Эффективный гидролиз лигноцеллюлозы, совмещенный с выработкой ферментов

Эффективный гидролиз лигноцеллюлозы, совмещенный с выработкой ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

В настоящем изобретении предлагается способ биотехнологической выработки мономерных соединений, таких как сахара и/или этанол, из лигноцеллюлозного сырья.

Предшествующий уровень техники

Из-за ограниченных ресурсов минерального топлива и требований по уменьшению выбросов CO₂ в химической индустрии осуществляется поиск более надежных производственных путей для изготовления ценных химических веществ, таких как жидкое топливо и продукты базовой химии. Часть стратегии сфокусирована на преобразовании лигноцеллюлозной биомассы в разнообразные химические вещества или топливо, такое как этанол. Лигноцеллюлозная биомасса содержит целлюлозу (~25-40% масс./масс. сух. вещ.), гемицеллюлозу (~15-25% масс./масс. сух. вещ.) и лигнин (~15-30% масс./масс. сух. вещ.) в качестве основных компонентов и минорные количества других углеводов, смол, белков и неорганических соединений. Конкретная композиция любого сырья может быть определена по описанию Sluiter et al., 2008. Среди форм растительной биомассы лигноцеллюлозная биомасса, полученная из любых отходов лесного и сельского хозяйства, такая как древесные отходы и солома зерновых, особенно подходит для преобразования в ценные химические вещества и топливо из-за их доступности, низкой стоимости и природощадящего производства. Кроме того, анализ жизненного цикла технологических процессов, использующих лигноцеллюлозное сырье, демонстрирует сниженный выброс парниковых газов по сравнению с процессами, основанными на другом сырье.

Были описаны различные варианты способов преобразования лигноцеллюлозной биомассы в этанол и другие продукты базовой химии (Pejo et al., 2008). Для реализации этих способов в промышленном масштабе особенно целесообразно перенести максимальное количество энергии, углерода и массы, содержащихся в возобновляемом сырье, в конечные продукты. В настоящее время ни один из описанных способов преобразования не был реализован в полной степени.

Типовыми процессами биотехнологического преобразования лигноцеллюлозного материала (например, соломы) в ценные продукты (например, этанол) являются: механическое размельчение, физико-химическая предварительная обработка, ферментативный гидролиз, ферментация и извлечение продукта.

Ключевой барьер в реализации выработки этанола из целлюлозы в промышленных масштабах заключается в эффективном по стоимости ферментативном гидролизе предварительно обработанной лигноцеллюлозы при высоких концентрациях твердых веществ.

Гидролиз целлюлозной фракции был идентифицирован как одно из основных препятствий в преобразовании лигноцеллюлозы в этанол. В настоящее время цена и эффективность ферментов, которые требуются для эффективного гидролиза биомассы, являются основными узкими местами.

Преобразование древесного или сельскохозяйственного лигноцеллюлозного материала в сахара и далее в этанол является сложным процессом, охватывающим несколько стадий, включая последовательные комбинации механического размельчения биомассы, гидротермической предварительной обработки, ферментативного или химического гидролиза биомассы, микробной ферментации гидролизатов биомассы и извлечение этанола дистилляцией или с помощью технологических эквивалентов.

Механическое размельчение биомассы

Типичные стадии размельчения включают механическую обработку, такую как резка, толчение или помол сырья, которые, как правило, требуют значительного потребления энергии и значимых производственных затрат. Сырье разрезают или толкут до частиц размером от 0,5 мм до 2 см, что дает однородную суспензию в водной фазе. Суспендирование частиц сырья в поддающуюся перекачке взвесь, которая может быть перенесена в дальнейшие типовые процессы, требует больших количеств воды, что вносит дополнительный вклад в производственные затраты способа (Tolan, 2002).

Предварительная обработка

Преобразование лигноцеллюлозного материала в продукты, такие как этанол, часто включает стадию физико-химической предварительной обработки. Цели предварительной обработки заключаются в удалении и отделении гемицеллюлозы от целлюлозы, в разрушении и удалении лигниновой оболочки, уменьшении кристалличности целлюлозы, увеличении доступной площади поверхности целлюлозы и/или увеличении размера пор целлюлозы для облегчения проникновения гидролизующих агентов (Tolan, 2002; Wyman et al., 2005). Стадия предварительной обработки предпочтительно мобилизует пентозную фракцию указанной биомассы, при этом также усиливает перевариваемость твердой целлюлозосодержащей фракции (Wyman et al., 2005).

