Система микроскопии с ослаблением стимулированного излучения

Система микроскопии с ослаблением стимулированного излучения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к системе оптической микроскопии для ослабления стимулированного излучения (STED) и к соответствующему способу проведения микроскопии с такой системой. Изобретение относится также к соответствующей оптической подсистеме, предпочтительно, составляющей часть эндоскопа, катетера, иглы или подобных устройств для формирования медицинских изображений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В микроскопии с ослаблением стимулированного излучения (STED) может быть достигнуто разрешение изображения, гораздо выше дифракционного предела традиционной микроскопии (см, например, Фиг.2 в статье "Масштабирование разрешения в STED-микроскопии" - B. Harke, J. Keller, C.K. Ullal, V. Westphal, A. Schönle and S.W. Hell, “Resolution scaling in STED microscopy”, Optics Express 16 (2008), p. 4154-4162). В STED-микроскопии посредством системы импульсного лазера производится возбуждение флуоресцентного маркера. Спустя короткое время после этого возбуждения, а именно в течение времени угасания флуоресценции, подается импульс второго лазера, имеющего длину волны, близкую к длине волны испускания флуоресценции. Импульс второго лазера дает кольцевую форму светового пятна (или другую подобную форму, отличную от формы пятна первого импульса). Вследствие стимулированного излучения этот второй импульс подавит возбуждение флуоресцентных молекул внутри области кольцевого пятна. Однако возбуждение молекул в центре кольца погашено не будет. Эта центральная область обычно меньше, чем размер пятна обычного микроскопа, ограниченный дифракцией. Следовательно, обнаружение флуоресценции, исходящей из остающихся после двух лазерных импульсов возбужденных молекул, производится в области, меньшей, чем дифракционный предел, и, значит, при этом достигается разрешение, ограниченное "субдифракцией". В последнее время это привлекало определенное внимание.

Для генерации двух импульсных лазерных лучей обычно используется показанная на Фиг.1 оптическая установка, взятая из вышеуказанной статьи Harke и др. Она накладывает жесткие ограничения на юстировку луча по всем трем пространственным измерениям, и обычно вследствие механического, теплового и/или оптического ухода луча в эту оптическую установку требуется периодически настраивать. Кроме того, для получения светового пятна кольцевой формы луч ослабления требует иных оптических компонентов. Подобным же образом наличие двух лазерных лучей налагает ограничения на возможное масштабирование STED-микроскопии, что представляет собой огромную важность при формировании in vivo изображений в медицине и биологии.

В связи с волоконно-оптическим сканером - см., например, международную патентную заявку WO 2009087527 авторов настоящего документа - можно упомянуть, что для использования в таких задачах обычно предпочтительно иметь общий оптический путь для луча возбуждения и для STED-луча.

Международная патентная заявка WO 2008/145371 раскрывает оптический узел, пригодный для STED-микроскопии, в которой два световых импульсных луча имеют общий оптический путь. Ослабленное излучение обеспечивается оптическим компонентом, имеющим две смежные области с различным характером дисперсии, вызывающим соответствующий фазовый сдвиг. Этими двумя областями могут быть, например, твердый материал и масло или два разных твердых материала в различных конфигурациях.

Авторы настоящего изобретения оценили преимущества STED-микроскопии и, как следствие этого, разработали настоящее изобретение.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Было бы желательно разработать систему микроскопии с улучшенными характеристиками. Желательно было бы также создать более компактную и/или надежную систему микроскопии. Вообще говоря, изобретение направлено, главным образом, на "смягчение", уменьшение или устранение одного или более из вышеупомянутых недостатков по отдельности или в любой их комбинации. В частности, в качестве цели настоящего изобретения может рассматриваться разработка способа, который решает вышеупомянутые проблемы или иные проблемы предшествующего уровня техники.

