Олигопептиды imp-3 и содержащие их вакцины

Олигопептиды imp-3 и содержащие их вакцины

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

[0001]

Данное изобретение относится к области биологической науки, более конкретно, к области терапии рака. В частности, данное изобретение относится к новым олигопептидам, которые являются чрезвычайно эффективными в качестве противораковых вакцин, и лекарственным средствам для лечения и предотвращения опухолей.

Приоритет

Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 61/265657, поданной 1 декабря 2009 года и предварительной заявки на патент США № 61/371434, поданной 6 августа 2010 года, полное содержание которых включено здесь посредством ссылки.

Уровень техники

[0002]

Было продемонстрировано, что CD8-положительные цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) распознают эпитопные пептиды, произведенные из опухолеспецифических антигенов (TAA), обнаруживаемых на молекулах главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, и затем убивают эти опухолевые клетки. Со времени открытия семейства антигенов меланомы (MAGE) в качестве первого примера TAA, были обнаружены другие TAA, первоначально посредством иммунологических подходов (NPL 1, Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL 2, Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Некоторые из этих TAA в настоящее время подвергаются клинической разработке в качестве иммунотерапевтических мишеней.

[0003]

Идентификация новых TAA, способных индуцировать сильные и специфические противоопухолевые иммунные реакции, гарантирует дальнейшее развитие, и продолжается клиническое исследование стратегий пептидной вакцинации для различных типов рака (NPL 3, Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL 4, Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL 5, Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; NPL 6, van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; NPL 7, Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; NPL 8, Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL 9, Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; NPL 10, Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). К настоящему времени имелось несколько сообщений о клинических исследованиях с использованием этих полученных из опухолеспецифического антигена пептидов. К сожалению, до сих пор наблюдался низкий реальный уровень реакции в этих испытаниях противораковой вакцины (NPL 11, Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; NPL 12, Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL 13, Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15). Таким образом, остается потребность в идентификации новых TAA, применимых в качестве иммунотерапевтических мишеней.

[0004]

Для этой цели, посредством анализа экспрессии генов с использованием кДНК-микроэррея (кДНК-микрочипа) в размере генома, содержащего 23040 генов, идентифицировали IMP-3 (мРНК-связывающий белок 3 инсулиноподобного фактора роста II) в качестве активируемого гена в раке легкого и пищевода (NPL 14, T. Kikuchi et al., Oncogene. 2003 Apr 10; 22(14): 2192-205, PTL 1, WO2004/031413, PTL 2, WO2007/013665, PTL 3, WO2007/013671). Наблюдали, что экспрессия IMP-3 является специфически активируемой в опухолевых клетках более чем 90% раковых пациентов, но не было экспрессии IMP-3 в других здоровых жизненно важных органах, за исключением яичка и плаценты. Кроме того, с использованием способа интерференции РНК было показано, что понижающая регуляция экспрессии IMP-3 подавляет рост клеток в экспрессирующих IMP-3 линиях раковых клеток. Предыдущая заявка, WO2006/090810, описывает пептиды, полученные из IMP-3 (также описанные как KOC1), имеющие специфическую CTL-индуцирующую активность против опухолевых клеток, экзогенно экспрессирующих KOC1 (IMP-3) и HLA-A24. Хотя эти пептиды могут быть пригодны для пациентов типа HLA-A24, остается потребность в отношении CTL-индуцирующих пептидов для пациентов с другим типом HLA.

СПИСОК ЦИТИРОВАНИЯ

Патентная литература

[0005]

[PTL 1] WO 2004/031413

[PTL 2] WO 2007/013665

[PTL 3] WO 2007/013671

[PTL 4] WO 2006/090810

Непатентная литература

[0006]

[NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80

[NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3):725-9

[NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55

[NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13):3134-42

[NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9

[NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9):3308-14

[NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8

[NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72

[NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66

[NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94

[NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80

[NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42

[NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15

[NPL 14] T. Kikuchi et al., Oncogene. 2003 Apr 10; 22(14): 2192-205

Сущность изобретения

[0007]

