Новые il-17-связывающие соединения и их медицинское применение

Новые il-17-связывающие соединения и их медицинское применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым IL-17-ингибирующим полипептидам, соответствующим слитым белкам, к композициям и их медицинскому применению.

Предпосылки создания изобретения

CD4+ Т-клетки играют центральную роль в организации иммунных ответов, помогая другим клеткам адаптивной или врожденной иммунной системы. В ранних исследованиях были идентифицированы два класса CD4+ Т-клеток (Th1 и Th2). В последнее время, была идентифицирована новая субпопуляция CD4+ Т-клеток - линия Th17. По-видимому, Th17-клетки возникли как ответвление адаптивной иммунной системы, специализировавшись на усилении защиты хозяина от внеклеточных бактерий, а также некоторых грибов и микробов, против которых нет хорошей защиты со стороны Th1 или Th2-иммунитета.

Th17-клетки были идентифицированы в контексте открытия нового семейства цитокинов, семейства IL-17, которое, как известно в настоящее время, содержит шесть членов (IL-17A-F). IL-17 (ранее называемый CTLA-8) главным образом экспрессируется Th17-клетками и был обозначен как IL-17A для того, чтобы показать, что он является основоположником этого семейства цитокинов. Последовательности членов семейства IL-17 не имеют гомологии с другими известными в настоящее время белками млекопитающих и, следовательно, образуют отдельное семейство цитокинов. Предполагается, что структурные признаки членов семейства IL-17, установленные на основании кристаллической структуры IL-17F, сходны со многими цитокинами, причем каждый из членов семейства, вероятно, продуцируется как гомодимер, хотя структурные сходства подразумевают, что могут присутствовать и гетеродимеры. Совсем недавно, было обнаружено, что гетеродимер IL-17A и IL-17F, экспрессирующийся активированными CD4+ Т-клетками, передает сигнал через комплекс IL-17RA/IL-17RC (Wright J.F. et al. (2008) J. of Immunol., 181, p.2799-2805).

Идентификация Th17-клеток как центральных медиаторов хронических воспалительных процессов и как основных патогенетических эффекторов некоторых типов аутоиммунных состояний, ранее считавшимися Th1-опосредованными, предвещает создание новых терапевтических подходов (Weaver Т. et al. (2008) Annu. Rev. Immunol., 25, р.821-852). Кроме того, pro-воспалительный цитокин IL-17 главным образом экспрессируется Th17-клетками и присутствует в повышенных количествах в синовиальной жидкости у пациентов с ревматоидным артритом (RA) и, как показано, включен в развитие раннего RA. В дополнение, IL-17 является главным индуктором TNF-альфа и IL-1, последний из которых ответственен за развитие эрозии кости и очень болезненных последствий для травмированных пациентов (Lubberts E. (2008) Cytokine, 41, р.84-91). Кроме того, неадекватная и избыточная продукция IL-17 связана с патологией разных заболеваний и нарушений, таких как остеоартрит, ослабление костных имплантатов, острое отторжение трансплантата (Antonysamy et al., (1999) J. Immunol, 162, p.577-584; van Kooten et al. (1998) J. Am. Soc. Nephrol., 9, p.1526-1534), септицемия, септический и эндотоксический шок, аллергия, астма (Molet et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol., 108, p.430-438), потеря костной массы, псориаз (Teunissen et al. (1998) J. Invest. Dermatol, 111, p.645-649), ишемия, системный склероз (Kurasawa et al. (2000) Arthritis Rheum., 43, p.2455-2463), инсульт и другие воспалительные заболевания.

Следовательно, анти-IL-17-соединения имеют потенциал как противовоспалительные агенты, при этом терапевтический подход наряду с рядом исследований in vivo демонстрирует, что нейтрализация IL-17 ослабляет воспалительные процессы, такие как артрит. Например, ранняя нейтрализация эндогенного IL-17 посредством IL-17 рецептор-IgG1-Fc-слитого белка, начинающаяся после протокола иммунизации в течение начальной фазы артрита, подавляет развитие экспериментального артрита (Lubberts et al. (2001) J. Immunol., 167, p.1004-1013). Кроме того, лечение с помощью нейтрализующих анти-IL-17-антител в экспериментальной модели после начала коллаген-индуцированного артрита снижало воспаление суставов, разрушение хрящей и эрозию костей (Lubberts et al. (2004) Arthritis and Rheumatism, 50; 650-659). Гистологический анализ подтвердил подавление воспаления суставов, и системные уровни IL-6 значительно снижались после лечения анти-IL-17-антителами. Для сравнения, системная, а также локальная, сверхэкспрессия IL-17, используя аденовирусный вектор, экспрессирующий мышиный IL-17, ускоряла начало коллаген-индуцированного артрита (CIA) и усиливала синовиальное воспаление на месте (Lubberts et al. (2001) J. Immunol., 167, p.1004-1013 и Lubberts et al. (2002), Inflamm. Res. 51, p102-104).

