (РФА) способ определения в моче ЧСА в концентрации 20-200 мкг/мл, включающий построение калибровочной кривой с проявкой тетраметилбензидином - ТМБ, иммобилизацию полипептида А2 на твердую фазу планшета, инкубирование, затем нанесение на него анализируемых проб мочи одновременно с меченным пероксидазой хрена ЧСА в разведении 1:8000, проявка ТМБ, измерение оптической плотности и по значениям калибровочной кривой установление количества ЧСА в пробах мочи, причем для определения в моче ЧСА при концентрации более 100 мкг/мл пробы разводят раствором фосфатно-солевого буфера.

В данном рецепторноферментном способе определения ЧСА в моче твердой фазой может являться поверхность полистиролового планшета или нитроцеллюлозная мембрана. В данном техническом решении описан также способ качественного определения ЧСА в моче, характеризующийся тем, что определение осуществляют путем нанесения 30 проб мочи на нитроцеллюлозную мембрану размером 1 см² с первым рядом разведения стандартного ЧСА для построения калибровочной кривой, обработки проб в блокирующем растворе 2% молока в фосфатно-солевом буфере с меченным пероксидазой полипептидом А2, промывания указанным буферным раствором и окрашивания ЧСА раствором парафенилендиамина с перекисью водорода, а также применение рекомбинантного полипептида А2 в качестве реагента для удаления ЧСА из сыворотки крови на колонке с аффинным сорбентом.

Данное техническое решение принято в качестве прототипа заявляемой группы изобретений.

Известный метод имеет недостатки из-за использования рекомбинантного полипептида большого молекулярного веса, который охватывает большую область, чем ЧСА-связывающие GA модули, что может мешать ему оптимально связываться с молекулой альбумина.

Задачей изобретения является решение актуальной проблемы - создание нового недорогого, простого в употреблении, чувствительного и специфичного способа определения микроальбуминурии у больных СД и АГ, основанного на взаимодействии «белок-белок» с использованием рекомбинантного рецепторного ЧСА-связывающего полипептида, полученного из стрептококков, качество очистки которого обеспечивает практически 100% специфичность, а также тест-систем, не требующих иммунных сывороток, высокоспецифичных, достаточно чувствительных, не дающих фоновых ложных реакций, экономичных и доступных в использовании. Использование микрочиповой технологии в сочетании с ЧСА-связывающим полипептидом для определения микроальбуминурии может дать быструю оценку содержания альбумина в моче одновременно у большого количества пациентов и тем самым облегчить проведение скрининга и мониторинга микроальбуминурии.

Заявлена группа изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом, которая включает следующие объекты.

1. Рекомбинантная ДНК рА3, кодирующая рекомбинантный полипептид A3, обладающий способностью селективно связывать человеческий сывороточный альбумин - ЧСА и имеющая нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 3.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE 30-рА3, представляющая собой плазмиду pQE 30, несущую рекомбинантную ДНК рА3 по п. 1 и обеспечивающая получение рекомбинантного полипептида A3.

3. Штамм Escherichia coli М 15-А3, продуцирующий рекомбинантный полипептид A3, полученный на основе штамма Escherichia coli М 15 и содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pQE 30-рА3.

4. Рекомбинантный полипептид A3, обладающий способностью селективно связывать ЧСА и характеризующийся аминокислотной последовательностью, представленной на фиг. 4, в которой первые 16 аминокислот кодируются последовательностью плазмиды pQE 30, ковалентно связанные с последующими 124 аминокислотами, кодируемыми последовательностью ЧСА-связывающего фрагмента хромосомной ДНК штамма DG 13 стрептококка группы G-СГG.

5. Тест-система РФА для качественного выявления микроальбуминурии, состоящая из матрицы микрочипа - нитроцеллюлозной мембраны; шести стандартных проб ЧСА 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 мкг/мл; блокирующего раствора; рекомбинантного полипептида A3 по п. 4, меченного пероксидазой; раствора парафенилендиамина с перекисью водорода для окрашивания мембраны.