Стадию предварительной обработки часто проводят с использованием водной взвеси. Предпочтительно такая взвесь имеет высокое содержание твердых веществ, на которые в сухой массе сырья приходится порядка 20-40% (масс./масс.). Способ предварительной обработки часто включает гидротермическую обработку биомассы под подвышенным давлением (~100-250°C) в отсутствие или в присутствии кислотных (т.е. H₂SO₄, HCl, H₃PO₄) или основных (т.е. NH₄OH, NaOH, KOH, извести) катализаторов, которые добавляются в концентрациях от 0,1 до 15% масс./масс. сырья (Kumar et al., 2009а; Kumar et al., 2009b; Kumar et al., 2009с, Wyman et al., 2005). Время реакции варьируется от 10 с до 2 ч для обеспечения эффективной трансформации компонентов биомассы при приготовлении к гидролизу и ферментации биомассы.

Альтернативные стратегии предварительной обработки включают мягкие гидротермические обработки с использованием органических растворителей или ионных жидкостей для уменьшения неподатливости биомассы и для солюбилизации лигнинового и целлюлозного компонентов биомассы. Эти последние варианты предварительной обработки часто имеют более высокую цену и ограниченную эффективность.

Chandra et al. (2007) пишут, что гидротермическая предварительная обработка в отсутствие или в присутствии разведенной кислоты является предпочтительным способом уменьшения неподатливости биомассы для гидролиза, поскольку данный способ придает подвижность гемицеллюлозе и частично деполимеризует лигнин без солюбилизации. Кроме того, данный способ в результате дает аморфные волокна целлюлозы с большой площадью поверхности, которая идеальная для ферментативного гидролиза.

В зависимости от природы катализаторов и примененного профиля температуры, предварительная обработка также может привести к образованию растворимых ингибиторов, включая уксусную кислоту, сахар (например, фурфурол, HMF) или продукты деградации лигнина, которые могут уменьшать эффективность дальнейших процессов гидролиза и ферментации (Margeot et al., 2009). Для увеличения эффективности гидролиза и ферментации надосадочную жидкость после предварительной обработки необходимо отбрасывать или ее необходимо детоксифицировать (Tolan, 2002).

Гидролиз предварительно обработанной биомассы

Распад взвеси предварительно обработанной биомассы в ферментируемые мономерные сахара может быть выполнен гидролизом либо с помощью кислоты, либо с помощью ферментов. Ферментативный гидролиз является более селективным и менее энергоемким, чем сравнимые химические (например, на основе кислоты) методологии, следовательно, обеспечивая более благоприятные экономические показатели процесса и потенциально более высокий выход этанола в ходе ферментации.

Ферментные системы и смеси более чем одной ферментативной активности

В этом смысле подходящими ферментными системами являются ферментные системы, которые преобразуют полимерные сахара, такие как целлюлоза и гемицеллюлоза, в мономеры гексоз (т.е. в глюкозу) и пентоз (т.е. в ксилозу), как правило, содержащие активности целлюлаз, гемицеллюлаз и бета-глюкозидаз. Ферментные системы, содержащие активности целлюлаз и бета-глюкозидаз, часто получают в погруженных культурах грибов, например, Trichoderma sp. и/или Aspergillus sp. Остаток грибной биомассы, как правило, отделяют от ферментационной среды и отбрасывают. Ферментационную среду затем концентрируют, стабилизируют и для транспортировки изготовляют из нее продукт с полученными ферментами.

Ферментативных гидролиз биомассы, как правило, проводят в условиях, при которых общая дозировка фермента составляет 1-5% масс./масс. (10-20 FPU/г целлюлозы) сырья. В зависимости от режима дозирования и конкретного состава ферментов прикладной ферментной системы, биомасса гидролизуется при температуре 40-55°C в течение 1-7 дней. Вплоть до примерно 80-90% масс./масс. полимерных сахаров, содержащихся в биомассе, преобразуются в их соответствующие мономеры.