Несмотря на то, что антитела рутинно используются для аналитических, очистительных, диагностических и терапевтических целей благодаря легкости их получения, высокой аффинности и специфичности к фактически любым желаемым антигенам-мишеням, все еще существует ряд серьезных недостатков, таких как необходимость комплексных систем продукции па основе клеток млекопитающих, зависимость от стабильности дисульфидной связи, тенденция некоторых фрагментов антител агрегировать, ограниченная растворимость и последний, но не менее важный, они могут вызывать нежелательные иммунные ответы, даже если гуманизированны. Вследствие этого, недавние исследования сосредоточились на разработке небольших глобулярных белков в качестве каркасов для создания новых классов универсальных связывающих белков. Для создания разнообразной и прицельной специфичности, обычно поверхностные компоненты (напр., внеклеточные петли) белкового остова с подходящими биофизическими свойствами комбинаторно мутировали для продуцирования библиотеки белков, которую подвергали скринингу для определения специфичностей связывания, вызывающих интерес (Binz, H. К., and Pluckthun, A. (2005) Curr. Opin. Biotechnol. 16, 459-469).

Эти не-иммуноглобулиновые по происхождению связывающие реагенты совместно обозначаются как "каркасы" (Skerra A. (2000) J. Mol. Recognit. 13, 167-187). За последние 10-15 лет предложено более чем 50 разных белковых каркасов, наиболее передовые подходы в этой области следующие (как отмечено в Gebauer M and Skerra A. (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255): аффитела (основанные на Z-домене стафилококкового белка А), домены Кунитц-типа, аднектины (основанные на 10-м домене фибронектина человека), антикалины (полученные из липокалинов), DARPins (полученные из белков с анкириновым повтором), авимеры (основанные на мультимеризованных LDLR-A), аффитины (основанные на Sac7d из гипертермофильного archaeon), и финомеры, которые получают из Fyn SH3-домена человека.

В целом, SH3-домены присутствуют в различных белках, участвующих в трансдукции клеточного сигнала (Musacchio et al. (1994) Prog. Biopbys. Mol. Biol. 61; 283-297). Эти домены не занимают фиксированное положение в белках и могут экспрессироваться и очищаться независимо. Более чем 1000 событий в домене в настоящее время известны среди около 300 SH3-доменов человека (Musacchio A. (2003) Advances in Protein Chemistry. 61; 211-268). Хотя существует огромное разнообразие последовательностей среди доменов SH3, все они имеют консервативный фолд: компактный бета-бочонок, сформированный двумя анти-параллельными бета-слоями (Musacchio A. (2003) Advances in Protein Chemistry. 61; 211-268). Обычно, SH3-домены связываются с пролин-богатыми пептидами, содержащими связывающий мотив РХХР (Ren et al. (1993) Science 259; 1157-1161), но примеры нетрадиционных связывающих участков SH3 также описаны (Karkkainen et al. (2006) EMBO Rep.7; 186-191). Большинство SH3-доменов, уже секвенированных, имеют полную длину приблизительно от 60 до 65 аминокислот, но некоторые из них могут быть более 85 аминокислот вследствие вставок в петли, соединяющие основные консервативные элементы вторичной структуры (Koyama et al. (1993) Cell 72(6); 945-952). Выравнивание разных доменов SH3 раскрывает консервативные аминокислотные остатки, ответственные за образование правильной структуры, а также за узнавание канонического пролин-богатого мотива (Larson et al. (2000) Protein Science 9; 2170-2180).

Недавно изобретатели продемонстрировали, что Fyn SH3-домен является особенно эффективным каркасом ("Fynomer") для создания связывающих белков, поскольку он (i) может экспрессироваться в бактериях в растворимой форме в больших количествах, (ii) является мономерным и не агрегирует при хранении в растворе, (iii) очень стабилен (T_m 70,5°С), (iii) не содержит цистеиновые остатки, и (iv) имеет человеческое происхождение, характеризующееся аминокислотной последовательностью, полностью консервативной от мыши до человека и, вследствие этого, неиммуногенен (Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p.3196-3204).