Для более полного решения одной или более этих проблем первый аспект настоящего изобретения относится к системе оптической микроскопии для ослабления стимулированного излучения (STED) исследуемого объекта, причем данная система содержит:

средство генерации излучения, выполненное с возможностью испускать первый и второй лучи, причем первый луч является лучом возбуждения, а второй луч является лучом ослабления по отношению к первому лучу;

оптический элемент для фокусировки первого и второго лучей на объекте, причем этот оптический элемент расположен относительно средства генерации излучения для определения общего оптического пути для обоих первого и второго лучей, и

элемент изменения фазы, введенный в упомянутый общий оптический путь,

при этом элемент изменения фазы оптически сконфигурирован таким образом, чтобы оставлять по существу неизменным волновой фронт первого луча и изменять волновой фронт второго луча, чтобы создавать представляющую интерес неослабленную область на объекте,

при этом элемент (5) изменения фазы выполнен с возможностью изменять волновой фронт второго луча (2) за счет того, что имеет поверхность с множеством областей, содержащих первую и вторую области (31, 32, 33), причем первая область имеет выступающую высоту, которая выше высоты второй области, и

при этом множество областей поверхности элемента (5) изменения фазы изготовлено в одном оптическом материале.

Настоящее изобретение является особенно, но не исключительно, полезным для создания более компактной и/или надежной системы STED-микроскопии, в которой первый луч возбуждения и второй луч ослабления имеют общий оптический путь, в том виде, как он определен фокусирующим эти лучи оптическим элементом, обусловленный элементом изменения фазы, адаптирующим волновой фронт или фазу таким образом, что он никак не влияет на первый луч и в то же время вызывает изменение волнового фронта или изменение фазы второго луча, что приводит к появлению ослабленной области в исследуемом объекте (то есть в световом пятне кольцевой формы) в фокальной плоскости.

Следует отметить, что до сих пор в данной области техники для получения, например, луча кольцевой формы на пути одного из двух импульсных лазерных лучей STED-установки помещалась фазовая пластина. Недостатком такой конструкции являлось то, что эта фазовая пластина должна находиться в одном из лучей, и не может быть помещена в оба луча одновременно. Таким образом, когда производится "встраивание" STED-технологии в миниатюрный микроскоп, такой как волоконный сканер, это неудобство ранее ограничивало возможность увеличения масштабирования миниатюрного микроскопа. В связи с волоконно-оптическим сканером - см., например, международную патентную заявку WO 2009087527 авторов настоящего документа, которая во всей своей полноте включена сюда посредством ссылки, следует отметить, что для таких применений элемент изменения фазы может быть помещен между волокном 2 и объективом 6а на Фиг.4 в WO 2009087527.

Следует понимать, что в контексте настоящего изобретения элемент изменения фазы не оказывает никакого или по существу никакого эффекта на первый луч возбуждения в том смысле, что с практической точки зрения им, как правило, будет вызвано небольшое изменение волнового фронта или фазы, но это изменение не оказывает никаких последствий или оказывает по меньшей мере незначительные воздействия на полученное ослаблением стимулированного излучения изображение. Далее это будет объяснено более подробно.

При наличии выступа или ступени между высотами первой и второй областей элемент изменения фазы можно изготовить относительно простым способом, например использованием одного куска материала, в котором способом высокоточной обработки, обычно с субмикронной точностью выполняется ступенька по высоте. Нет необходимости говорить, что это может быть обобществлено на более чем две области, то есть на три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и т.д. областей, при этом каждая область имеет выступ, который соответствует общей технической цели, для которой предназначен этот элемент изменения фазы. Это возможно с использованием техники, известной из области производства высокоточных линз; см., например, Japanese Journal of Applied Physics, Vol. 44, No. 9A, 2005, pp. 6564-6567, Miniaturised High-Numerical Aperture Singlet Plastic Objective for Optical Recording, by B.H.W. Hendrics et al и Small Form Factor Optical Drive: Miniaturised Plastic High-NA Objective and Optical Drive by M.A.H. van der Aa et al в Трудах Объединенного международного симпозиума по оптической памяти и оптическому сохранению информации (Proceedings from Joint International Symposium on Optical Memory and Optical Data Storage 2002, IEEE, p. 251-253), причем обе публикации во всей своей полноте включены в данный документ посредством ссылки. Все это имеет особенное преимущество по сравнению с использованием двух или более различных оптических материалов для достижения технического эффекта по настоящему изобретению, что обычно требует относительно сложной подгонки или согласования оптических, тепловых и механических параметров.