Согласно Kristensen et al. (2009) ферментативный гидролиз биомассы часто проводят при более низком содержании твердых веществ 10-20% масс./масс. Содержание сухого вещества выше 15% масс./масс. часто приводит к значимым потерям в выходе мономерных сахаров. Этот эффект обусловлен проблемами, связанными с гомогенным перемешиванием взвесей с высоким содержанием твердых веществ, приводящим к неравномерному распределению ферментов. Кроме того, накопление конечных продуктов, таких как целлобиоза и глюкоза, высвобожденных в процессе ферментативного гидролиза, может привести к специфическому ингибированию активностей целлюлаз и бета-глюкозидаз (Xiao et al., 2004a).

Cardona & Sanchez (2007) описывают применение предварительно обработанной надосадочной жидкости и/или полученных ранее гидролизатов биомассы в качестве субстрата для роста и индукции при выработке ферментов грибами. Howard et al. (2003) описывают прямое применение истощенной жидкой ферментационной среды после грибной ферментации для гидролиза. Rao et al. (1985) описывают использование цельной взвести грибной ферментации для эффективного гидролиза целлюлозных субстратов. Для выработки гидролитических ферментов использовали искусственные среды, которые не позволяли адаптировать системы гидролитических ферментов для конкретного сырья и/или для варианта предварительной обработки. Другой недостаток способа, описанного Rao et al. (1985), заключается в том, что способ ограничен секретируемыми ферментными активностями, так как ничего не предпринимается для облегчения высвобождения несекретируемых или связанных с клеточной поверхностью ферментов.

При использовании для гидролиза биомассы ферментных систем, полученных из Trichoderma, активности внеклеточных бета-глюкозидаз зачастую являются скорость- и выход-лимитирующими из-за их относительно низкой удельной активности и значимого ингибирования конечным продуктом, глюкозой, высвобожденной в ходе процесса (Xiao et al., 2004a, Shewale, 1982).Следовательно, препараты или смеси целлюлаз, как правило, дополняются альтернативными бета-глюкозидазными (BGL) активностями, которые продуцируются, например, Aspergillus niger (Seidle et al., 2004). Стандартные режимы дозировок для препаратов BGL рекомендуют добавление от 0,01 до 2 единиц целлобиазы (CBU) на г целлюлозы для улучшения кинетики гидролиза и увеличения выхода мономерных Сахаров (Chauve et al., 2010).

Альтернативные стратегии устранения технической проблемы гидролиза биомассы при более высоких концентрациях твердых веществ включают способы, в которых ферментативный гидролиз и ферментацию проводятся одновременно (SSF).

Ферментация этанола

Промышленное производство этанола традиционно проводят с помощью дрожжей S. cerevisiae. He так давно для эффективного использования сахаров, полученных из сырого лигноцеллюлозного материала, которые не являются глюкозой, были разработаны новые микробные штаммы (либо дрожжей, либо бактерий). Использование пентоз и всех гексоз улучшает экономику производства этанола.

Извлечение продукта

Этанол, как правило, извлекается из ферментационной среды с помощью известных способов дистилляции и/или ректификации.

Проблема, которая должна быть решена

Обычные способы деградации биомассы являются либо неэффективными, либо зависят от требующего времени и затрат добавления отдельно выработанных ферментов или ферментных смесей, которые подходят для деградации конкретной биомассы. Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в обеспечении улучшенного способа деградации биомассы, такой как лигноцеллюлозная биомасса, в обход этих недостатков.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении предлагается способ деградации предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассы, включающий стадии:

с) культивирования микроорганизма, способного вырабатывать по меньшей мере один фермент, обладающий целлюлолитической и/или гемицеллюлолитической активностью в ростовой среде, с получением посредством этого обогащенной микроорганизмом суспензии, содержащей указанный по меньшей мере один фермент;

d) обработки микроорганизма и/или обогащенной микроорганизмом суспензии стадии с);

е) гидролиза предварительно обработанной биомассы продуктом стадии d) в реакторе для получения растворимых сахаров.