6. Тест-система РФА для количественного определения микроальбуминурии, состоящая из полистиролового планшета, на твердую поверхность которого иммобилизован полипептид A3 по п. 4; фосфатно-солевого буферного раствора с твин 20 для промывки планшета; шести калибровочных проб 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 мкг/мл для построения калибровочной кривой зависимости оптической плотности от концентрации ЧСА; хромогена-3,3′5,5′-тетраметилбензидина и 33% перекиси водорода для проявления количества ЧСА в моче.

Техническая суть и достигаемый при использовании заявленной группы изобретений технический результат состоит в следующем.

Альбумин - наиболее распространенный белок плазмы крови человека и млекопитающих. В последние десятилетия выявлены и изучены белки бактерий, обладающие рецепторной активностью в отношении ЧСА.

Стрептококки (Streptococcus) групп А, С и G экспрессируют поверхностные белки, которые связывают ЧСА. (Myhre Е. and Kronvall G. Infect. Immun. 27: 6-14 (1980)), Wideback К. и др. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B. 91: 373-382 (1983)).

Среди таких поверхностных белков стрептококков группы G интерес представляет белок G, полноразмерная молекула которого обладает способностью связывать иммуноглобулин G (IgG) человека и различных млекопитающих, а также ЧСА человека и животных (Bjorck и др. Mol. Immunol. 24: 1113-1122 (1987)).

Из одного из штаммов Peptostreptococcus magnus выделен РАВ белок, связывающий ЧСА (de Chateau М., Bjorck L.J. of Biol. Chem. 269: 12147-12151 (1994)). Анализ его аминокислотной последовательности выявил участок из 45 аминокислотных остатков, отвечающий за связывание с ЧСА. Эта последовательность, названная GA модулем, имеет гомологию с ЧСА-связывающей областью белка G (Akerstrom В и др. J of Biol. Chem. 262: 13388-13391 (1987), Sjobring U и др J Immun. 140: 1595-1599. (1988), Nygren P. И др. J. Mol. Recognit. 1: 69-74 (1988)).

В отличие от РАВ белка, который не имеет гомологичных повторов, белок G, выделенный из штамма G 148, содержит три гомологичные повторяющиеся последовательности, т.е. три GA модуля.

Появление новых рецепторных белков у бактерий часто связывают с переносом генов, их частей или частей генома. Считается, что эти фрагменты кодируют продукты, являющиеся модульными элементами белков. Так, допускается, что ЧСА-связывающий GA модуль белка РАВ возник при переносе соответствующего элемента из белка G. Структура GA модулей в G белке и GA модуля в белке РАВ одинакова и состоит из трех спиралей (Johansson М. и др. J. Mol. Biol. 316: 1083-1099 (2002)).

Из штамма Streptococcus canis DG 12, выделенного из коровьего молока, получен ЧСА-связывающий белок, который содержит два GA модуля. Он не связывает IgG, но по способности связывать ЧСА превосходит белок G (Sjobring U. Infection and Immun. 60: 3601-3608 (1992)). Это свойство делает его привлекательным для практического применения.

Изучение структуры ЧСА-связывающих белков имеет большое значение для технологии создания белковых реагентов, актуальных в иммунохимии, протеомике, биотехнологии и клинической диагностике.

Использование рекомбинантного полипептида позволяет: исключить трудоемкий процесс приготовления специфических антител к альбумину (для которого используются лабораторные животные), избежать неспецифических ″фоновых″ реакций, часто встречающихся в иммунологии, стандартизовать используемый ЧСА-связывающий полипептид, и таким образом, стабилизировать всю систему анализа.

Практически все штаммы СГG, как человеческого, так и животного происхождения, продуцируют на своей поверхности клеток белок G, который связывает ЧСА.

Впервые рекомбинантный ЧСА рецептор, был получен шведскими авторами путем клонирования фрагмента гена ЧСА рецептора в непатогенном хозяине. (Nygren Р. -А и др. J. Mol. Recognition. 1: 69-74. (1988)). В данной работе для клонирования АВ области (области, ответственной за связывание ЧСА) рестрицировали плазмиду pSPG2 ферментом EcoPJ с последующей обработкой фрагментом Кленова, добавлением синтетического линкера Sail и лигированием. При рестрикции SalI и PstI был получен фрагмент в 640 н.п., который изолировали из агарозы и вставляли между теми же сайтами в вектор pEML8. Фрагмент гена вырезали из полученной плазмиды, используя EcoRI и HindIII сайты и вставляли в плазмиду pEG, конструкция которой описана в работе Eliasson (Eliasson М. И др. J. Biol. Chem. 263: 4323-4327 (1988)).