В имеющем дополнительные преимущества варианте осуществления элемент изменения фазы может быть выполнен с возможностью оставлять волновой фронт первого луча по существу неизменным посредством изменения фазы первого луча 2π по модулю. Таким образом, отпадает необходимость, например, в подгонке оптических свойств двух или более материалов.

Следующим, достойным упоминания преимуществом является тот факт, что для элемента изменения фазы требуемый перепад высот, вообще говоря, относительно мал (порядка нескольких микрон), что делает этот элемент с точки зрения изготовления относительно простым. Кроме того, ширина ступенек относительно высоты ступенек может быть большой. Эти свойства структуры со ступенчатым изменением фазы делают их легкими в изготовлении с использованием современной технологии производства линз (см. вышеприведенные ссылки).

В вышеприведенном предпочтительном варианте осуществления, в котором элемент изменения фазы обладает возможностью изменения волнового фронта второго луча за счет того, что имеет поверхность с множеством областей, содержащих первую и вторую области, причем первая область имеет выступающую высоту, которая выше высоты второй области, эта поверхность может быть внешней поверхностью элемента изменения фазы, что обуславливает простое изготовление. Дополнительно или альтернативно, элемент изменения фазы может быть способен оставлять волновой фронт первого луча по существу неизменным посредством изменения фазы первого луча на 2π по модулю. Для увеличения простоты и/или легкости изготовления множество областей поверхности элемента изменения фазы изготовлено из одного оптического материала, предпочтительно, весь элемент изменения фазы может быть изготовлен из одного оптического материала.

В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере упомянутый оптический элемент и элемент изменения фазы расположены в эндоскопе, катетере, игле или игле для формирования медицинских изображений, например для формирования оптических изображений in vivo, когда требования к миниатюризации особенно высокие.

В одном варианте осуществления элемент изменения фазы может иметь азимутальную конфигурацию, при которой каждая область из этого множества областей расположена внутри интервала азимутальных углов. Предпочтительно, чтобы общий оптический путь проходил через центральное или по существу центральное положение элемента изменения фазы. Кроме того, множество областей на поверхности элемента изменения фазы может иметь последовательно увеличивающиеся высоты вдоль азимутальной координаты, то есть дискретные ступени - 3, 4, 5 или больше, (см. Фиг.3 и нижеследующее соответствующее пояснение). В других вариантах множество областей может не иметь последовательно увеличивающихся высот на поверхности элемента изменения фазы, а скорее - может иметь уменьшающиеся и увеличивающиеся высоты вдоль азимутальной координаты.

В частном варианте осуществления высоты на поверхности элемента изменения фазы могут иметь такое распределение по высоте, что измененная фаза второго луча как функция азимутального угла Ф(φ) приблизительно равна этому азимутальному углу:

Строго говоря, это условие может выполняться только для непрерывного распределения по высоте, но для различных распределений по высоте оно может быть приемлемо аппроксимировано. Альтернативно, это условие может быть аппроксимировано по среднему углу секторов.

В следующем частном варианте осуществления амплитуда U в пятне второго луча в фокальной плоскости фокусирующего оптического элемента может быть приблизительно нулевой в центральном положении оптического пути (r=0), при требовании, чтобы элемент изменения фазы приблизительно удовлетворял следующему равенству:

где k обозначает номер сектора, Ф_k - фазу сектора, w_k - размер сектора, который равен конечному углу минус начальный угол сектора k.

В качестве альтернативы так называемой кольцевой конфигурации это равенство определяет диапазон других оптических конфигураций элемента изменения фазы, удовлетворяющих основному требованию ослабления стимулированного излучения (STED).

В альтернативном варианте осуществления амплитуда U в пятне второго луча в фокальной плоскости фокусирующего оптического элемента может иметь приблизительно круговую симметрию относительно общего оптического пути, при требовании, чтобы элемент изменения фазы приблизительно удовлетворял следующим равенствам:

где k обозначает номер сектора, Ф_k - фазу сектора, w_k - размер сектора, который равен конечному углу минус начальный угол сектора k.