В некоторых случаях предварительно обработанная лигноцеллюлозная биомасса была получена из лигноцеллюлозной биомассы с помощью физико-химической обработки. Существует возможность того, что ростовая среда стадии с) содержит лигноцеллюлозную биомассу, которая предварительно была обработана. В частном воплощении вышеуказанного, конечная ростовая среда, в которой культивируется микроорганизм, содержит часть предварительно обработанной взвеси так, чтобы способ деградации лигноцеллюлозной биомассы включал стадии:

a) физико-химической предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы для получения предварительно обработанной взвеси;

b) разделения предварительно обработанной взвеси стадии а) на две части, часть А и часть В;

c) включения части А в сырую ростовую среду для получения конечной ростовой среды, и культивирование по меньшей мере одного микроорганизма, способного продуцировать по меньшей мере один фермент, имеющий целлюлолитическую и гемицеллюлолитическую активность в конечной ростовой среде, с получением посредством этого обогащенной микроорганизмом суспензии, содержащей указанный по меньшей мере один фермент;

d) обработки микроорганизма и/или обогащенной микроорганизмом суспензии стадии с);

е) гидролиза биомассы части В и продукта части d) в реакторе для получения растворимых сахаров.

Грибы являются предпочтительными микроорганизмами в стадии с). Обработка стадии d) может происходить физически, или механически, или химически, или с помощью комбинации вышеуказанного. Растворимые сахара, полученные в стадии е), необязательно могут быть подвергнуты дальнейшим способам преобразования, таким как выработка этанола. С этой целью может быть проведено разделение на твердую фазу/жидкую фазу так, чтобы получить обогащенную сахаром жидкую фазу, содержащую растворимые сахара.

В настоящем изобретении предлагается улучшенный способ гидролиза лигноцеллюлозной биомассы. В текущем изобретении описан способ гидролиза и ферментации для производства этанола из остатков лигноцеллюлозной биомассы (пример которого показан на Фиг.1), который включает эффективное использование ферментов, вырабатываемых совместно с ним.

Согласно настоящему изобретению, выработка гидролитических ферментов включена в данный процесс, предпочтительно в непосредственной близости процесса гидролиза. Затем полную ферментационную взвесь, содержащую растворимые ферментные системы и грибную биомассу, использует для гидролиза лигноцеллюлозного сырья в составляющие сахара. Совместная выработка указанных ферментных систем с помощью части предварительно обработанного сырья в качестве ферментационной среды обуславливает оптимальную гибкость вариантов сырья и предварительной обработки.

В ключевом аспекте изобретения неожиданно было обнаружено, что физическая, или механическая, или химическая обработка микробной биомассы, в частности механическая фрагментация грибной биомассы перед ферментативным гидролизом, будет приводить к ускорению кинетики гидролиза и превосходному выходу мономерных сахаров (например, глюкозы) по сравнению с использованием ферментационной надосадочной жидкости или питательной среды без обработки микробной биомассы или с помощью только компонентов растворимых гидролитических ферментов, содержащихся в очищенной надосадочной жидкости ферментационной питательной среды.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение охватывает улучшенный способ деградации биомассы, такой как лигноцеллюлозная биомасса. Биомасса, которая подвергается обработке способом по настоящему изобретению, может быть биомассой, описанной ниже. К таковой относится биомасса, содержащая большие частицы или куски, такие как древесные отходы, кукурузная солома, жом сахарного тростника, солома злаков, и, следовательно, механическое размельчение необязательно может быть проведено до осуществления конкретного способа настоящего изобретения.

В ином случае основная часть частиц биомассы, например 90% или большее количество частиц, достаточно малы и могут быть обработаны в суспензии (взвеси), т.е. они имеют диаметр не больше чем 2 см, предпочтительно не больше чем 0,5 см, более предпочтительно не больше чем 2 мм, так что механическое размельчение не требуется. Однако, в случае проведения размельчения, его проводят следующим образом.

Механическое размельчение

Согласно предпочтительному воплощению изобретения, любая лигноцеллюлозная биомасса будет подвергнута грубому размельчению с использованием устройства, такого как молот, или шаровая мельница, или дробилка, или любого другого типа, или комбинаций таких аппаратов, подходящих для разрезания остатков биомассы на куски, в которых 90% или большее количество частиц имеет диаметр не больше чем 2 мм, что приводит к получению биомассы с малым размером частиц.

Предварительная обработка

Цель предварительной обработки заключается в дестабилизации и/или частичном гидролизе полимерных структур (малых частиц) биомассы. Биомасса, которую подвергают предварительной обработке, как правило, является сухой, т.е. не суспендированной в жидкой фазе. Эту биомассу затем переносят в реакционный сосуд с помощью любой системы транспортировки, известной в данной области, такой как, например, конвейерная лента или винтовой транспортер. Состоящую из мелких частиц биомассу переносят в устойчивый к давлению сосуд и затем подвергают предварительной обработке.