В результате такой модификации была получена плазмида pB₁B₂, ответственная за ЧСА-связывающую активность. Из субклона, продуцирующего ЧСА-связывающий белок, был выделен белок. Он был очищен аффинной хроматографией. Этот белок оказался гетерогенным с деградацией очищенного продукта. Причиной гетерогенности, очевидно, являлся довольно сложный путь его генетического конструирования. Практического применения из-за своих недостатков этот белок не находит.

В 1996 году был проклонирован фрагмент гена, кодирующий третий GA модуль белка G штамма G148. Полученный белок G148-GA3 был использован для изучения структуры ЧСА-связывающего модуля. (Kraulis Р. и др. FEBS Lett. 378: 190-194 (1996)), т.е. только в исследовательских целях.

В 1992 году из CГG животного происхождения, штамма DG 12, был проклонирован фрагмент гена, кодирующий ЧСА-связывающий фрагмент, с использованием плазмидного вектора рКК233-2 и определена его нуклеотидная последовательность. (Sjobring U. Infect, and Immun. 60: 3601-3608.(1992)).

Известны рекомбинантные ЧСА-связывающие рецепторные полипептиды А1 и А2. Полипептид А1 был получен из CГG, штамма G148, выделенного от человека в Отделе молекулярной микробиологии в 1996 году (Орлова С.Н. и др. Биотехнология. 8: 13-21. (1996)). Штамм, продуцирующий полипептид А1, задепонирован в коллекции НИИЭМ СЗО РАМН, №357. Особенностью этого полипептида является то, что он содержит ЧСА-связывающую область, охватывающую три GA модуля. Был изучен фрагмент гена, который кодирует полипептид А1. Изучение этого рецепторного полипептида доказало его способность связываться исключительно с основным белком плазмы человека - ЧСА. Данное свойство полипептида пытались использовать в диагностических тест-системах, позволяющих определять концентрацию ЧСА в различных биологических жидкостях, в частности, в моче. Однако, при выделении и очистке рекомбинантного полипептида А1 выход активного реагента в достаточном количестве был затруднен, что привело к необходимости создания нового ЧСА-связывающего препарата, обладающего большей активностью, чем полипептид А1 белка G.

Полипептид А2 был получен из штамма DG 13 СГG, выделенного из коровьего молока (Гупалова Т.В. и др., 2012). Штамм, продуцирующий полипептид А2, задепонирован в коллекции НИИЭМ СЗО РАМН, №593. Показано, что полипептид А2 обладает большей ЧСА-связывающей активностью по сравнению с полипептидом А1 из штамма СГС человеческого происхождения. Создан штамм-продуцент E. coli М 15-А2, позволяющий получить полипептид А2, обладающий ЧСА-связывающей активностью с высоким выходом. Полипептид А2 был использован в методе РФА для определения микроальбуминурии. Он характеризуется последовательностью из 346 аминокислот, в которой первые 13 аминокислот, кодируются последовательностью плазмиды pQE 32, ковалентно связанные с последующими 333 аминокислотами, кодируемыми последовательностью фрагмента хромосомной ДНК штамма DG 13 СГG и идентичными последовательности альбумин-связывающего белка из штамма DG 12 СГG (Sjobring U. Infect, and Immun. 60: 3601-3608. (1992)). Эта последовательность состоит из 11 аминокислот, которые совместимы с последней частью лидерного пептида, то есть она содержит ряд гидрофобных остатков с небольшой незаряженной аминокислотой в конце. Затем идет уникальная последовательность из 55 аминокислот, обозначенная N, за которой идут две области, обозначенные Е1 (28 аминокислот) и Е2 (29 аминокислот). За ними идут последовательности двух GA модулей. В следующей последовательности, обозначенной W, обнаружена последовательность из четырех аминокислот (LysProGluVal), повторяющаяся 12 раз. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности альбумин-связывающего белка из штамма DG 13 СГG представлены на фиг. 1.