Таким образом, два этих равенства определяют для специалистов в данной области техники правила конструирования, которые позволяют реализовывать многочисленные оптические варианты осуществления элемента изменения фазы в соответствии с настоящим изобретением.

В другом варианте осуществления первая и вторая области элемента изменения фазы могут быть вращательно симметричными относительно общего оптического пути. Это дает возможность реализации простых и имеющих свои преимущества вариантов осуществления настоящего изобретения - см. Фиг.10 и соответствующее нижеприведенное описание.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к оптическому подблоку, выполненному с возможностью формирования оптических изображений исследуемого объекта с использованием ослабления стимулированного излучения (STED) в связанной с ним системе оптической микроскопии, при этом система оптической микроскопии содержит средство генерации излучения, выполненное с возможностью испускать первый и второй лучи, причем первый луч является лучом возбуждения, а второй луч является лучом ослабления по отношению к первому лучу, и этот оптический подблок содержит:

оптическое средство для направления первого и второго лучей через подблок;

оптический элемент для фокусировки первого и второго лучей на объекте, причем этот оптический элемент расположен относительно средства генерации излучения для определения общего оптического пути для обоих первого и второго лучей, и

элемент изменения фазы, введенный в упомянутый общий оптический путь,

при этом элемент изменения фазы оптически сконфигурирован таким образом, чтобы оставлять по существу неизменным волновой фронт первого луча и изменять волновой фронт второго луча, чтобы создавать представляющую интерес неослабленную область на объекте.

Оптический подблок предпочтительно может быть выполнен с возможностью формирования оптических изображений исследуемого объекта с использованием ослабления стимулированного излучения (STED) в связанной с ним системе оптической микроскопии в соответствии с первым аспектом изобретения, при этом этот оптический подблок образует часть эндоскопа, катетера, иглы или биопсийной иглы для формирования медицинских изображений. В соответствии с раскрытием и общими принципами настоящего изобретения можно представить и другие типы устройств формирования изображения, в том числе немедицинского назначения. В области медицины это изобретение особенно предпочтительно, поскольку устройства такого рода, как правило, после одноразового использования в соответствии с санитарными правилами выбрасываются, и относительно простое производство этих медицинских устройств в соответствии с настоящим изобретением благоприятствует более широкому использованию и применению обладающих преимуществами медицинских устройств.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу проведения оптической микроскопии с ослаблением стимулированного излучения (STED) исследуемого объекта, при этом данный способ включает в себя:

испускание излучения, образующего первый и второй лучи, причем первый луч является лучом возбуждения, а второй луч является лучом ослабления по отношению к первому лучу,

фокусировку первого и второго лучей на объекте с использованием оптического элемента, причем этот оптический элемент определяет общий оптический путь для обоих первого и второго лучей, и

введение в упомянутый общий оптический путь элемента изменения фазы,

при этом элемент изменения фазы оптически сконфигурирован таким образом, чтобы оставлять по существу неизменным волновой фронт первого луча и изменять волновой фронт второго луча, чтобы создавать представляющую интерес неослабленную область на объекте. Изобретение в соответствии с данным аспектом является особенно предпочтительным в том, что некоторые системы оптической STED-микроскопии могут быть модифицированы и/или доработаны с тем, чтобы использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

Вообще говоря, различные аспекты настоящего изобретения внутри объема настоящего изобретения могут быть скомбинированы и соединены между собой любым возможным образом. Эти и другие объекты, признаки и/или преимущества настоящего изобретения станут очевидными после рассмотрения нижеописанных вариантов осуществления и будучи поясненными ими.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Варианты осуществления настоящего изобретения будут описаны далее - всего лишь в качестве примеров - со ссылками на чертежи, на которых:

Фиг.1 - схематичный чертеж системы STED оптической микроскопии в соответствии с настоящим изобретением;

Фиг.2 - схематичная иллюстрация волновых фронтов первого и второго лучей в соответствии с настоящим изобретением;

Фиг.3 - более подробная схематичная иллюстрация элемента изменения фазы с азимутальной конфигурацией в соответствии с настоящим изобретением;