Данное изобретение основано отчасти на обнаружении новых пептидов, которые могут служить в качестве мишеней иммунотерапии. Поскольку ТАА обычно воспринимаются иммунной системой как "свое" и, следовательно, часто не имеют природной иммуногенности, обнаружение подходящих мишеней является крайне важным. Принимая во внимание то, что IMP-3 был идентифицирован в качестве активируемого в таких типах рака, как рак легкого и рак пищевода, данное изобретение нацелено на белок IMP-3 (SEQ ID NO:22), кодируемый геном GenBank Accession No. NM_006547.2 (SEQ ID NO:21), для последующего анализа. В частности, для этого исследования были выбраны продукты гена IMP-3, содержащие эпитопные пептиды, которые индуцируют неожиданно сильные CTL-реакции, специфические для этих соответствующих молекул. В контексте данного изобретения, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные из здорового донора, стимулировали с использованием пептидов данного изобретения. Были установлены CTL, которые специфически распознают HLA-A2 (A*0201)-положительные клетки-мишени, импульсно обработанные соответствующими пептидами, и были идентифицированы HLA-A2 (A*0201)-рестриктированные эпитопные пептиды, которые могут индуцировать сильные и специфические иммунные реакции против IMP-3, экспрессируемого на поверхности опухолевых клеток. Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что IMP-3 является в высокой степени иммуногенным, и его эпитопы являются эффективными мишенями для противоопухолевой иммунотерапии.

[0008]

Таким образом, целью данного изобретения является обеспечение олигопептидов, имеющих CTL-индуцибельность, а также аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1, 3, 5 и 6. Кроме того, данное изобретение рассматривает модифицированные пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, 3, 5 или 6, где одна, две или несколько аминокислот мутированы или изменены по меньшей мере одной мутацией, выбранной из группы, состоящей из замены, делеции, инсерции и добавления, пока полученные модифицированные олигонуклеотиды сохраняют CTL-индуцибельность исходных пептидов.

[0009]

При введении субъекту эти олигопептиды презентируются на поверхности антигенэкспрессирующих клеток для индукции нацеливания CTL на соответствующие пептиды. Таким образом, целью данного изобретения является обеспечение антигенпрезентирующих клеток и экзосом, которые презентируют любой из этих пептидов, а также способов индуцирования антигенпрезентирующих клеток, ассоциированных с ними.

[0010]

Противоопухолевая иммунная реакция индуцируется введением этих IMP-3-олигопептидов или полинуклеотидов, кодирующих эти олигопептиды, а также экзосом и антигенпрезентирующих клеток, которые презентируют такие IMP-3-олигопептиды. Таким образом, еще одной целью данного изобретения является обеспечение фармацевтических агентов или фармацевтических композиций, содержащих эти олигопептиды или полинуклеотиды, кодирующие их, или ассоциированных экзосом и антигенпрезентирующих клеток, в качестве их активных ингредиентов. Эти фармацевтические агенты или фармацевтические композиции данного изобретения находят конкретное применение в качестве вакцин.

[0011]

Дополнительной целью данного изобретения является обеспечение способов по меньшей мере для одной цели, выбранной из группы, состоящей из лечения, профилактики (т.е. предотвращения) рака (опухолей) и предотвращения его послеоперационного рецидива, а также способов индуцирования CTL, способов индуцирования противоопухолевого иммунитета, причем такие способы включают в себя стадию введения IMP-3-олигопептидов, экзосом или антигенпрезентирующих клеток, презентирующих IMP-3-полипептиды или фармацевтические агенты или композиции данного изобретения, субъекту, нуждающемуся в этом. Кроме того, CTL данного изобретения находят также применение в качестве вакцин против рака. Примеры рака-мишени включают в себя, но не ограничиваются ими, рак легкого и рак пищевода.

[0012]

Более конкретно, данное изобретение обеспечивает следующее:

[1] Выделенный олигопептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 3, 5 и 6,

[2] Выделенный олигопептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 3, 5 и 6, где 1, 2 или несколько аминокислот заменены, делетированы, инсертированы и/или добавлены, где этот олигопептид дополнительно имеет индуцибельность цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL),

[3] Олигопептид по [2], где этот олигопептид имеет одну или обе из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота от N-конца является лейцином или метионином, и

(b) С-концевая аминокислота является валином или лейцином,

[4] Выделенный полинуклеотид, кодирующий олигопептид по любому из [1]-[3],

[5] Способ индуцирования антигенпрезентирующей клетки, имеющей CTL-индуцибельность, с использованием олигопептида, представленного в любом из [1]-[3],