Таким образом, молекулярный вес полипептида А2, последовательность которого состоит из 346 аминокислот, составляет 48 кДа, в то время как последовательность, содержащая два ЧСА-связывающих GA модуля, состоит только из 124 аминокислот и кодирует полипептид с молекулярным весом 14 кДа. Отсутствие у полипептида А2 оптимальной конформации может вызвать стерические затруднения при взаимодействии альбумина с молекулой большого размера.

Согласно заявленному изобретению получен рекомбинантный полипептид A3 и его штамм-продуцент.Рекомбинантный полипептид A3 содержит только последовательность двух ЧСА-связывающих GA модулей, обладает высокой способностью связывать ЧСА и меньшим молекулярным весом. Его использование возможно в диагностике при создании специфичных и экономически выгодных тест-систем для качественного выявления и количественного определения микроальбуминурии у больных СД и АГ.

Поставленная задача решалась конструированием уникальных праймеров, направленных к участкам гена, кодирующего полипептид, состоящий из двух ЧСА-связывающих GA модулей. С целью быстрого и простого получения рекомбинантного полипептида A3 для клонирования фрагмента ДНК была использована система экспрессионных плазмид pQE. Для создания штамма-продуцента рекомбинантного полипептида A3 был использован штамм Е. coli M l5. В результате экспериментальной работы этот штамм приобрел новые свойства: способность экспрессировать рекомбинантный полипептид A3. Новый штамм получил название Е. coli M 15-А3.

В процессе работы была создана уникальная рекомбинантная ДНК рА3, полученная в результате ПЦР с использованием хромосомной ДНК штамма DG13 CГG, уникальных праймеров РА1 и РА2 и последующего клонирования с использованием экспрессионной плазмиды pQE-30 (The QIAexpress System, Qiagen, США).

Была также создана рекомбинантная плазмидная ДНК pQE 30-рА3, несущая рекомбинантную ДНК рА3, и штамм-продуцент Е. coli М 15-А3, позволяющий при определенных условиях экспрессировать рекомбинантный полипептид A3.

В процессе работы получен фрагмент гена, кодирующий область с двумя ЧСА-связывающими GA модулями штамма DG 13 CГG, с 382 п. н. по 754 п.н. (обозначенный как рА3, размером 372 п.н.) с помощью ПЦР с использованием праймеров РА1 и РА2 и хромосомной ДНК штамма DG 13 СГG.Также авторами осуществлено клонирование рА3 с использованием экспрессионной плазмиды pQE-30 и последующей трансформацией полученной рекомбинантной плазмиды (обозначенной как pQE 30-рА3) в гетерологическую систему Е. coli M 15. Авторами получен штамм-продуцент рекомбинантного полипептида A3, обозначенный как Е. coli М 15-А3. Также авторами реализована экспрессия рекомбинантного полипептида A3 клетками штамма Е. coli М 15-А3 с последующей одноступенчатой аффинной очисткой с использованием Ni-сефарозы (GE Healthcare, Sweden).

Получение рекомбинантного полипептида A3.

Источником хромосомной ДНК послужил штамм DG 13 СГG (выделенный из коровьего молока). ДНК, выделенная фенольно-хлороформной экстракцией, была использована в качестве матрицы в ПЦР с целью получения фрагмента гена рА3 (372 п.н.) Олигонуклеотидные праймеры представлены в таблице 1.

Подчеркнутые звенья нуклеотидной последовательности указывают на сайты рестрикции. Анализ результатов ПЦР осуществлен путем разделения фрагментов ДНК в 1% агарозном геле при помощи горизонтального электрофореза (фиг. 2).

Выделение искомого амплифицированного участка ДНК проведено с использованием набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США).

Полученный фрагмент клонировали с использованием экспрессионной плазмиды pQE 30. При подготовке к клонированию была проведена рестрикция выделенного из агарозы фрагмента рА3 (372 н.п.) и плазмиды pQE 30 ферментами BamHI и KpnI с образованием липких концов. Продукты рестрикции разделяли с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле, а затем лигировали.