Фиг.4-6 - 3 набора графиков, представляющих соответствующую фазу в зависимости от угла (слева) и результирующее распределение светового пятна в фокальной плоскости в зависимости от масштабированного радиального расстояния (справа);

Фиг.7 и 8 - соответственно, двумерные распределения интенсивности световых пятен, созданные элементом изменения фазы по Таблицам 2-4, а также профили интенсивности идеального элемента изменения фазы с секторами одинаковых размеров;

Фиг.9 - двумерные распределения интенсивности светового пятна, созданные элементом изменения фазы с 7 секторами;

Фиг.10 - вариант осуществления ступенчатого элемента изменения фазы с круговой конфигурацией в соответствии с другим вариантом исполнения настоящего изобретения;

Фиг.11 - оптический подблок в соответствии с настоящим изобретением;

Фиг.12 - блок-схема последовательности этапов способа в соответствии с настоящим изобретением.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Фиг.1 представляет схематичный чертеж системы 10 STED оптической микроскопии в соответствии с настоящим изобретением. Система 10 оптической микроскопии адаптирована под построение изображений исследуемого объекта О (который сам по себе не является частью оптической системы) посредством ослабления стимулированного излучения (STED), - подробные технические детали способа STED - см в статье B. Harke, J. Keller, C.K. Ullal, V. Westphal, A. Schönle and S,W, Hell, “Resolution scaling in STED microscopy”, Optics Express 16 (2008) p. 4154-4162), которая во всей своей полноте включена в данный документ посредством ссылки.

Оптическая система 10 содержит средство 5 генерации излучения, например два или большее количество импульсных лазеров или один перестраиваемый лазер, или же иные подходящие генераторы излучения, способные испускать по меньшей мере первый луч 1 и второй луч 2. Первый луч 1 является лучом возбуждения, например, для построения флуоресцентного изображения объекта, а второй луч 2 является лучом ослабления по отношению к первому лучу 1, обычно с энергетическим смещением в красную область, то есть является низкоэнергетическим лучом, предназначенным для ослабления излучения в зоне объекта О.

Дополнительно имеется оптический элемент 6, например объектив или другой компонент, имеющий ненулевую оптическую силу. Этот оптический элемент расположен относительно средства 7 генерации излучения с целью формирования общего оптического пути ОР для обоих лучей - первого луча 1 и второго луча 2. На Фиг.1 первый луч 1 и второй луч 2 смещены вертикально просто для ясности изображения на рисунке, в реальных исполнениях для использования лучей их пространственное перекрытие делается максимально возможно большим.

Далее, в упомянутый общий оптический путь ОР введен элемент 5 изменения фазы, причем этот элемент 5 изменения фазы оптически сконфигурирован таким образом, чтобы оставлять по существу неизменным волновой фронт первого луча 1, но изменять волновой фронт второго луча 2, чтобы создавать на объекте О представляющую интерес неослабленную область. Другими словами, элемент 5 изменения фазы оптически сконфигурирован таким образом, чтобы изменять фазу первого луча на результат произведения целого числа и 2π, то есть эффективно оставлять эту фазу неизменной, а также чтобы изменять фазу второго луча на величину, отличную от результата произведения целого числа и 2π, и тем самым создавать на объекте представляющую интерес неослабленную область. Это облегчает использование оптического пути, предназначенного для одного луча, то есть вдоль общего оптического пути, что в сочетании с принципами STED-микроскопии обеспечивает многочисленные преимущества, в частности, более простую в использовании и/или более компактную оптическую конструкцию.

Предусмотрено, что элемент 5 изменения фазы и оптический элемент 6 могут быть собраны в один объект (не показан), имеющий аналогичные или эквивалентные функции, как в этих двух отдельных элементах.

Фиг.2 представляет схематичную иллюстрацию волновых фронтов первого 1 и второго 2 лучей в соответствии с настоящим изобретением вдоль оптического пути ОР, на которой эти два луча показаны в два разных момента времени; в момент времени A "EXCIT" первый, возбуждающий луч 1 показан проходящим через элемент 5 изменения фазы при неизмененном волновом фронте или, что то же самое, при отсутствии оптических аберраций первого луча. Следует отметить, что это обычно сильно зависит от длины волны первого луча 1.