[6] Способ по [5], где этот способ предусматривает стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(a) контактирования антигенпрезентирующей клетки с олигопептидом по любому из [1]-[3], и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего олигопептид по любому из [1]-[3], в антигенпрезентирующую клетку,

[7] Способ по [5] или [6], где эта антигенпрезентирующая клетка экспрессирует по меньшей мере один HLA-A2-антиген на ее поверхности,

[8] Способ индуцирования CTL с использованием олигопептида, по любому из [1]-[3],

[9] Способ по [8], где этот способ предусматривает стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(a) контактирования CD8-положительной T-клетки с антигенпрезентирующей клеткой и/или экзосомой, которая презентирует комплекс олигопептида по любому из [1]-[3] и HLA-антигена на ее поверхности, и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего полипептид, который способен образовывать связывание субъединицы Т-клеточного рецептора (TCR) с комплексом олигопептида по любому из [1]-[3] и HLA-антигена на антигенпрезентирующей клеточной поверхности, в CD8-положительную Т-клетку,

[10] Способ по [9], где HLA-антигеном является HLA-A2,

[11] Выделенный CTL, который нацелен на олигопептид по любому из [1]-[3],

[12] CTL по [11], где указанный CTL способен связываться с комплексом олигопептида по любому из [1]-[3] и HLA-антигена на клеточной поверхности,

[13] CTL по [12], где указанным HLA-антигеном является HLA-A2,

[14] Выделенный CTL, который индуцируется с использованием олигопептида по любому из [1]-[3],

[15] CTL по [14], где указанный CTL индуцируется способом по любому из [8]-[10],

[16] Выделенная антигенпрезентирующая клетка, которая презентирует на ее поверхности комплекс HLA-антигена и олигопептида по любому из [1]-[3],

[17] Антигенпрезентирующая клетка по [16], где этим HLA-антигеном является HLA-A2,

[18] Антигенпрезентирующая клетка по [16] или [17], где указанная антигенпрезентирующая клетка индуцируется любым способом по [5]-[7],

[19] Способ индуцирования иммунной реакции против рака в субъекте, предусматривающий стадию введения этому субъекту вакцины, содержащей по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из:

(a) одного или более олигопептидов по любому из [1]-[3] или его иммунологически активного фрагмента;

(b) одного или более полинуклеотидов, кодирующих олигопептид по любому из [1]-[3] или его иммунологически активный фрагмент;

(c) одного или более выделенных CTL по любому из [11]-[15]; и

(d) одной или более выделенных антигенпрезентирующих клеток по любому из [16]-[18],

[20] Способ по [19], где указанный субъект является HLA-A2-положительным,

[21] Фармацевтический агент для лечения и/или профилактики рака и/или предотвращения его послеоперационного рецидива, где этот агент содержит фармацевтически приемлемый носитель и по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из:

(a) одного или более олигопептидов по любому из [1]-[3] или его иммунологически активного фрагмента;

(b) одного или более полинуклеотидов, кодирующих олигопептид по любому из [1]-[3], или его иммунологически активный фрагмент;

(c) одной или более антигенпрезентирующих клеток, презентирующих комплекс олигопептида по одному из [1]-[3] и HLA-антигена; и

(d) одного или более CTL, который способен связываться с комплексом олигопептида по [1]-[3] и HLA-антигена на клеточной поверхности,

[22] Фармацевтический агент для индуцирования CTL, где этот агент содержит фармацевтически приемлемый носитель и по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из:

(a) одного или более олигопептидов по любому из [1]-[3] или его иммунологически активного фрагмента;

(b) одного или более полинуклеотидов, кодирующих олигопептид по любому из [1]-[3] или его иммунологически активный фрагмент;

(c) одной или более антигенпрезентирующих клеток, презентирующих комплекс олигопептида по одному из [1]-[3] и HLA-антигена,

[23] Фармацевтический агент по [21] или [22], где этот фармацевтический агент готовят для введения субъекту, который является HLA-A2-положительным,

[24] Фармацевтический агент по [21]-[23], который является вакциной,

[25] Применение активного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из:

(a) одного или более олигопептидов по любому из [1]-[3];

(b) одного или более полинуклеотидов, кодирующих олигопептид по любому из [1]-[3], в экспрессируемой форме;

(c) одной или более антигенпрезентирующих клеток, презентирующих комплекс олигопептида по любому из [1]-[3] и HLA-антигена на ее поверхности; и