Цель, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в обеспечении новых IL-17А-связывающих молекул, в частности таких, которые обладают высокой специфичностью и высокой аффинностью для IL-17A. Дополнительной целью является обеспечение IL-17А-связывающих молекул, предпочтительно IL-17 ингибиторов, подходящих для исследования, диагностики и лечения, предпочтительно для применения в лекарственных средствах для лечения и/или профилактики IL-17А-опосредованных заболеваний и медицинских состояний.

Удивительно, вышеуказанные цели достигаются за счет полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i)

где а-h соответствует от 0 до 20,

предпочтительно а соответствует от 1 до 10, более предпочтительно от 2 до 8, наиболее предпочтительно 6;

предпочтительно b соответствует от 0 до 5, более предпочтительно от 1 до 3, наиболее предпочтительно 1;

предпочтительно с соответствует от 0 до 5, более предпочтительно от 1 до 3, наиболее предпочтительно 1;

предпочтительно d соответствует от 1 до 10, более предпочтительно от 3 до 9, наиболее предпочтительно 5 или 7;

предпочтительно е соответствует от 0 до 5, более предпочтительно от 1 до 3, наиболее предпочтительно 1;

предпочтительно f соответствует от 0 до 5, более предпочтительно от 1 до 3, наиболее предпочтительно 1;

предпочтительно g соответствует от 0 до 5, более предпочтительно от 1 до 3, наиболее предпочтительно 1;

предпочтительно h соответствует от 0 до 6, более предпочтительно от 1 до 3, наиболее предпочтительно 1 или 2;

(ii) аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95% идентичности аминокислотных последовательностей с (i);

(iii) аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновой кислотой, которая гибридизируется с комплементарной нитью нуклеиновой кислоты, кодирующей (i), предпочтительно при жестких условиях;

(iv) фрагмента или функциональных производных (i) - (iii), получаемых путем замещения, добавления и/или делеции, по меньшей мере, одной аминокислоты,

где указанный полипептид связывается с IL-17A.

Вышеуказанная общая формула (I) является результатом повторяющегося и экстенсивного мутационного анализа человеческого Fyn SH3-каркаса и селекции, основанной на связывании IL-17A.

Положения, обозначенные как X, могут сильно изменяться для типа аминокислоты(аминокислот) и также количества аминокислот. Предпочтительно, Х не является цистеином. Предпочтительное количество аминокислот для Х указывается подпунктами (а-h), все из которых составляют, предпочтительно, от 0 до 20, более предпочтительно от 0 или 1 до 10.

В нативном человеческом Fyn SH3, (Х)_а и (X)_d будут коррелировать с RT- и Src-петлей, соответственно. Предпочтительно, но не обязательно, что (Х)_а и (X)_d представляют собой петлевую структуру. Известно, что типичные петлевые структуры охватывают от 2 до более чем 20 аминокислот (Larson et al. (2000) Protein Science 9; 2170-2180). Вследствие этого, предпочтительно, что (Х)_а и/или (X)_d имеют от 2 до 20 аминокислот. Предпочтительно, а представляет собой от 1 до 10, более предпочтительно от 2 до 8, наиболее предпочтительно 6. Предпочтительно d представляет собой от 1 до 10, более предпочтительно от 3 до 9, наиболее предпочтительно 5 или 7. Предпочтительно (Х)_а - это TAFWPG, более предпочтительно VAFWPG, наиболее предпочтительно KAFWPG. Предпочтительно (Х)_d - это LNSSE, более предпочтительно TRTSD или LHTSD, наиболее предпочтительно LRTSD.

(Х)_b, (X)_c, (X)_e, (X)_f и (X)_g представляют собой, независимо друг от друга, предпочтительно от 0 до 5, более предпочтительно от 1 до 3, наиболее предпочтительно 1. (Х)_h представляет собой предпочтительно от 0 до 6, более предпочтительно от 1 до 3, наиболее предпочтительно 1.

В наиболее предпочтительном воплощении формула (I) соответствует:

Конечно, существует множество вариаций аминокислотной последовательности формулы (I), которые все еще допускают связывание IL-17A с полипептидом по изобретению. Вследствие этого, настоящее изобретение также охватывает полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 50, 60 или 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95% идентичности аминокислотной последовательности с (i).