Продукт стадии предварительной обработки синонимично называют «взвесью», или «предварительно обработанной биомассой», или «предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассой», или «взвесью предварительно обработанной биомассы».

Предварительная обработка может быть химической предварительной обработкой, т.е. обработкой с помощью кислоты или щелочи. Предпочтительно, такая обработка может быть проведена в присутствии кислотного катализатора, который в неограничивающем примере может быть выбран из числа H₂SO₄, H₂NO₃, HCl, H₃PO₄, SO₂. В особенно предпочтительном воплощении кислота представляет собой H₂SO₄. Кислотный катализатор может быть применен в концентрациях 0-10% масс./масс. сух. вещ. сырья. В более предпочтительном воплощении изобретения концентрацию кислоты корректируют до 0,1-3% масс./масс. сух. вещ. сырья.

В ином случае предварительная обработка может быть термической обработкой, например экспонированием температурой выше 80°C. Однако наиболее предпочтительно, если химическая и термическая обработки объединены. В еще более предпочтительном воплощении изобретения гидротермическая предварительная обработка может быть проведена либо при атмосферном давлении, либо при давлении выше атмосферного. Предварительная обработка в присутствии кислотного катализатора также может представлять собой введение горячего пара под давлением, дающего температуры от 120 до 250°C. В этих условиях биомасса может быть предварительно обработана в интервале от 0,1 до 60 мин перед дальнейшим процессированием и необязательной стадией нейтрализации, которые могут представлять собой внесение извести или любой другой щелочи так, чтобы рН реакционной среды стал равен 3,5-6.

В другом аспекте изобретения механическое размельчение и предварительная обработка могут быть проведены одновременно: в данном случае предпочтительно сухую биомассу транспортируют в сосуд для предварительной обработки, где она в это время контактирует с водой. Гидротерминческая предварительная обработка может быть механически объединена со стадией размельчения из биомассы, так чтобы предварительную обработку можно было провести в периодическом или непрерывном режиме. В качестве неограничивающего примера режима непрерывной предварительной обработки, можно привести предварительную обработку, проводимую в закрытом устойчивом к давлению сосуде, оборудованном механизмом винтового конвейера.

В другом предпочтительном воплощении изобретения гидротермическую предварительную обработку проводят в режиме парового взрыва, при котором биомассу подвергают инъекции горячего пара выше атмосферного давления. Индуцированное паром давление предпочтительно будет составлять 1-30 атм (120-250°C), которому указанная биомасса будет подвергаться в течение 0,1-60 мин. После этого давление в реакционном сосуде резко снижают посредством переноса предварительно обработанной биомассы в во вторичный сосуд для сбора. Неограничивающим примером реакционного сосуда для проведения предварительной обработки паровым взрывом может быть реактор - паровой генератор (Autoclave Engineers, Эри, Пенсильвания), состоящий из реактора с паровой рубашкой, состоящей из трубы «Hastelloy», закрытой двумя шаровыми клапанами. Ассоциированные электрические нагреватели, расположенные на всех открытых, не покрытых рубашкой поверхностях реактора, контролируют заданную температуру предварительной обработки. Прямая инъекция пара также используется для быстрого придания биомассе температуры предварительной обработки. Для поддержания искомой температуры предварительной обработки давление пара корректируется и контролируется. Все предварительно обработанные материалы выходят через сменный мундштук на дне реактора и собираются в нейлоновой сумке, поддерживаемой толстостенным испарителем с рубашкой и охлаждением.

Предпочтительно, если время и температуру обработки будут выбирать таким образом, чтобы максимальное количество составляющих биомассы гидролизовалось до составных мономеров наиболее эффективным и экономичным способом без выработки значимых количеств продуктов деградации, таких как фурфурол.

Обычно фракция лигнина предварительно обработанного сырья будет находится в диапазоне 10-70% масс. лигнина/масс. сух. вещ. предварительно обработанного сырья. Содержание лигнина предварительно обработанного сырья может быть измерено способами, известными в специалистам в данной области, такими как, например, без ограничения перечисленным, те что, описаны в: http://www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.html.