(d) одного или более CTL, который способен связываться с комплексом олигопептида по любому из [1]-[3] и HLA-антигена на клеточной поверхности, для изготовления фармацевтической композиции или агента для лечения рака, и

[26] Применение по [25], где эти фармацевтическая композиция или агент получают в виде состава для введения субъекту, который является HLA-A2-положительным,

[27] Выделенный олигопептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 3, 5 и 6, для применения в лечении и/или профилактике рака и/или предотвращении его послеоперационного рецидива в субъекте, который является HLA-A2-положительным,

[28] Выделенный олигопептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 3, 5 и 6, где 1, 2 или несколько аминокислот являются замененными, делетированными, инсертированными и/или добавленными, где дополнительно этот олигопептид имеет индуцибельность цитотоксического Т-лимфоцита (CTL), для применения в лечении и/или профилактике рака и/или предотвращении его послеоперационного рецидива в субъекте, который является HLA-A2-положительным, и

[29] Олигопептид по [28], где этот олигопептид имеет одну или обе из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота от N-конца является лейцином или метионином, и

(b) С-концевая аминокислота является валином или лейцином.

[0013]

Кроме вышеописанного, другие объекты и признаки данного изобретения будут более очевидными при чтении следующего подробного описания вместе с сопутствующими фигурами и примерами. Однако, должно быть понятно, что как предыдущий раздел «Сущность изобретения», так и последующий раздел «Подробное описание» являются иллюстративными вариантами и не ограничивают это изобретение или другие, альтернативные варианты осуществления данного изобретения. В частности, хотя это изобретение описано здесь со ссылкой на ряд конкретных вариантов осуществления, должно быть понятно, что это описание является иллюстративным и не должно пониматься как ограничивающее это изобретение. Различные модификации и применения могут приходить на ум квалифицированным в данной области специалистам, без отклонения от сущности и объема данного изобретения, описанного прилагаемой формулой изобретения. Подобным образом, другие цели, признаки, эффекты и преимущества данного изобретения будут очевидными из раздела «Сущность изобретения» и некоторых описанных ниже вариантов осуществления и будут вполне очевидными для квалифицированных в данной области специалистов. Такие цели, признаки, эффекты и преимущества будут очевидными из вышеописанного вместе с сопутствующими примерами, данными, фигурами и всеми обоснованными выводами, сделанными из них, отдельно или с учетом включенных здесь ссылок.

Краткое описание фигур

[0014]

Различные аспекты и применения данного изобретения станут очевидными квалифицированному в данной области специалисту после рассмотрения краткого описания фигур и подробного описания данного изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, которые следуют далее.

[0015]

[Фиг.1]

Фиг.1 изображает результаты анализа IFN-гамма ELISPOT на CTL, которые были индуцированы в HLA-A2-трансгенных мышах. CTL, стимулированные пептидами (SEQ ID NO:3, 5 и 6), показывали сильные IFN-гамма-продуцирующие реакции в сравнении с контролями (верхняя панель). Столбики ошибок представляют стандартное отклонение (SD). Статистически значимые различия указаны звездочками (*P<0,05). Показаны также примерные фотографии подсчетов ELISPOT лунок в трех повторностях (нижняя панель). Эти CTL обнаруживали 203-226 пятен на лунку в ответ на BM-DC, импульсно подаваемый с пептидом SEQ ID NO:6 (панели с левой стороны), тогда как они обнаруживали 74-105 пятен на лунку в присутствии BM-DC без загрузки пептидом (панели с правой стороны).

[0016]

[Фиг.2]

Фиг.2 состоит из ряда диаграмм в виде столбцов, изображающих результаты анализа IFN-гамма ELISPOT на CTL человека (здорового донора 1). CTL человека, стимулированные пептидами SEQ ID NO:1, 3, 5 и 6, показывали сильные продуцирующие IFN-гамма реакции против Т2-клеток, импульсно обработанных родственными пептидами, в сравнении с Т2-клетками, импульсно обработанными посторонним пептидом ВИЧ (P<0,05). Столбики ошибок представляют SD.