В используемом здесь значении, термин "идентичность аминокислотных последовательностей" между аминокислотными последовательностями относится к методам выравнивания и сравнения, общепринятых и широко используемых специалистами в области биохимии. Идентичность аминокислотных последовательностей двух аминокислотных последовательностей может быть определена общепринятыми методами и инструментами выравнивания. Например, для определения степени идентичности аминокислотных последовательностей произвольно выбранного полипептида относительно аминокислотной последовательности формулы (I), можно применять программу определения локальных сходств SIM Local similarity program (Xiaoquin Huang and Webb Miller, "A Time-Efficient, Linear-Space Local Similarity Algorithm." Advances in Applied Mathematics, vol. 12:337-357, 1991.), которая свободно доступна от авторов и их института (см., также Интернет: http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html); для анализа множественного выравнивания можно использовать ClustalW (Thompson et al., „CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice". Nucleic Acids Res., 22(22):4673-4680, 1994.). Предпочтительно, степень идентичности аминокислотных последовательностей полипептида, фрагмента или функциональных производных изобретения с аминокислотной последовательностью формулы (I) определяется относительно полной последовательности формулы (I).

Кроме того, настоящее изобретение также охватывает полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, которая гибридизируется с комплементарной нитью нуклеиновой кислоты, кодирующей (i), предпочтительно при жестких условиях. Другими словами, аминокислотная последовательность, охватываемая полипептидами в соответствии с изобретением, предпочтительно определяется, косвенным образом, кодирующей ее нуклеиновой кислотой, которая все еще способна гибридизироваться с комплементарной нитью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность формулы (I). Гибридизируются ли нуклеиновые кислоты друг с другом, обычно определяется известными из уровня техники специфичными методами выравнивания и сравнения, а также экспериментально. Вслед за общепринятыми и/или стандартными протоколами, известными из уровня техники, для определения способности одной нуклеиновой кислоты гибридизироваться со специфически эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты при жестких условиях (напр., Sambrook and Russell, Molecular cloning: A laboratory manual (3 volumes), 2001), является предпочтительным анализировать и определять способность произвольно выбранной нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, гибридизироваться с комплементарной нитью последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность формулы (I) при жестких условиях, что выполняется посредством сравнения этих двух нуклеотидных последовательностей с помощью инструментов выравнивания, таких как, напр., BLASTN (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) и LALIGN. Наиболее предпочтительно, способность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид интереса, который предположительно является полипептидом по изобретению, гибридизироваться с комплементарной нитью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность формулы (I), подтверждается в анализе Саузерн-блоттинга при следующих условиях: 6х натрия хлорид/натрия цитрат (SSC) при 45°С, с последующим отмыванием в 0,2×SSC, 0,1% SDS при 65°С.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает полипептиды, содержащие фрагмент, предпочтительно функциональный фрагмент, или функциональные производные любых из вышеуказанных аминокислотных последовательностей по изобретению.