Затем в момент времени В "STED" волновые фронты второго луча 2 ослабления показаны проходящими через элемент 5 изменения фазы, в результате чего волновые фронты 2' изменены, что условно показано изломами в волновых фронтах 2'. Размерности изменения волнового фронта второго луча 2 должны быть такими, чтобы в объекте О образовалась представляющая интерес неослабленная область ROI. Далее это будет пояснено более подробно.

С правой стороны на Фиг.2 для разных моментов времени показаны соответствующие фокальные плоскости FP; в момент времени A "EXCIT" круг освещен излучением, способным вызвать, например, флуоресценцию в объекте О. В момент времени В "STED" измененный луч 2' ослабления вызывает ослабление излучения в круговой области, что на Фиг.2 условно показано черным цветом вокруг круговой неослабленной области. В более поздний момент времени С "ROI" флуоресценция, в зависимости от степени ослабления - только или главным образом будет исходить из представляющей интерес центральной области ROI, которая может иметь пространственную протяженность (диаметр круга), меньшую длины волны флуоресцентного излучения, то есть меньше дифракционного предела.

Фиг.3 представляет более подробную схематичную иллюстрацию элемента 5 изменения фазы с азимутальной конфигурацией в соответствии с настоящим изобретением. Под азимутальной конфигурацией понимается конфигурация, которая может быть корректно представлена или аппроксимирована конфигурацией, описанной в обычных цилиндрических координатах относительно центральной оси, то есть общего оптического пути. Показанный на Фиг.3 элемент 5 содержит три области или азимутальных сектора 31, 32 и 33, где элемент 5 изменения фазы может изменять волновой фронт второго луча 2 посредством того, что он имеет поверхность с множеством областей, включающих по меньшей мере первую 31, вторую 32 и третью 33 области, причем вторая область 32 имеет выступающую высоту h, которая выше высоты первой области 31, и, далее, третья область или сектор 33 имеет высоту над второй областью 32. Это иллюстрируется на графике под элементом 5, показывающем высоту h в зависимости от азимутального угла φ.

Следует заметить, что поверхность элемента 5 может быть сопряжена с другим оптическим материалом или веществом, например стеклом, полимером или воздухом, так что при конструировании элемента изменения фазы следует принимать во внимание эффективное изменение волнового фронта. Обычно для простоты процесса изготовления элемент 5 может быть выполнен из одного материала, например, такого как материал РММА, поликарбонат, материал СОС, отверждаемая смола, такая как диакрил. Таким образом, области разной высоты могут располагаться на внешней поверхности элемента 5, что также показано на Фиг.3.

Фиг.4-6 показывают 3 набора графиков, представляющих для конкретного примера соответствующую фазу в зависимости от угла (слева) и результирующее распределение светового пятна в фокальной плоскости в зависимости от масштабированного радиального расстояния (справа).

Пусть элемент 5 изменения фазы будет выполнен из материала РММА. Длина волны возбуждения равна 635 нм, показатель преломления РММА равен 1,490, а на длине волны ослабления 735 нм он равен 1,487. Пусть фазовая пластина вносит в волновой фронт фазу Ф(φ). Пусть числовая апертура NA луча ослабления будет NA=0,6. Тогда амплитуда STED-пятна в фокальной плоскости дается выражением

(2)

где k=2π/λ (см Born и Wolf “Principles of Optics”, седьмое издание, Pergamon Press, гл. 9) при использовании цилиндрических координат в фокальной плоскости; (r, ψ) и под знаком интеграла (ρ, φ), ρ являются безразмерными. В случае аппроксимации фазы азимутальным углом под интегралом

Ф(φ)=φ(3)

получается

(4)

Определение высоты ступени таким образом, чтобы на длине волны 635 нм эта ступень вводила фазу 2π, дает:

h=λ/(n-ns) (5)

где λ есть длина волны 635 нм, n - показатель преломления материала, из которого выполнены ступеньки, а ns - показатель преломления окружающего вещества. Здесь мы полагаем, что окружающим веществом является воздух, следовательно, ns = 1.

