Адъювант

Адъювант

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к препаратам, стимулирующим антителообразование, и может быть использовано в области медицины и ветеринарии для конструирования и производства высокоэффективных вакцин.

Адъюванты - вещества или смеси веществ, в т.ч. в виде суспензий и эмульсий, вызывающие усиление образования антител к сложным антигенам, таким как бактерии и вирусы. Адъюванты усиливают образование специфических антител, связывающих именно антигенные детерминанты возбудителя заболевания, тогда как иммуномодуляторы активизируют все компоненты иммунной системы.

Наиболее распространенными в настоящее время адъювантами для вакцин (бактериальных и вирусных) являются эмульсии вода-масло в присутствии эмульгирующих веществ или суспензии неорганических веществ (см. патент РФ 2058154, МПК А 61 39135, патент РФ 1743027, МПК А61К 39/135, патент РФ 1730763, МПК А61К 39/39, заявка WO 09701133, МПК А61К 9/14, патент США 5312620, МПК А61К 31/765).

Однако препараты на основе масляных эмульсий и суспензий неорганических веществ, как правило, склонны к расслоению фаз, часто реактогенны, их иммунные свойства изменяются со временем. Большинство таких адъювантов вызывают локальные и системные токсические явления. Кроме того, препараты, приготовленные на их основе, обладают повышенной вязкостью, что затрудняет их введение.

Известен адъювант, содержащий смесь биологического компонента - липополисахарида из клеток сине-зеленых водорослей с минеральным маслом и поверхностно-активным веществом (см. а.с. СССР 1297285, МПК А61К 45/05).

Известны также адъюванты для биопрепаратов на основе липосом (см. патент РФ 2107493, МПК А 61 94127, патент США 485388, МПК А61К). Липосомальные адъюванты дают более сильную иммуногенную реакцию, но более сложны в изготовлении, требуют больших материальных затрат.

Задачей настоящего изобретения является разработка адъюванта, позволяющего создавать вакцины, обладающие низкой токсичностью, повышенной иммуногенной активностью и обеспечивающего стабильность вакцин при хранении.

Поставленная задача достигается тем, что в качестве адъюванта используют наногранулы фторуглеродного материала (НГФУМ).

Фторированные соединения широко применяются в медицине и хирургии в частности. Многолетняя практика применения изделий из перфторорганических соединений (фетр, шовный материал, имлантаты из фторопласта, сходного по химическому составу с фторуглегодом) убедительно доказала полную биологическую инертность этих соединений. В ООО «СКБМТ Ижиниринг» разработана технология получения суспензий гранул фторированного углеродного материала нанометрового и субмикронного размера в различных средах, этиловом спирте без применения поверхностных активных веществ (ПАВ), в воде с применением ПАВ, и в других жидких средах. Технология работает надежно и может быть отмасштабирована в приемлемой для промышленного производства степени. Получаемые суспензии стабильны, отсутствует оседание и расслоение состава в том числе после многократных циклов замораживания-размораживания. Так же ООО «СКБМТ Ижиниринг» владеет технологией абсорбционного нанесения биологических продуктов на поверхность данных гранул.

НГФУМ в силу своей структуры обладает высокой абсорбционной способностью, на уровне применяемых в промышленности сорбентов. Это дает серьезные основания полагать, что предлагаемый продукт будет проявлять хорошие адъювантные свойства по стимуляции иммунного ответа при вакцинации, при этом будучи совершенно инертным не будет иметь тех недостатков, которые были отмечены у известных адъювантов.