После указанных вариантов предварительной обработки содержание сухого твердого вещества полученной взвеси биомассы будет составлять около 10-50% масс./масс. сух. вещ. сырья. Первичная цель выбранной стратегии предварительной обработки заключается в выборе наиболее энергетически эффективного и рентабельного способа, с помощью которого лигноцеллюлозная биомасса будет приготовлена так, чтобы большая часть пентозной фракции солюбилизировалось, а целлюлозные волокна были доступны для ферментных систем, используемых в дальнейших гидролитических процессах. Перенос биомассы в конкретные типовые процессы будет осуществляться откачкой или исключительно самотеком.

Базовый способ настоящего изобретения

В настоящем изобретении предлагается способ деградации предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассы, включающий стадии:

c) культивирования микроорганизма, способного вырабатывать по меньшей мере один фермент, обладающий целлюлолитической и/или гемицеллюлолитической активностью в ростовой среде, с получением посредством этого обогащенной микроорганизмом суспензии, содержащей указанный по меньшей мере один фермент;

d) обработки микроорганизма и/или обогащенной микроорганизмом суспензии стадии с);

е) гидролизу предварительно обработанной биомассы продуктом стадии d) в реакторе для получения растворимых сахаров.

Предпочтительно, чтобы в этом способе предварительно обработанная лигноцеллюлозная биомасса была получена из лигноцеллюлозной биомассы с помощью физико-химической обработки, такой как предварительная обработка, описанная выше.

В особенно предпочтительном воплощении изобретения ростовая среда стадии с) содержит лигноцеллюлозную биомассу, которая предпочтительно была предварительно обработана. Различные ферментные активности, такие как, без ограничения перечисленным, целлюлолитические и гемицеллюлолитические активности, вместе образуют ферментную систему, т.е. ферментные системы являются смесями более чем одной ферментативной активности. Более чем одна из этих активностей в некоторых случаях может содержаться в одной и той же полипептидной молекуле, однако, более типично, если ферментная система содержит смесь нескольких, например больше чем двух, т.е. больше чем трех, различных ферментных полипептидов, где каждый имеет по меньшей мере одну искомую активность, так что объединенные активности образуют ферментную систему.

Способы и системы, описанные данным изобретением, отличаются от замыслов предшествующего уровня техники. В настоящем изобретении предлагаются совместная выработка ферментов, где последовательно для гидролиза биомассы используются предварительно обработанная биомасса и суспензия микроорганизма, полученная в стадии d). Неожиданно было показано, что присутствие надосадочной жидкости предварительной обработки не оказывает влияния на дальнейшие процедуры гидролиза и ферментации. Кроме того, к удивлению было показано, что применение цельной ферментационной взвеси, содержащей мицелий и надосадочную жидкость, полученные при выработке фермента, демонстрирует превосходную эффективность при гидролизе биомассы по сравнению с только лишь надосадочной жидкостью, полученной при выработке фермента, или по сравнению со сравнимыми коммерческими ферментными препаратами. Кроме того, продемонстрировано, что физическая, и/или механическая, и/или химическая обработка микроорганизма согласно стадии d) обеспечивает оптимальную активацию ферментных систем экстра- и внутриклеточного гидролиза, которые действуют синергично в дальнейших гидролитических процессах, что приводит к оптимальной деградации лигноцеллюлозного сырья в мономерные сахара, такие как глюкоза и ксилоза.

Выработка ферментов (стадия с)

Выработка ферментов согласно стадии (с) характеризуется следующим: взвесь предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассы в первой стадии инокулируется микроорганизмом, который может быть микроорганизмом, относящимся к бактериям, археям, дрожжам или грибам, который способен обеспечивать целлюлолитические и/или гемицеллюлолитические ферментативные активности. Целлюлолитическая активность является активностью, способной деградировать, например гидролизовать, целлюлозу, например способна гидролизовать некоторые или все гликозидные связи в ней. Гемицеллюлолитическая активность является активностью, способной деградировать, например гидролизовать, гемицеллюлозу, например способна гидролизовать некоторые или все гликозидные связи в ней. Строительные блоки гемицеллюлозы включают ксилан, глюкуроноксилан, арабиноксилан, глюкоманнан и ксилоглюкан.