[0017]

[Фиг.3]

Фиг.3 состоит из ряда графиков распределения (A) и линейных графиков (B), изображающих индукцию IMP-3-специфических CTL человека из CD8⁺ T-клеток HLA-A2-положительных пациентов с раком легкого и здоровых доноров. Часть (A) представляет результаты анализа FACS (с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) для детектирования экспрессии CD107a на клеточной поверхности CTL человека здорового донора 1 или пациента 1 с раком легкого после стимуляции пептидом SEQ ID NO:1, 3 или 6. CTL, стимулированные этим пептидом, окрашивались FITC (флуоресцеинизотиоцианат)-конъюгированным анти-CD107a-антителом (верхняя панель), или FITC-конъюгированным антимышиным IgG1 в качестве контроля (средняя панель). В качестве отрицательного контроля стимуляции, CTL стимулировали пептидом ВИЧ и окрашивали FITC-конъюгированным анти-CD107a-антителом (нижняя панель). Экспрессию CD107a детектировали на CTL, когда их стимулировали пептидом SEQ ID NO:1, 3 или 6 в сравнении с контролем. Часть (B) изображает цитотоксичность IMP-3-специфических CTL против T2-клеток, импульсно обработанных родственными IMP-3-произведенными пептидами. Цитотоксичность CTL против Т2-клеток, импульсно обработанных пептидом SEQ ID NO:1 (белый треугольник; левая и средняя панели) или пептидом SEQ ID NO:6 (белый треугольник; правая панель), и Т2-клеток, импульсно обработанных посторонними пептидами HIV-A2 (черные треугольники) в анализе высвобождения ⁵¹Cr. Каждая величина представляет процент специфического лизиса, рассчитанного на основе средних величин анализа с тремя повторностями.

[0018]

[Фиг.4]

Фиг.4 состоит из ряда диаграмм в виде столбцов (A) и линейных (B) графиков, изображающих IMP-3-специфические CTL из PBMC трех пациентов с раком легкого. Часть (A) изображает CTL, индуцированные из PBMC пациента 14 стимуляцией пептидом SEQ ID NO:5, и пациент 103 с пептидом SEQ ID NO:6 показал существенное продуцирование IFN-гамма против Т2-клеток, импульсно обработанных родственными пептидами, в сравнении с Т2-клетками, импульсно обработанными посторонним пептидом ВИЧ. Статистически значимые различия указаны звездочками (*P<0,05). Столбики ошибок представляют SD. Часть (B) изображает CTL, индуцированные из PBMC пациента 4 с пептидом SEQ ID NO:3, и пациент 3 с пептидом SEQ ID NO:5 показал цитотоксическую активность против Т2-клеток, импульсно обработанных родственными пептидами, в сравнении с Т2-клетками, импульсно обработанными посторонним пептидом ВИЧ.

[0019]

[Фиг.5A-C]

Фиг.5 состоит из ряда линейных графиков, изображающих результаты анализа высвобождения ⁵¹Cr с использованием CTL и линий опухолевых клеток, эндогенно экспрессирующих IMP-3. Часть (A) представляет цитотоксические активности CTL, индуцированных из PBMC здорового донора 2 стимуляцией пептидами SEQ ID NO:1, 3, 5 и 6. Эти CTL показывали цитотоксическую активность против PANC-1 (IMP-3⁺, HLA-A2⁺), но не показывали цитотоксическую активность против MCF7 (IMP-3^-, HLA-A2⁺) и A549 (IMP-3⁺, HLA-A2^-). Часть (B) представляет цитотоксические активности CTL, индуцированные из PBMC пациента 14 с раком легкого, стимуляцией пептидами SEQ ID NO:3 и 5, и пациента 4 пептидом SEQ ID NO:6, которые детектировали анализом высвобождения ⁵¹Cr. Эти CTL обнаруживали цитотоксическую активность против PANC-1 (IMP-3⁺, HLA-A2⁺), но не обнаруживали цитотоксическую активность против MCF7 (IMP-3^-, HLA-A2⁺) и A549 (IMP-3⁺, HLA-A2^-). Часть (C) представляет цитотоксические активности IMP-3-специфических CTL против MCF7/IMP3 (белый кружок; MCF7-клетки, трансфицированные геном IMP-3) или MCF7 (черный кружок), анализированные с использованием анализа высвобождения ⁵¹Cr.