Вследствие этого, термин "полипептид или аминокислотная последовательность в соответствии с настоящим изобретением" также охватывает функциональные фрагменты и производные полипептида или аминокислотной последовательности изобретения, имеющие свойства, определенные выше, т.е. способность связывания с IL-17A. Функциональные производные полипептида или аминокислотной последовательности настоящего изобретения охватывают любую аминокислотную последовательность и/или ее химическое производное (неприродные аминокислотные эквиваленты, гликозилирование, химическое получение), которое имеет практически достаточное количество доступных аминокислотных остатков или неприродных эквивалентов для проявления связывания с IL-17A. В функциональных производных полипептида или аминокислотной последовательности изобретения одна или несколько аминокислот могут быть удалены, модифицированы, вставлены и/или замещены. Кроме того, в контексте "функционального производного", вставка относится к вставке одной или нескольких аминокислот в вышеописанные "непроизводные" связывающие белки. Предпочтительно, с возрастающим преимуществом, что функциональное производное содержит не более 5, 4, 3, 2, или не более чем 1 аминокислотное изменение(я) (т.е. удаленные, модифицированные, вставленные и/или замещенные аминокислоты). В другом воплощении, предпочтительно, с возрастающим преимуществом, что изменено не более чем 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или не более чем 1% от всех аминокислот полипептида или аминокислотной последовательности (т.е. являются удаленными, модифицированными, вставленными и/или замещенными аминокислотами). Замещение в производном может быть консервативным или неконсервативным замещением, но предпочтительно является консервативным замещением. В некоторых воплощениях, замещение также включает замену природной аминокислоты на неприродную аминокислоту. Консервативное замещение содержит замещение аминокислоты другой аминокислотой, имеющей химическое свойство, сходное с аминокислотой, которая замещается. Предпочтительно, консервативным замещением является замещение, которое выбирают из группы, состоящей из: (i) замещения основной аминокислоты другой основной аминокислотой; (ii) замещения кислой аминокислоты другой кислой аминокислотой; (iii) замещения ароматической аминокислоты другой ароматической аминокислотой; (iv) замещения неполярной, алифатической аминокислоты другой неполярной, алифатической аминокислотой; и (v) замещения полярной, незаряженной аминокислоты другой полярной, незаряженной аминокислотой. Основную аминокислоту выбирают из группы, состоящей из аргинина, гистидина и лизина. Кислую аминокислоту выбирают из аспартата или глутамата. Ароматическую аминокислоту выбирают из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина и триптофана. Неполярную, алифатическую аминокислоту выбирают из группы, состоящей из глицина, аланина, валина, лейцина, метионина и изолейцина. Полярную, незаряженную аминокислоту выбирают из группы, состоящей из серипа, треонина, цистеина, пролина, аспарагина и глутамина. По сравнению с консервативным аминокислотным замещением, неконсервативное аминокислотное замещение является заменой одной аминокислоты на любую аминокислоту, которая не подпадает под вышеобозначенное(ые) консервативпое(ые) замещение(я) (i) - (v). Если функциональное производное содержит делению, то в производном одна или несколько аминокислот, которые присутствует в исходном полипептиде, удалены. Однако делеция не должна быть сильно обширной, чтобы производное содержало менее чем 3, предпочтительно менее чем 4, более предпочтительно менее чем 5 и наиболее предпочтительно менее чем 6 аминокислот в целом. Как указывалось выше, аминокислоты полипептида или аминокислотной последовательности изобретения также могут быть модифицированы, напр., химически модифицированы. Например, боковая цепь или свободный амино- или карбокси-конец аминокислот полипептида может быть модифицирован, напр., посредством гликозилирования, амидирования, фосфорилирования, убиквитинирования и др. Химическая модификация также может происходить in vivo, напр., в клетке-хозяине, как известно из уровня техники. Например, подходящий химически модифицированный мотив, напр., мотив гликозилирования последовательности, присутствующий в аминокислотной последовательности полипептида, будет делать полипептид гликозилированным. Во всех воплощениях, относящихся к функциональному производному изобретения, необходимо понимать, что аминокислотная последовательность, имеющая формулу (I), как определено здесь выше, является исходной молекулой, в которую вводится функциональное производное. В случае вставки в двух исходных молекулах, имеющих идентичные последовательности, за исключением того, что в первой молекуле Х_а эквивалентен 4 и во второй молекуле Х_а эквивалентен 5, будут получаться молекулы идентичной длины и, возможно, с идентичной аминокислотной последовательностью, если вставка, напр., в С-конце Х_а состоит из двух аминокислот в первой молекуле и одной аминокислоты во второй молекуле.

Полипептиды настоящего изобретения связывают IL-17A, предпочтительно IL-17A человека. Предпочтительно, они связываются специфически с IL-17A, т.е. они не связываются с другими цитокинами или связывают их в меньшей степени, предпочтительно, по меньшей мере, в 2, 5, 10, 50, 100, 500 или 1000 раз меньшей. Примерный и предпочтительный анализ ELISA для определения связывающей специфичности полипептидов настоящего изобретения обеспечивается в примерах 6 и 7.

В предпочтительном воплощении, полипептиды настоящего изобретения связывают IL-17A человека и мартышек специфично и с высокой аффинностью связывания.

В дополнительных предпочтительных воплощениях, полипептиды изобретения имеют специфическую (in vivo и/или in vitro) аффинность связывания с человеческим IL-17А, предпочтительно с K_D от 10^-7 до 10^-12 М, более предпочтительно от 10^-8 до 10^-12 М, наиболее предпочтительно менее чем 10^-12 М. Например и также предпочтительно, аффинность связывания полипептидов настоящего изобретения может быть определена в соответствии с Примером 2 ниже.

В наиболее предпочтительном воплощении, полипептиды настоящего изобретения выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-119 или их функциональных производных, которые приложены к описанию.