Продуктами лигирования проводили кальциевую трансформацию штамма E. coli М 15. Процесс трансформации осуществляли по методике трансформации кишечной палочки, используя плотные селективные среды, содержащие 100 мкг/мл ампициллина, 25 мкг/мл канамицина. (Maniatis Т, Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. - Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 867. (1982)).

Антибиотикоустойчивые трансформанты откалывали на две параллельные чашки Петри с антибиотиками. Колонии с одной чашки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и вскрывали раствором, содержащим 0,2 N NaOH, 0,1% SDS и 0,5% β-меркаптоэтанола. Мембрану инкубировали 1 час при комнатной температуре в блокирующем растворе (2 части 3% молока и 1 часть фосфатно-солевого буфера (ФСБ)) для удаления неспецифического связывания и затем в блокирующем растворе, содержащем ЧСА, меченный пероксидазой хрена (Sigma, USA).

Конъюгирование пероксидазы хрена с ЧСА проводили периодатным методом (Фримель Г. Иммунологические методы: М. Медицина: 438-439. (1987)). Затем мембрану последовательно отмывали блокирующим раствором и ФСБ. Пероксидазную активность проявляли раствором парафенилендиамина в концентрации 1 мг/мл с 0,15% перекисью водорода. Из трансформантов с наиболее выраженной экспрессией ЧСА-связывающей активности выделяли рекомбинантные плазмиды с помощью Mini-prep, plasmid DNA purification kit (Qiagen, USA). Наличие в них рекомбинантной ДНК подтверждали в ПЦР с исходными праймерами РА1 и РА2. Плазмидную ДНК pQE 30-рА3 использовали как матрицу в ПЦР с праймерами pQE1 и pQE2. Амплификат выделяли после электрофореза в 1% агарозном геле и секвенировали.

Итоговые данные совпали с известной нуклеотидной последовательностью, кодирующей область с двумя ЧСА-связывающими GA модулями. (Sjobring U. Infect, and Immun. 60: 3601-3608. (1992)).

На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность, состоящая из 372 п. н. рекомбинантной ДНК рА3 и 48 п.н. плазмиды pQE 30. Жирным шрифтом выделены последовательности ЧСА-связывающих GA модулей.

На фиг. 4 представлена аминокислотная последовательность, состоящая из 140 аминокислотных остатков, в которой 124 аминокислоты полипептида A3 кодируются рекомбинантной ДНК рА3 и первые 16 аминокислот -плазмидой pQE 30. Жирным шрифтом выделены последовательности ЧСА-связывающих GA модулей.

Культуру штамма Е. coli М 15, содержащую рекомбинантную плазмиду pQE 30-рА3, обозначенную как Е. coli М 15-А3, культивировали в жидкой среде BHI (Brain Heart Infusion Broth, Gibco, США) с добавлением антибиотиков (ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл)) до поздней логарифмической фазы роста (OD₆₀₀=0,7-0,9). Затем экспрессию рекомбинантного белка индуцировали добавлением изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (IPTG), и клетки культивировали еще 4 часа. После этого клетки осаждали центрифугированием, отмывали лизирующим буфером А (20 мМ Na₂HPO₄, 20 мМ NaH₂PO₄, 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, pH 8,0) и суспендировали в том же буфере, добавляя ингибитор протеаз, фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), до концентрации 1 мМ. Суспензию клеток вскрывали ультразвуком и центрифугировали. Надосадочную жидкость наносили на колонку, заполненную Ni-сефарозой. После того, как белок связывался с Ni-сефарозой, колонку промывали буфером А для удаления несвязавшихся белков. Рекомбинантный белок элюировали буфером Б (20 мМ Na₂HPO₄, 20 мМ NaH₂PO₄, 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазола, pH 8,0). После аффинной хроматографии белок диализовали 18 часов против дистиллированной воды.

Выделенный рекомбинантный полипептид анализировали методом SDS электрофореза в полиакриламидном геле, который позволил сделать заключение об удовлетворительном качестве очистки полипептида и также об его молекулярной массе, сравнивая пробег полипептида A3 с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (161-0373), Bio-Rad, США). Молекулярная масса полипептида A3 оказалась равной (14,0±0,5) кДа (фиг. 5).