[0020]

[Фиг.5D]

Часть (D) представляет цитотоксические активности IMP-3-специфических CTL против SW620 (белый треугольник), SKHep1 (белый ромб), MCF7 (черный кружок) или A549 (черный ромб), анализированные анализом высвобождения ⁵¹Cr. Линии CTL, генерированные из здоровых доноров стимуляцией либо пептидом SEQ ID NO:1, либо пептидом SEQ ID NO:6, проявляли цитотоксическую активность против SW620, SKHep1, но не против A549 (HLA-A2^-, IMP-3⁺) или клеток MCF7 (HLA-A2⁺, IMP-3^-).

[0021]

[Фиг.6A-B]

Фиг.6 состоит из ряда диаграмм в виде столбцов (A, B, D) и линейных графиков (C), изображающих ингибирование CTL-реакций анти-HLA класса I-mAb (W6/32, IgG2a) или анти-HLA-A2-mAb. Активности CTL, индуцированные из PBMC пациента 14 с раком легкого стимуляцией пептидами SEQ ID NO:1, 3, 5 и 6, детектировали анализом IFN-гамма ELISPOT (A). Продуцирование IFN-гамма, опосредованное этими CTL, заметно ингибировалось W6/32, в то время как ингибирование продуцирования IFN-гамма не детектировали обработкой анти-HLA-DR-mAb (H-DR-1, IgG2a). Столбики ошибок представляют SD. Статистически значимые различия указаны звездочками (*P<0,05). Показаны продуцирование IFN-гамма (B) и цитотоксичность (C и D), опосредованные CTL. Белый кружок, PANC1; черный кружок, PANC1+W6/32; квадрат, PANC1+контрольное mAb. Столбцы показывают продуцирование IFN-гамма (B) или цитотоксичность (D), когда генерированные линии CTL сокультивировали с PANC1 (белые столбцы), PANC1+контрольное mAb (белые столбцы) или PANC1+блокирующие mAb (черные столбцы). Показаны репрезентативные данные из двух независимых экспериментов со сходными результатами. Статистически значимые различия в (B) указаны звездочками.

[0022]

[Фиг.6C-D]

Фиг.6C-D является продолжением фиг.6A-B.

Описание вариантов осуществления

[0023]

Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным здесь, могут быть использованы в практике или тестировании вариантов осуществления данного изобретения, теперь описываются предпочтительные способы, устройства и материалы. Однако перед описанием этих материалов и способов должно быть понятно, что данное изобретение не ограничивается описанными здесь конкретными размерами, формами, размерностями, методологиями, протоколами и т.д., так как они могут варьироваться в соответствии с рутинным экспериментированием и оптимизацией. Должно быть также понятно, что терминология, используемая в этом описании, предназначена только для цели описания конкретных версий или вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, который будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.

[0024]

Раскрытие каждой публикации, патента или заявки на патент, упоминаемых в этом описании изобретения, специально включено здесь посредством ссылки в полном виде. Однако ничто здесь не должно пониматься как признание того, что это изобретение не дает права на датирование задним числом такого раскрытия на основании предыдущего изобретения.

Если нет другого определения, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же самое значение, что и значение, обычно понимаемое специалистом, квалифицированным в области, к которой принадлежит данное изобретение. В случае противоречия данное изобретение, в том числе определения, будут служить контролем. Кроме того, эти материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

[0025]

I. Определения

Слова, употребляемые в единственном числе, обозначают в данном контексте "по меньшей мере один", если нет других указаний. Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются здесь взаимозаменяемо для ссылки на полимер аминокислотных остатков. Эти термины относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков являются модифицированными остатками или не встречающимися в природе остатками, такими как искусственный химический миметик соответствующей природно-встречающейся аминокислоты, а также к природно-встречающимся аминокислотным полимерам.

[0026]

Термин "олигопептид", используемый иногда в этом описании, используется для ссылки на пептид, который имеет длину 20 остатков или менее, обычно 15 остатков или менее и обычно состоит из приблизительно 8 - приблизительно 11 остатков, часто из 9 или 10 остатков. Во всем этом описании термин "пептид" используется в том же самом значении, что и термин "олигопептид" если нет других указаний.