В предпочтительном воплощении полипептиды настоящего изобретения не только связывают, но и фактически ингибируют IL-17A (функцию). Эта способность продемонстрирована в Примерах 3 и 10, в которых показана способность полипептидов ингибировать индукцию IL-6 в фибробластах кожи человека в ответ на добавление IL-17A.

Кроме того, полипептиды настоящего изобретения обладают высокой стабильностью в растворе, напр., они стабильны при температуре 4°С в течение, по меньшей мере, 6 месяцев в нормальном забуференном фосфатом физиологическом растворе (см. Пример 4).

Однако, стабильность не ограничивается композициями in vitro, но еще и подтверждена у мышей, которым полипептид настоящего изобретения был введен внутривенно (см. Примеры 5 и 12).

В заключение необходимо отметить, что полипептиды настоящего изобретения хорошо подходят для исследовательских, диагностических и медицинских целей.

Наряду с замещением IL-17А-антител, их также можно применять для создания новых и менее иммуногенных слитых белков для фармацевтических и диагностических применений in vivo и in vitro. Таким образом, во втором аспекте, изобретение относится к слитому белку, содержащему полипептид изобретения, который слит с фармацевтически и/или диагностически активным компонентом.

Как указывалось, слитый белок изобретения может содержать неполипептидные компоненты, напр., непептидные линкеры, непептидные лиганды, напр., для радионуклеидов, подходящих для терапевтических или диагностических целей.

Предпочтительно, указанным активным компонентом является цитокин, выбранный из группы, состоящей из IL-2, IL-12, TNF-альфа, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, В70, TNF-бета, LT-бета, CD-40-лиганд, Fas-лиганд, TGF-бета, IL-1-альфа и IL-1-бета.

В другом предпочтительном воплощении, указанным активным компонентом является токсичное соединение, предпочтительно низкомолекулярное органическое соединение или полипептид, более предпочтительно токсичное соединение выбирают из группы, состоящей из калихемицина, майтансиноида, неокарциностатина, эсперамицина, динемицина, кедарцидина, мадуропептина, доксорубицина, даунорубицина, ауристатина, А-цепи рицина, модеккина, укороченного экзотоксина A Pseudomonas, дифтерийного токсина и рекомбинантного гелонина.

В другом предпочтительном воплощении, слитый белок изобретения представляет собой такой белок, в котором указанным активным компонентом является хемокин, который предпочтительно выбирают из группы, состоящей из IL-8, GRO-альфа, GRO-бета, GRO-гамма, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1-альфа/бета, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, М1Р-1альфа, MIP-1 бета, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP-3-альфа, MIP-3-бета, MCP-1-5, эотаксина, эотаксина-2,1-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, лимфотактина и фракталкина.

В дополнительном предпочтительном воплощении, полипептид или слитый белок согласно изобретению содержит искусственные аминокислоты.

В дополнительных предпочтительных воплощениях слитого белка настоящего изобретения, указанным активным компонентом является флуоресцентный краситель, предпочтительно компонент, выбранный из групп Alexa Fluor или красителей Су (Berlier et al. „Quantitative Comparison of Long-wavelength Alexa Fluor Dyes to Cy Dyes: Fluorescence of the Dyes and Their Bioconjugates", J. Histochem. Cytochem. 51 (12):1699-1712, 2003.); фотосенсибилизатор, предпочтительно фототоксичный красный флуоресцентный белок KillerRed (Bulina et al. (2006) Nat Biotechnol., 24, 95-99) или гематопорфирин; прокоагулянтный фактор, предпочтительно тканевый фактор; фермент для активации пролекарств, предпочтительно фермент, который выбирают из группы, состоящей из карбоксипептидаз, глюкуронидаз и глюкозидаз; радионуклид, либо из группы гамма-излучающих изотопов, предпочтительно ^99mTc, ¹²³I, ¹¹¹In, либо из группы излучателей позитронов, предпочтительно ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸⁶Y, ¹²⁴I, либо из группы бета-излучателей, предпочтительно ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁷Cu, либо из группы альфа-излучателей, предпочтительно ²¹³Bi, ²¹¹At.

В другом предпочтительном воплощении, полипептид настоящего изобретения может быть прикреплен непосредственно или посредством химического линкера к одному или нескольким неполипептидным компонентам, как указано здесь выше.