Для приготовления НГФУМ может быть использовано различное сырье, фторированный углерод, фторированная сажа, фторированные углеродные волокна и т.п. Наилучшие результаты показал материал из фторированных углеродных волокон. Для получения гранул нанометровых размеров применяется механохимический реактор на основе коллоидной мельницы. Реактор загружается реакционной смесью, состоящей из сырья и реакционной среды. В качестве среды используется смесь перфторированных углеводородных соединений жидкой консистенции. Основу среды составляет перфтордекалин с добавлением других перфторированных жидкостей. Процентный состав: ПФД - 20-80%, предпочтительно 65%, другие перфторированные жидкости: - 80-20%, предпочтительно 35%. Реактор настраивается на зазор 50-300 нанометров в зависимости от необходимости размеров целевой фракции. Процентный состав реакционной смеси 20-50%, предпочтительно 40% сырье, 80-50% реакционная среда, предпочтительно 60%. Реактор включается на время, необходимое для получения нужного количества целевого продукта. Механическая энергия, вводимая в реакционную смесь, создает в материале сырья механические напряжения, при этом реакционная среда способствует снижению уровня механического напряжения, необходимого для начала разрушения частиц сырья, одновременно часть молекул среды, непосредственно контактирующих с зоной разрушения, вступает в механохимическое взаимодействие с освобождающимися валентными связями углерода и присоединяется к этим связям. Образуется очень развитая поверхность, с высокой сорбирующей способностью и при этом инертная химически. Полученный НГФУМ отделяется от среды путем испарения при нагреве до 80^оC. Затем добавляется этиловый спирт до образования концентрированной суспензии. При необходимости добавляется ПАВ, например, на основе яичных фосфолипидов, затем суспензия разбавляется водой.

Полученная водная суспензия НГФУМ используется для приготовления вакцин в качестве адъюванта.

Для этого используют концентрации суспензии от 0,1% до 0,01% весовых. Разводится концентрированная суспензия физраствором. Соотношение НГФУМ и вакцины должно быть от 10 к 1 до 50 к 1. Приготовление смеси вакцины с адъювантом заключается в добавлении вакцины к адъюванту в указанном соотношении и выдерживании смеси для созревания в течение 1-2 суток при непрерывном помешивании. После этого вакцина готова для введения пациентам.

Для оценки возможности применения наночастиц фторуглерода в качестве адъюванта вакцин был использован туберкулин, представляющий собой вытяжку микобактерий, состоящую из пептидов и жирных кислот. Туберкулин является диагностическим препаратом, широко применяемым при диагностике туберкулеза в качестве кожного теста (реакция Манту). Известно, что антитела на туберкуин при его внутрикожном введении не образуются. Поэтому получение антител на туберкулин может подтвердить адъювантную активность наночастиц фторуглерода и его взаимодействие с иммунокомпетентными клетками.

В качестве антигена применяли туберкулин PPD (Purified Protein Derivative. Туберкулин конъюгировали с НЧФУ со средним диаметром частиц 45 нм. Полученный конъюгат вводили четырем лабораторным животным (кроликам шиншилла) внутримышечно четырехкратно с интервалом 10 дней. Кровь у животных на проверку наличия антител брали спустя 12 дней после четвертой инъекции. Контрольной группе вводили туберкулин, не конъюгированный с НЧФУ, в аналогичной дозе. Титр полученных сывороток определяли с помощью ИФА с использованием меченых пероксидазой хрена кроличьих антител. Чувствительность определяли методом дот-анализа. В результате данной иммунизации конъюгатами туберкулина с НЧФУ средний титр полученных сывороток у четырех кроликов составил 1:512. У контрольной группы животных, которым вводили неконъюгированный туберкулин, AT к нему в сыворотке крови не обнаружили.

Отсутствие токсического воздействия НГФУМ подтверждается проведенными токсикологическими испытаниями.

После хранения в течение 1,5 лет в нормальных условиях (при температуре, равной 20-22 градусов Цельсия). Изменений в адъювантной активности не обнаружено.

Возможность создания вакцины, обладающие низкой токсичностью, повышенной иммуногенной активностью и высокой стабильностью при хранении является достоинством и преимуществом предлагаемого технического решения по сравнению с прототипом.

Применение наногранул фторуглеродного материала в качестве адъюванта для вакцин.