Таким образом, рекомбинантный полипептид A3 содержит аминокислотную последовательность ЧСА-связывающего полипептида CTG штамма DG 13, содержащую 124 аминокислоты, ковалентно связанную с 16 аминокислотными остатками, кодируемыми pQE 30.

Изучение особенностей взаимодействия рекомбинантного полипептида A3 с ЧСА при сравнении с аналогичной реакцией с полипептидом А2

Получена характеристика взаимодействия рекомбинантной молекулы A3 с ЧСА. Результаты работы позволяют расширить область применения полипептида A3, дополнив ее использованием при создании диагностикумов, для аффинного выделения ЧСА и для освобождения сыворотки крови от ЧСА.

Структурные различия рекомбинантных полипептидов А2 и A3 делают рекомбинантный полипептид A3 более предпочтительным при использовании в тест-системе для определения микроальбуминурии.

Проведено сопоставление рецепторной активности рекомбинантных полипептидов А2 и A3 в отношении ЧСА, представленного следующими образцами: 1) ЧСА - поликлональный сывороточный альбумин человека, меченный пероксидазой хрена. 2) Поликлональный немеченый ЧСА.

Установлено, что полипептид A3, также, как и полипептид А2, обладает способностью к селективному связыванию с ЧСА в любом из использованных вариантов постановки ИФА (прямой ИФА, непрямой ИФА, ингибиторный ИФА, конкурентное ингибирование). Структурные различия между двумя полипептидами, реализованные методами молекулярной генетики, способствуют существенной дифференцировке рекомбинантных полипептидов А2 и A3 по ЧСА-связывающим свойствам.

В случае прямого ИФА полипептиды А2 и A3 были иммобилизованы на твердой фазе. При этом оценивали количество связавшегося с ними меченого ЧСА. На фиг. 6 показана гистограмма, отражающая сопоставление ЧСА-связывающей активности полипептидов А2, и A3. Исследуемые полипептиды А2 и A3 обладают ЧСА-связывающей активностью в отношении меченого ЧСА, причем количество ЧСА, связанного полипептидом A3, примерно такое же, что и в случае полипептида А2. Полипептиды А2 и A3, кодируемые различными фрагментами гена и имеющие разную молекулярную массу, несомненно имеют, структурные различия, определяющие ЧСА-рецепторную активность каждого из них. Можно допустить, что на реализацию этой способности влияют и условия постановки ИФА, а именно - нахождение полипептида на твердой фазе или в растворе. Влияние этого фактора объясняется наличием у пептидов пространственной конфигурации, которая неодинакова для молекул, свободно циркулирующих в растворе или фиксированных на твердой фазе.

Изменение конформации гипотетически может привести к увеличению или уменьшению способности молекул связывать ЧСА. Для проверки этого предположения использовали непрямой и ингибиторный ИФА.

При постановке непрямого ИФА результаты показали, что полипептиды в растворе связывают ЧСА примерно с одинаковой активностью (фиг. 7). Ингибиторный ИФА показал, что полипептиды А2 и A3, находясь в растворе, препятствовали взаимодействию меченого ЧСА с адсорбированными молекулами А2 и A3 в пределах 70-94% (фиг. 8).

Отмечены особенности в поведении белков в условиях ИФА. Полипептиды А2 и A3 способны вступать во взаимодействие с ЧСА как в растворе (ингибиторный и непрямой ИФА), так и в адсорбированном состоянии (прямой ИФА). Это свойство позволяет использовать их в качестве иммунохимических реагентов в ИФА, причем, как в иммобилизованном виде, так и в роли выявляющих молекул при наличии ферментной метки.

При этом, степень связывания, отмеченная у полипептидов А2 и A3 в условиях прямого и непрямого ИФА, примерно одинаковая.

Способ определения экскреции ЧСА с мочой, т.е. создание тест-систем для определения микроальбуминурии

Проведенные исследования по взаимодействию полипептидов А2 и A3 с ЧСА показали, что рекомбинантные молекулы обладают ЧСА-связывающей способностью. Это свойство послужило основой для создания тест-систем для определения концентрации ЧСА в моче.