В этом конкретном примере можно найти, что h_ex = 1,2959 микрон. Поэтому эти ступеньки на луч возбуждения не влияют.

На длине волны 735 нм эта ступенька больше не дает смещение по фазе в 2π, а только смещение по фазе в 0,8587·2π. В Таблице 1 приведены смещения по фазе, вводимые на длине волны 735 нм для ступенек различной высоты.

Таблица 1
Перечень различных высот, дающих на длине волны 635 нм фазу, кратную величине 2π, и соответствующую фазуна длине волны 735 нм.
n	Высота, мкм	(Фаза по мод. 2π)/2π на 735 нм
1	1,2959	0,8587
2	2,5918	0,7173
3	3,8877	0,5760
4	5,1836	0,4347
5	6,4795	0,2933
6	7,7754	0,1520
7	9,0713	0,0107

Для получения тороидального распределения пятна в фокальной плоскости FP, вводимая элементом 5 изменения фазы или фазовой пластиной фаза должна быть равна Ф(φ)=φ, где угол выражен в радианах.

Для того чтобы исключить воздействие на луч возбуждения, это распределение можно аппроксимировать ступенчатым распределением. В Таблицах 1, 2, 3 и 4 приведены различные ступеньки, представляющие собой примеры элементов 5 изменения фазы с тремя, четырьмя и пятью выравненными секторами. На Фиг.4-6 представлены поперечные сечения соответствующих точечных распределений в фокальной плоскости для луча 2' ослабления. Этот чертеж показывает, что элемент 5 изменения фазы действительно порождает распределения световых пятен с впадиной или минимумом в центре. Оптимальный результат в этом случае получен для пятиступенчатого элемента 5 изменения фазы, поскольку в этом случае значение интенсивности при r=0 самое меньшее. И в этом случае элемент 5 изменения фазы не оказывает никакого воздействия на луч 1 возбуждения или оказывает на него очень малое воздействие.

Таблица 2
Перечень различных ступенек и фаз, вводимых этими ступеньками для луча ослабления в случае трехступенчатой фазовой пластины
j	Фbegin/2π	Фend/2π	m	hj, мкм	Фstep/2π (мод. 1)
1	0	0,333	6	7,7754	0,1520
2	0,333	0,666	3	3,8877	0,5760
3	0,666	1,0	1	1,2959	0,8587

Таблица 3
Перечень различных ступенек и фаз, вводимых этими ступеньками для луча ослабления в случае четырехступенчатой фазовой пластины
j	Фbegin/2π	Фend/2π	m	hj, мкм	Фstep/2π (мод. 1)
1	0	0,25	0	0	0
2	0,25	0,50	5	7,7754	0,2933
3	0,50	0,75	3	3,8877	0,5760
4	0,75	1,0	1	1,2959	0,8587

Таблица 4
Перечень различных ступенек и фаз, вводимых этими ступеньками для луча ослабления в случае пятиступенчатой фазовой пластины.
j	Фbegin/2π	Фend/2π	m	hj, мкм	Фstep/2π (мод. 1)
1	0	0,2	6	7,7754	0,1520
2	0,2	0,4	5	7,7754	0,2933
3	0,4	0,6	3	3,8877	0,5760
4	0,6	0,8	2	2,5918	0,7173
5	0,8	1,0	1	1,2959	0,8587

Фиг.7 и 8 показывают соответственно двумерные распределения интенсивности световых пятен, созданные элементом изменения фазы по Таблицам 2-4, а также профили интенсивности идеального элемента изменения фазы с секторами одинаковых размеров.

Фиг.7 показывает двумерные распределения интенсивности световых пятен, созданные фазовыми пластинами по Таблицам 2-4. Видно, что профили интенсивностей далеки от того, чтобы быть вращательно симметричными. Двумерное распределение интенсивности световых пятен, созданное фазовой пластиной по Таблице 2 - левое, по Таблице 3 - центральное и по Таблице 4 - правое. Диапазоны осей х и y составляют [-2λ, 2λ].