[0027]

Термин "аминокислота" в данном контексте относится к природно-встречающимся и синтетическим аминокислотам, а также аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые имеют функцию, сходную с функцией природно-встречающихся аминокислот. Природно-встречающимися аминокислотами являются аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и О-фосфосерин). Фраза "аналог аминокислот" относится к соединениям, которые имеют одну и ту же базовую химическую структуру (альфа-углерод, связанный с водородом, карбоксигруппа, аминогруппа и R-группа), что и природно-встречающаяся аминокислота, но имеют модифицированную R-группу или модифицированные скелеты макромолекулы (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионинметилсульфоний). Фраза "аминокислотный миметик" относится к химическим соединениям, которые имеют различные структуры, но сходные функции с обычными аминокислотами.

Аминокислоты могут называться здесь их обычно известными трехбуквенными символами или однобуквенными символами, рекомендуемыми IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.

Термины "ген", "полинуклеотиды", "нуклеотиды" и "нуклеиновые кислоты" используются здесь взаимозаменяемо, если нет других указаний, и подобно аминокислотам называются их общепринятыми однобуквенными кодами.

[0028]

Термины "агент" и "композиция" используются здесь взаимозаменяемо в отношении продукта, включающего в себя указанные ингредиенты в указанных количествах, а также любого продукта, который происходит, прямо или косвенно, из комбинации указанных ингредиентов в указанных количествах. Такие термины в отношении определения "фармацевтические" предназначены для включения в себя продукта, в том числе активного ингредиента (активных ингредиентов), и любого инертного ингредиента (инертных ингредиентов), которые составляет этот носитель, а также любого продукта, который происходит, прямо или косвенно, из объединения, комплексообразования или агрегации любых двух или нескольких из этих ингредиентов, или диссоциации одного или более из этих ингредиентов, или из других типов реакций или взаимодействий одного или более из этих ингредиентов. Таким образом, в контексте данного изобретения, термины "фармацевтический агент" и "фармацевтическая композиция" используются взаимозаменяемо в отношении любого агента, вещества или композиции, приготовленных смешиванием продукта данного изобретения и фармацевтически или физиологически приемлемого носителя. Фраза "фармацевтически приемлемый носитель" или "физиологически приемлемый носитель", обозначает в данном контексте фармацевтически или фармакологически приемлемый материал, композицию, вещество или носитель, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал, участвующий в несении или транспорте удерживаемых субъектом полифармакофоров из одного органа, или части тела, в другой орган, или в другую часть тела.

Фармацевтические агенты или композиции данного изобретения находят особое применение в качестве вакцин. В контексте данного изобретения, фраза "вакцина" (также называемая "иммуногенной композицией") относится к веществу, которое имеет функцию индуцирования противоопухолевого иммунитета после инокуляции в животных.

[0029]

Термин "активный ингредиент" относится здесь к веществу в агенте или композиции, которое является биологически или физиологически активным. В частности, в фармацевтическом агенте или композиции, "активный ингредиент" относится к веществу, которое обнаруживает целевой фармакологический эффект. Например, в случае фармацевтических агентов или композиций для применения в лечении или предотвращении рака, активные ингредиенты в этих агентах или композициях могут приводить по меньшей мере к одному биологическому или физиологическому действию на раковые клетки и/или ткани прямо или опосредованно. Предпочтительно, такое действие может включать в себя уменьшение или ингибирование роста раковых клеток, повреждение или убивание раковых клеток и/или тканей и т.д. Обычно косвенным действием активных ингредиентов является индуцирование CTL, распознающих или убивающих раковые клетки. Перед приготовлением "активный ингредиент" называют также "нерасфасованным продуктом" (“ин балк”-продуктом), "лекарственным веществом" или "техническим продуктом".

[0030]

Если нет других указаний, термин "рак" относится к типам рака, сверхэкспрессирующим ген IMP-3, примеры которых включают в себя, но не ограничиваются ими, рак легкого и рак пищевода.

Если нет других указаний, термины "цитотоксический Т-лимфоцит", "цитотоксическая Т-клетка" и "CTL" используются здесь взаимозаменяемо и, если не оговорено иное, относятся к подгруппе Т-лимфоцитов, которые способны распознавать не-свои клетки (например, опухолевые клетки, инфицированные вирусом клетки) и индуцировать смерть таких клеток.

Если нет других указаний, термин "набор" используется в данном контексте в отношении комбинации реагентов и других материалов. Здесь обсуждается, что этот набор может включать в себя микроэррей (микрочип) чип, маркер и т.д. У авторов нет намерения ограничения термина "набор" конкретной комбинацией реагентов и/или материалов. При применении здесь, в контексте субъекта или пациента, фраза "HLA-A2-положительный" означает, что этот субъект или пациент гомозиготно или гетерозиготно имеет ген HLA-A2-антигена, и HLA-A2-антиген экспрессируется в клетках этого субъекта или пациента в виде HLA-антигена.