В неограничивающем примере указанные ферментативные активности включают экзо- и эндоцеллюлазы (т.е. целлобиогидролазу (СВН) I, II, эндоглюканазу (EG) I-IV, бета-глюкозидазу (BGL), экзо- и эндогемицеллюлазы (т.е. ксиланазу, ксилозидазу, ксилобиазу, арабиназу, арабинофукозидазу, маннаназу, маннозидазу, галактазу и галактозидазу) и эстеразы (Howard et al., 2003, Lynd et al., 2002). Таким образом, изобретение включает предпочтительное воплощение, в котором по меньшей мере один фермент с целлюлолитической и/или гемицеллюлолитической активностью имеет одну или несколько активностей, выбранных из группы, состоящей из целлобиогидролазы I типа или II типа (СВН I или СВН II), эндоглюканазы типов I, II, III и IV (EGI, EGII, EGIII, EGIV), бета-глюкозидазы (BGL), эстеразы, экзогемицеллюлазы и эндогемицеллюлазы. Еще более предпочтительно, если экзогемицеллюлазу и эндогемицеллюлазу преимущественно выбирают из ксиланазы, ксилобиазы, арабиназы, арабинофукозидазы, мананназы, маннозидазы, галактазы и галактозидазы.

Неограничивающие примеры бактерий, обеспечивающих указанные ферментные активности, которые, следовательно, могут быть использованы согласно настоящему изобретению, включают Actinobacter sp., Agrobacterium sp., Bacillus sp., Burkholdria sp., Clostridia sp., Caldicellulosiruptor sp., Cellvibrio sp., Halobacterium sp., Pseudomonas sp., Paenibacillus sp., Xanthomonas sp. и Thermobifida sp. (Howard et al., 2003, Maki et al., 2009).

Неограничивающие примеры архей, обеспечивающих указанные ферментные активности, которые, следовательно, предпочтительно могут быть использованы согласно настоящему изобретению, включают Pyrochoccus sp.; Sulphobolus sp., Staphylothermus sp. и Thermococcus sp. (Maki et al., 2009).

Грибы, в целом, являются наиболее предпочтительными микроорганизмами для настоящего изобретения. Способ по данному изобретению предпочтительно может быть проведен так, чтобы микроорганизмом являлся гриб, который предпочтительно выбирают из группы, состоящей из: Trichoderma sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. и Talaromyces sp. Неограничивающие примеры грибов, обеспечивающих указанные ферментные активности, которые могут быть, следовательно, предпочтительно использованы согласно настоящему изобретению, включают Aspergillus sp., Chaetomium sp., Chrysosporium sp., Fusarium sp., Humicola sp., Orpinomyces sp., Pencillium sp., Phanerochaete sp., Piromyces sp., Talaromyces sp., Trametes sp. и Trichoderma sp. или их соответствующие голоморфы (Howard et al., 2003). Особенно предпочтительным является гриб, выбранный из Trichoderma sp. и Talaromyces sp.

Выбор продуцирующего фермент организма может быть определен углеводной композицией предварительно обработанной сырьевой взвеси, количеством ферментных активностей, свойственных конкретным организмам, и биофизическими характеристиками, охватывающими параметры, такие как температурная стабильность, селективность субстрата, удельная активность и устойчивость к ингибиторам.

Для индукции выработки ферментов указанные микроорганизмы будут инкубироваться при подходящей для роста температуре, которая может, как правило, варьироваться от 14 до 102°C, предпочтительно в диапазоне 28-102°C, в зависимости от используемого микроорганизма. Время инкубации до начала выработки фермента может варьироваться значительным образом в зависимости от типа микроорганизма (Lynd et al., 2002), а предварительно обработанное сырье может быть протестировано способами, описанными Xiao et al. (2004b) или Bobey and Ederer (1981).

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, выработка фермента достигается с помощью гиперпродуцирующего целлюлазу штамма мицелиального гриба Trichoderma reesei (анаморф: Hypocrea jecornia). Неограничивающим примером такого организма является штамм Rut-С30 Trichoderma ressei (Lynd et al., 2002, Szijarto et al., 2004). В еще одном предпочтительном аспекте изобретения грибные ферментные системы вырабатываются на предварительно обработанной биомассе, в качестве единственного значимого источника углерода. Предпочтительно это осуществляется с грибами, такими как Trichoderma reesei. Стартовые культуры Trichoderma reesei могут быть выращены на предварительно обработанной взвеси до начала спорообразования, что можно количественно оценить с помощью способов, таких как спектрофотометрические измерения при OD₆₀₀ нм. Гриб затем выращивают в течение 3-7 дней в условиях постоянного перемешивания при 50-250 об/мин, рН, температуры, а также в условиях контроля кислорода. Для получения максимального количества фермента и биомассы критичной является инкубация гриба при 30°C и при рН~5 в течение всей ферментации. На 5 день, как правило, достигается максимальная выработка биомассы и фермента, что позволяет продолжить обработку.