При скрининге и мониторинге больных СД и АГ требуется одновременный анализ нескольких десятков образцов. Для решения этой задачи показана возможность создания способа, в котором сочетается использование стабильного высокоспецифичного рекомбинантного ЧСА-связывающего полипептида и технология микрочипов. При создании тест-системы для качественного выявления микроальбуминурии обычно используемые антитела к альбумину были заменены рекомбинантным рецепторным полипептидом, а сам принцип иммуноферментного анализа был трансформирован в РФА.

В качестве матрицы для нанесения проб мочи пациентов с нефропатией была выбрана нитроцеллюлозная мембрана. На нитроцеллюлозную мембрану, размером 1 см² были нанесены 30 проб мочи, используя автоматический калибратор. Первый ряд на мембране соответствовал разведениям стандартного препарата ЧСА для построения калибровочной кривой (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 мкг/мл). Мембрана была проинкубирована в блокирующем растворе (2% молоко, разведенное в ФСБ) с меченным пероксидазой ЧСА-связывающим полипептидом A3. Затем мембрану промывали и окрашивали раствором парафенилдиамина с перекисью водорода. На мембране четко проявлялись пятна, разная степень окрашивания которых соответствовала различным концентрациям альбумина в стандартных пробах и пробах мочи (фиг. 9). Имея считывающее устройство и соответствующую компьютерную программу, можно получать количественную оценку альбумина в моче, причем одновременно в большом количестве проб.

Для создания тест-системы для количественного определения микроальбуминурии предпочтителен конкурентный метод ИФА, так как этот метод содержит минимальное число операций, требует незначительного расхода реагентов и легко может быть автоматизирован. Замена антител к альбумину на рекомбинантный полипептид создала определенные преимущества, поскольку позволила отстроиться от трудоемкого процесса приготовления специфических иммунных сывороток, стандартизовать используемый рекомбинантный полипептид и, тем самым, унифицировать всю систему анализа. Кроме того, применение рекомбинантного рецепторного полипептида позволило избежать фоновых реакций, возможных для иммунологических реакций.

Ранее такой подход для анализа альбумина не применялся.

Принцип РФА метода для количественного определения микроальбуминурии заключается в следующем: на твердую поверхность планшета иммобилизовывается рекомбинантный ЧСА-связывающий полипептид (А2 или A3) на который наносятся анализируемые пробы мочи одновременно с меченым ЧСА. При такой постановке альбумин пробы и меченый ЧСА конкурируют за ЧСА-связывающий полипептид, иммобилизованный на твердой фазе. Концентрация альбумина в анализируемой пробе обратно пропорциональна ферментативной активности твердой фазы.

При разработке тест-системы были подобраны условия анализа, обеспечивающие необходимую чувствительность и специфичность. В результате проведенных экспериментов было выбрано рабочее разведение меченого ЧСА 1:8000 при концентрации иммобилизованного полипептида 0,5 мкг/мл. По данным последовательных разведений немеченого ЧСА строится калибровочная кривая.

После подбора оптимальных условий строили калибровочную кривую зависимости оптической плотности от концентрации ЧСА в стандартных пробах (5.0; 10; 20; 25; 50, 100 и 200 мкг/мл). Концентрацию ЧСА в моче находили по значениям оптической плотности на калибровочной кривой.

При многократных повторах данного эксперимента было выявлено, что при использовании полипептида A3, кодируемого фрагментом гена в 420 п.н., отвечающим только за связывание с ЧСА области с двумя GA модулями, точки точно ложатся на прямую и очень точно определяется концентрация альбумина в моче. Что касается использования полипептида А2, обладающего гораздо большим молекулярным весом и охватывающим большую область, чем ЧСА-связывающие GA модули, точки, соответствующие калибровочным пробам, не всегда ложились на прямую, что затрудняло точное определение концентрации альбумина в моче.

Таким образом, удалось показать, что рекомбинантный полипептид A3 может быть использован в качестве высокоспецифичного реаге