[0031]

В той степени, в которой способы и композиции данного изобретения находят применение в контексте "лечения" рака, лечение считается "эффективным", если оно приводит к клинической эффективности, такой как уменьшение экспрессии гена IMP-3 или уменьшение в размере, распространенности или метастатическом потенциале рака в этом субъекте. При профилактическом применении лечения "эффективное" означает, что лечение задерживает или предотвращает образование рака или предотвращает или облегчает клинический симптом рака. Эффективность определяют вместе с использованием любого известного способа для диагностики или лечения конкретного типа опухоли.

[0032]

В той степени, в которой способы и композиции данного изобретения находят применение в контексте "предотвращения" и "профилактики" рака, такие термины используются здесь взаимозаменяемо в отношении любой активности, которая уменьшает летальность и болезненность, связанные с этим заболеванием. Предотвращение и профилактика могут осуществляться "при первичном, вторичном и третичном уровнях предотвращения". В то время как первичные предотвращение и профилактика избегают развития заболевания, вторичный и третичный уровни предотвращения и профилактики включают в себя активности, нацеленные на предотвращение и профилактику развития заболевания и появление симптомов, а также уменьшение отрицательного действия уже установившегося заболевания посредством восстановления функции и уменьшения связанных с заболеванием осложнений. Альтернативно, предотвращение и профилактика могут включать в себя широкий диапазон профилактических способов лечения, нацеленных на облегчение тяжести конкретного нарушения, например, уменьшением пролиферации и метастазирования опухолей.

[0033]

В контексте данного изобретения лечение и/или профилактика рака и/или предотвращение послеоперационного рецидива включают в себя любую из следующих стадий, таких как хирургическое удаление раковых клеток, ингибирование роста раковых клеток, обратное развитие или регресс опухоли, индукцию ремиссии и уменьшение или ингибирование метастазирования. Эффективное лечение и/или профилактика рака уменьшает смертность и улучшает прогноз индивидуумов, имеющих рак, уменьшает уровни опухолевых маркеров в крови и ослабляет детектируемые симптомы, сопутствующие раку. Например, эффективное лечение включает в себя уменьшение или улучшение симптомов, и/или профилактика включает в себя 10%, 20%, 30% или большее уменьшение, или достижение стабильного состояния заболевания.

[0034]

В контексте данного изобретения термин "антитело" относится к иммуноглобулинам и их фрагментам, которые являются специфически реактивными в отношении указанного белка или его пептида. Антитело может включать в себя антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела, антитела, слитые с другими белками или радиоактивной меткой, и фрагменты антител. Кроме того, антитело используется здесь в самом широком смысле и конкретно охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. "Антитело" обозначает все классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM).

[0035]

II. Пептиды

Для демонстрации, что пептиды, происходящие из IMP-3, функционируют как антиген, распознаваемый цитотоксическими T-лимфоцитами (CTL), пептиды, произведенные из IMP-3 (SEQ ID NO:22), анализировали для определения, были ли они HLA-A2-рестриктированными (ex. A*0201 и A*0206), с которыми обычно встречаются аллели HLA (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). Кандидаты HLA-A2-связывающих пептидов, произведенные из IMP-3, идентифицировали на основе из аффинностей связывания с HLA-A2. После стимуляции in vitro Т-клеток дендритными клетками (DC), нагруженными этими пептидами, CTL были успешно установлены с использованием этих пептидов, в частности, пептидов SEQ ID NO:1, 3, 5 и 6.

[0036]

Эти установленные CTL обнаруживают сильную специфическую CTL-активность против клеток-мишеней, импульсно обработанных соответствующими пептидами, а также клеток, экспрессирующих HLA-A*0201 и IMP-3. Эти результаты демонстрируют здесь, что IMP-3 является антигеном, распознаваемым CTL, и что эти пептиды могут быть эпитопными пептидами IMP-3, рестриктированными по HLA-A2 (ex. A*0201 и A*0206).

Поскольку ген IMP-3 сверхэкспрессируется в большинстве раковых тканей, таких как рак легкого и рак пищевода, он является хорошей мишенью для иммун