В более предпочтительном воплощении слитого белка настоящего изобретения, указанным активным компонентом является один или несколько функциональных Fc-доменов, предпочтительно один или несколько функциональных Fc-доменов человека (см., например, SEQ ID NO:117-119 и SEQ ID NO:130), которые(ый) позволяют(ет) продлить время полужизни in vivo (период полувыведения) IL-17А-связывающих полипептидов изобретения и некоторые из которых направляют иммунный ответ млекопитающих в сторону специфического направленного связывания полипептидного компонента слитого белка по изобретению, напр., в терапевтических, профилактических и/или диагностических целях. Полипептиды изобретения могут быть слиты либо с N- или с С-концом одного или нескольких функциональных Fc-доменов либо с обоими N- и C-концами одного или нескольких Fc-доменов. Предпочтительно, что слитые белки изобретения содержат мультимеры, предпочтительно тетрамеры, тримеры или наиболее предпочтительно димеры полипептидов изобретения, слитых с, по меньшей мере, одной частью, предпочтительно с N-концом одного или нескольких, предпочтительно одного Fc-домена. В этом отношении, необходимо отметить, что слитый белок Fynomer-Fynomer-Fc, обозначаемый (2Cl)₂-Fc, демонстрирует преимущество мультимерных слияний полипептид-Fc, которые имеют более высокую аффинность к IL-17A, чем соответствующий мономерный слитый белок 2C1-Fc, как продемонстрировано ниже на Фиг.3е и 3f и Таблице II Примера 2. Вследствие этого, предпочтительное воплощение изобретения направлено на мультимерные слитые белки полипептид-Fc.

"Функциональный Fc-домен" антитела является термином, хорошо известным для квалифицированного специалиста в данной области, и определяется на основе папаинового расщепления антител. В зависимости от аминокислотной последовательности константного участка тяжелых цепей, иммуноглобулины подразделяются на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), напр., IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA1, и IgA2. В соответствии с константными участками тяжелых цепей различные классы иммуноглобулинов называются [альфа], [дельта], [эпсилон], [гамма] и [мю], соответственно. Функциональный Fc-домен антитела непосредственно включается в ADCC (антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность) и CDC (комплемент-зависимая цитотоксичность), основываясь на активацию комплемента, C1q-связывание и Fc-рецепторное связывание. Четыре изотипа IgG человека связывают разные рецепторы, такие как неонатальный Fc-рецептор, активирующие Fc-гамма рецепторы, FcγRI, FcγRIIa и FcγRIIIa, ингибирующий рецептор FcγRIIb и C1q с разными аффинностями, получая очень разные активности. Известно, что аффинности к активирующим и ингибирующему рецепторам Fc-домена антитела человека могут быть сконструированы и модифицированы (см., Strohl W. (2009) Curr Opin Biotechnol, 20, p.685-691). Следовательно, как указывалось выше, изобретение содержит Fc-слияние(я), которое(ые) позволяет(ют) увеличить время полужизни in vivo IL-17А-связывающих полипептидов изобретения, и которое(ые) содержит функциональный Fc-домен человеческого происхождения, предпочтительно, человеческий функциональный Fc-домен антитела IgG1 (см., например, SEQ ID NO:117-119 и SEQ ID NO:130).

В более предпочтительном воплощении слитого белка настоящего изобретения активным компонентом является один или несколько рекомбинантных функциональных Fc-доменов IgG1 человека с активированными или подавленными эффекторными функциями, предпочтительно один или несколько рекомбинантных функциональных Fc-доменов IgG1 человека с подавленными эффекторными функциями, и наиболее предпочтительно один или несколько рекомбинантных функциональных Fc-доменов IgG1 человека с подавленными эффекторными функциями с мутацией в L234 и L235 (см., например, SEQ ID NO:131-135), кодирование согласно номенклатуре Кэбата (см. Johnson G. and Wu T.T. (2000) Nucleic Acids Res. 28, p.214-218).

Дополнительное предпочтительное воплощение относится к полипептидам или слитым белкам изобретения, как указывалось выше, которые дополнительно содержат компонент, модулирующий время полужизни в сыворотке, причем компонент предпочтительно выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), иммуноглобулина и альбуминсвязывающих пептидов.

Кроме того, предпочтительно, что слитый белок изобретения содержит любой из вышеуказанных заявляемых IL-17А-связывающих полипептидов, предпочтительно тот, который выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:117-119 и SEQ ID NO:130-135, или его функциональное производное.

Необходимо отметить, что полипептид или слитый белок изобретения предпочтительно является мономерным, но также охватываются и мультимеры, предпочтительно тетрамеры, более предпочтительно тримеры, или наиболее предпочтительно димеры заявляемых полипептидов.