Ростовая среда, как правило, содержит источник углерода, источник азота, необязательно витамины и микроэлементы. Источник углерода предоставляется в количестве 1-30% масс./об., более предпочтительно 1-10% масс./об. и еще более предпочтительно 1-8% масс./об. среды для культивирования. Источники углерода могут содержать нативную или предварительно обработанную лигноцеллюлозную биомассу, такую как дерево, солому зерновых, жмых, просо и целлюлозу, и сырую бумажную пульпу, полученную в целлюлозно-бумажном производстве. Альтернативные источники углерода могут содержать очищенную целлюлозу, пульпу, молочную сыворотку, мелассу или сахара, такие как глюкоза и лактоза. Может быть использована комбинация источников углерода, в которой одним источником углерода является продукт стадии b) или ее эквивалентов, а дополнительным источником углерода является что-либо из описанного выше в данном абзаце. Источник азота предоставляется в количестве 0,1-10% масс./об., более предпочтительно 0,1-8% масс./об. и даже более предпочтительно 0,1-4% масс./об. среды для культивирования. Источники азота включают соевый экспеллерный жмых, жидкий кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, зеленую муку (молотую траву), пшеничные отруби, барду и неорганические соли аммония. Витамины и микроэлементы могут быть предоставлены в количестве 0-5% масс./об., более предпочтительно, 0,001-1% масс./об. среды для культивирования. Минералы, обогащающие среду для культивирования, могут включать соли Fe, Mn, Zn и Со, тогда как витамины, добавляемые в среду для культивирования, могут включать комплексы витамина В, биотин, коальбумин.

Точные композиции сред для культивирования и физические условия для эффективного роста продуцентов ферментов-целлюлаз известны специалистам в данной области. Конечный отбор ростовой среды будет зависеть от используемого микроорганизма.

В предпочтительном воплощении изобретения, как биомасса микроорганизма, так и истощенная среда для ферментации, содержащая остаточную лигноцеллюлозную биомассу и основную часть ферментных активностей целлюлаз и гемицеллюлоаз, будут использованы в дальнейшей стадии обработки биомассы.

В настоящем изобретении, к удивлению, было установлено, что значимые пропорции активностей целлюлаз и гемицеллюлаз сохраняются на остаточной предварительно обработанной сырьевой биомассе и продуцируемой грибной биомассе.

Еще более интересной оказалась демонстрация того, что гидролиз биомассы был более эффективен при использовании цельной фермент-содержащей взвеси (надосадочной жидкости и мицелия/биомассы) по сравнению с экспериментами, в которых для гидролиза использовали только содержащую фермент надосадочную жидкость или коммерческие препараты ферментов.

Это необязательно может быть достигнуто разделением взвеси биомассы, полученной предварительной обработкой на два потока, так чтобы одна часть подвергалась стадии с), а другая напрямую направлялась на стадию е). Авторы с удивлением обнаружили, что часть предварительно обработанной биомассы может быть подвержена воздействию ростовой среды микроорганизма. Понятно, что таким образом микроорганизм способен продуцировать ферменты, подходящие для деградации предварительно обработанной биомассы. Поэтому в настоящем изобретении также предлагается в пределах предпочтительного воплощения способ деградации лигноцеллюлозной биомассы, включающий стадии:

а) физико-химической предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы для получения предварительно обработанной взвеси;

b) разделения предварительно обработанной взвеси стадии а) на две части, часть А и часть В;

c) включения части А в сырую ростовую среду для получения конечной ростовой среды и культивирование по меньшей мере одного микроорганизма, способного продуцировать по меньшей мере один фермент, имеющий целлюлолитическую и гемицеллюлолитическую активность в конечной ростовой среде, с получением посредством этого обогащенной микроорганизмом суспензии, содержащей указанный по меньшей мере один фермент;

d) обработки микроорганизма и/или обогащенной микроорганизмом суспензии стадии с);

е) гидролиза биомассы части В и продукта части d) в реакторе дл