Для сравнения Фиг.8 показывает профили интенсивности идеальных фазовых пластинок с равными секторами. Профили интенсивности идеальных фазовых пластинок с 3, 4 и 5 равными секторами (слева направо) показаны без ограничения фазы величинами таблицы 1, а имеющими свои собственные идеальные значения. В полученных световых пятнах выявлена ожидавшаяся 3-, 4- и 5-кратная симметрия. Видно, что 4-секторная и 5-секторная фазовые пластинки должны быть предпочтительнее 3-секторной фазовой пластинки, поскольку последняя наиболее сильно отклоняется от полностью вращательной симметрии и не может обеспечить равномерное ослабление флуоресценции.

Формы световых пятен, созданные фазовыми пластинками, которые имеют величины фазы, ограниченные значениями, указанными в таблице 1, могут быть улучшены, если секторам будет "разрешено" быть не одних и тех же размеров. Созданные таким образом дополнительные степени свободы могут быть использованы для придания световым пятнам большей вращательной симметрии. Далее будет показано, каким образом из так называемого интеграла дифракции (см. Уравнение 2) могут быть получены критерии для построения конструкции системы. Может быть выполнено аналитическое интегрирование уравнения 2 по радиусу, в результате чего получается

(6)

где

(7)

Правая часть Уравнения (6) может быть разложена по степеням а и NA, давая

(8)

Вновь вставляя уравнения (6)-(8) в уравнение (2) и используя соотношение

cos(ψ-φ)=cosψ cosφ + sinψ sinφ, (9)

приходим к выражению:

(10)

Входящие в уравнение (10) интегралы по φ могут быть взяты аналитически, если диапазон интегрирования будет подразделен на сегменты, и поскольку Ф(φ) по каждому сегменту постоянна, то в результате получим суммы по всем сегментам:

(11)

где k означает номер сегмента, Ф_k - фазу сегмента (выбранную из таблицы 3), w_k - размер сегмента (то есть конечный угол минус начальный угол сегмента k), а φ_k - средний угол сегмента (то есть средняя величина между начальным углом и конечным углом). При выводе уравнения (11) были использованы хорошо известные выражения для разностей синусов и косинусов:

(12)

При проверке уравнения (11) можно заметить, что если на оптической оси (r=0) необходимо иметь нулевую интенсивность, то первый член в его правой части должен быть равен нулю, то есть

(13)

Кроме того, для того чтобы профиль интенсивности луча ослабления в окрестности оптической оси имел как можно большую вращательную симметрию, надо, чтобы интенсивность |U(r, ψ)|² стала независимой от ψ. Это будет достигнуто тогда, когда отношение коэффициентов при cosψ и sinψ в Уравнении (11) будет следующим:

(14)

Это может быть понято из рассмотрения следующего соотношения:

(15)

(А, В - комплексные). Уравнение (15) становится независимым от ψ, когда В/А=±i, и в этом случае имеем |В/А|² =1 и Re(В/А)=0. В Уравнении (15) А и В означают коэффициенты при cosψ и sinψ в Уравнении (11), которые образуют знаменатель и числитель в Уравнении (14). Используя это, имеем альтернативное, но равнозначное написание Уравнения (14) в терминах коэффициентов, пропорциональных изменению интенсивности в зависимости от ψ:

(14')

В итоге, Уравнения (13) и (14') дают правила построения элементов изменения фазы или фазовых пластинок 5: при заданном наборе фаз Ф_k начальные и конечные углы секторов должны выбираться таким образом, чтобы уравнения (13) и (14') выполнялись как можно более точно. Альтернативно, эти правила построения могут быть использованы для выбора фаз Ф_k из набора возможных фаз, если размеры секторов каким-то образом предопределены, при этом эти фазы должны выбираться таким образом, чтобы уравнения (13) и (14') выполнялись как можно более точно.

В принципе, дополнительные правила построения могут быть получены разложением уравнения (8) по более высоким порядкам параметра а и повторением вышеприведенных преобразований с учетом этих более высоких порядков.

На Фиг.9 показан пример светового пятна, созданного элементом 5 изменения фазы с 7 секторами, спроектированного с использованием уравнений (13) и (14'). Обращает внимание почти идеальная круговая симметрия в центре пятна. Конструктивные параметры фазовой пластины приведены в Таблице 5.