Полипептиды и слитые белки изобретения могут быть приготовлены с помощью любого из многих традиционных и хорошо известных способов, таких как обычные стратегии синтеза органических соединений, техника твердофазного синтеза или с помощью коммерчески доступных автоматических синтезаторов. С другой стороны, их также можно приготовить с помощью традиционных рекомбинантных технологий самих по себе или в комбинации с общепринятыми способами синтеза.

В связи с этим, дополнительные аспекты настоящего изобретения относятся к (i) нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид или слитый белок изобретения, (ii) вектору, содержащему указанную нуклеиновую кислоту, и (iii) к клетке-хозяину, содержащему указанный полинуклеотид и/или указанный вектор.

Предпочтительно, изобретение относится к изолированной и очищенной нуклеиновой кислоте, содержащей

(i) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид изобретения, предпочтительно кодирующую аминокислотную последовательность формулы (I), более предпочтительно

(G/E)VTLFVALYDY-(X)₆-D-(X)-SFHKGEKF-(X)₁-I-(X)_5-7-G-(X)₁-WW-(X)-A-(X)-SLTTG-(X)_1-2-GYIPSNYVAPVDSIQ;

(ii) нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность, по меньшей мере, 60 или 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере, 95% идентичность последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты (i);

(iii) нуклеиновую кислоту, которая гибридизируется с комплементарной нитью нуклеиновой кислоты из (i) или (ii);

(iv) нуклеиновую кислоту, при этом указанную нуклеиновую кислоту получают путем замены, добавления и/или удаления в одной из нуклеиновых кислот из (i), (ii) или

(iii);

(v) фрагмент любой из нуклеиновых кислот из (i) - (iv), которая гибридизируется с комплементарной нитью нуклеиновой кислоты из (I), кодирующей полипептид изобретения.

Более предпочтительно, нуклеиновая кислота изобретения содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид или слитый белок, как описано выше. В этой связи, следует понимать, что любая из нуклеиновых кислот (i) - (v), выше, предпочтительно кодирует полипептид, который связывает IL-17A и более предпочтительно ингибирует функцию IL-17A.

Нуклеиновыми кислотами изобретения могут быть ДНК, РНК, ПНК и любые другие их аналоги. Векторами и клетками-хозяевами может быть любой общепринятый тип, который подходит для цели, напр., получения полипептидов и/или слитых белков изобретения, терапевтического применения векторов и клеток-хозяев, напр., для генной терапии. Специалист в данной области способен выбрать такие нуклеиновые кислоты, векторы и клетки-хозяева из широкого уровня техники и подтвердить их конкретную пригодность для желаемой цели, применяя рутинные способы и без чрезмерных трудов.

Предпочтительно нуклеиновая кислота функционально связана с промотором, предпочтительно связана с промотором, который выбирают из группы прокариотических промоторов, состоящей из Т5-промотор/lac-оператор элемента, Т7-промотор/lac-оператор элемента, или из группы эукариотических промоторов, состоящей из hEF1-HTLV, CMV enh/hFerL-промотора.

Также является предпочтительным, что рекомбинантный вектор изобретения представляет собой вектор, содержащий нуклеиновую кислоту изобретения и предпочтительно способный продуцировать полипептид или слитый белок изобретения. Предпочтительно такой вектор выбирают из группы, состоящей из pQE-векторов, рЕТ-векторов, pFUSE-векторов, pUC-векторов, YAC-векторов, фамидных векторов, фаговых векторов, векторов, применяемых в генной терапии, таких как ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы.

В дополнение, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту и/или вектор изобретения.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает антитело, которое специфически связывается с полипептидом или слитым белком изобретения. Если антитело связывается со слитым белком, то оно специфически связывается с его частью, которая состоит из полипептида изобретения или слитого эпитопа, т.е. со связывающим сайтом антитела, частично состоящего из полипептида изобретения и частично состоящего из фармацевтически и/или диагностически активного компонента, которым является предпочтительно полипептид или пептид. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными антителами. В используемом здесь значении, термин "антитело" относится не только к целым молекулам антитела, но также и к антигенсвязывающим фрагментам, напр., Fab, F(ab')₂, Fv, и одноцепочечным Fv-фрагментам. Также включены химерные антитела, предпочтительно гуманизированные антитела. Такие антитела применимы в качестве исследовател