Способ прогнозирования развития терминальной стадии у больных хроническим миелолейкозом

Способ прогнозирования развития терминальной стадии у больных хроническим миелолейкозом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и онкологии, и может быть использовано при диагностике больных хроническими лейкозами

На сегодняшний день доля хронических лейкозов в структуре заболеваемости гемобластозами неуклонно увеличивается. Среди данной категории больных большую часть составляют больные с хроническим миелолейкозом. Относительно доброкачественная опухоль на развернутой стадии заболевания на каком-то непредсказуемом этапе превращается в опухоль поликлоновую, злокачественную, и процесс вступает в терминальную стадию. Появление терминальной стадии сопровождается бластным кризом, перерождением в острый лейкоз или другие состояния, рефрактерностью к химиотерапии и в конечном итоге является неблагоприятным прогнозом у больных хроническими лейкозами.

Известен способ дифференциальной диагностики развернутой и терминальной стадий хронического лейкоза, включающий определение содержания свободной и связанной воды в плазме крови больного [1]. При значении коэффициента гидратации плазмы меньше 6,75 диагностируют развернутую стадию, а при значении коэффициента больше 6,75 - терминальную стадию хронического лейкоза. Известный способ не учитывает особенности клеточных реакций и механизмов при развитии онкологического заболевания, особенности клеточного противоопухолевого иммунитета, что является важным в прогрессировании гемобластоза.

За прототип принят способ прогнозирования течения хронических лейкозов путем выделения из венозной крови лимфоцитов [2, 3, 4]. Способ включает осуществление реакции естественной цитотоксичности лимфоцитов в отношении клеток-мишеней К-562 в стадии развернутых клинических проявлений и определение процента специфического лизиса клеток-мишеней. При сохранении его в пределах показателей естественной цитотоксичности для соответствующих соотношений клеток-эффекторов и клеток-мишеней, характерных для данной стадии заболевания, прогнозируют благоприятное течение заболевания, а при достоверном снижении - неблагоприятное течение (терминальная стадия). Известный способ длительный, трудоемкий, не учитывает резервные возможности стимулированных лимфоцитов.

Задачей изобретения является создание информативного способа прогнозирования развития терминальной стадии у больных хроническим миелолейкозом.

Задача достигается тем, что у больных в развернутой стадии хронического миелолейкоза в лимфоцитах периферической крови определяют активность двух дегидрогеназ - глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). При сочетании активности Г3ФДГ в пределах от 0 до 0,02 мкЕ и активности ЛДГ в пределах от 0,04 до 5,02 мкЕ у больных прогнозируют развитие терминальной стадии.

Пороговые интервалы значений активности Г3ФДГ и ЛДГ получены опытным путем на основании сопоставления значений активностей исследуемых дегидрогеназ и данных по развитию терминальной стадии у больных хроническим миелолейкозом, полученных при последующем наблюдении за клиническим состоянием больных в развернутой стадии заболевания. Терминальная стадия диагностировалась при развитии бластного криза.

Развитие хронического лейкоза - это сложный процесс, отражающий взаимодействие организма с опухолью. В настоящее время не вызывает сомнений факт, что наиболее ранние признаки нарушений следует искать на уровне клетки, где начинается формирование ответной реакции на онковоздействие. Клетками, осуществляющими противоопухолевый иммунологический надзор, являются лимфоциты. Изменения внутриклеточного метаболизма приводят к нарушению функции клеток и к несостоятельности противоопухолевой защиты организма в целом. Наиболее информативными показателями внутриклеточного метаболизма являются дегидрогеназы. Это позволяет использовать их в качестве показателей, характеризующих метаболическое состояние лимфоцитов у больных хроническими лейкозами в прогнозировании терминальной стадии.

Глицерол-3-фосфатдегидрогеназа (Г3ФДГ) характеризует интенсивность переноса продуктов липидного катаболизма на окислительно-восстановительные реакции гликолиза. Снижение данной реакции приводит к ингибированию гликолиза в клетке.

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) характеризует интенсивность гликолиза и уровень концентрации интермедиаторов для цикла трикарбоновых кислот, отвечая за энергетические процессы в клетке.

Способ осуществляется следующим образом.

У больного с диагнозом «развернутая стадия хронического миелолейкоза» забирают венозную кровь из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином. Выделяют лимфоциты путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографина по стандартной методике A. Boyum. Подсчитывают концентрацию лимфоцитов, например в камере Горяева. Чистота выхода лимфоцитов должна составлять не менее 97%. Используют 1 млн выделенных клеток для определения активности Г3ФДГ и ЛДГ одним из известных способов, например биолюминесцентным [5]. Для этого суспензию выделенных лимфоцитов, содержащую клетки в концентрации 1,0 млн/мл, разрушают путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ дитиотреитола. Затем определяют активность дегидрогеназ. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также pH среды для определяемых ферментов, представлены в таблице.

После инкубации исследуемых проб при 37°С в течение 30 минут к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10¹⁵ М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДФН:ФМН оксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1М K⁺, Na⁺-фосфатном буфере с pH 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биолюминометра, например марки "БЛМ-3606М", измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение ведут в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности строят график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДФН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДФН в диапазоне 10^-9-10^-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАДФН: ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. Активность дегидрогеназ рассчитывают по формуле:

где A - активность дегидрогеназы, E на 10⁴ лимфоцитов (1E=1 мкмоль/мин);

Δ[C] - разница концентраций НАДФН в пробах "фермент" и "фон фермента", мкмоль;

V - объем пробы, мл;

T - время инкубации, мин.

Развитие терминальной стадии у больных хроническим миелолейкозом прогнозируют, если значения активности Г3ФДГ находятся в интервале 0-0,02 мкЕ, а значения активности ЛДГ - в интервале 0,04-5,02 мкЕ.

Клинический пример 1. Больная Н., 60 лет, поступила на стационарное лечение в гематологическое отделение ККБ №1 г. Красноярска с диагнозом: хронический миелолейкоз, развернутая стадия. Больная поступила на очередной курс химиотерапии. При поступлении состояние больной средней степени тяжести, беспокоит сильная слабость. Проведено обследование по заявленному способу. Активность ферментов в лимфоцитах крови составила:

Г3ФДГ: 0,01 мкЕ (в интервале значений: 0-0,02 мкЕ)

ЛДГ: 4,47 мкЕ (в интервале значений: 0,04-5,02 мкЕ)

Уровни активности ферментов снижены. Согласно изобретению, у больной прогнозируют развитие терминальной стадии хронического миелолейкоза.

Спустя сутки в гемограмме - бластный криз, миелобласты 3%, анемия, тромбоцитопения, диагностирована терминальная стадия и назначена полихимиотерапия по программе индукции ремиссии острого миелобластного лейкоза.

Клинический пример 2. Больной М., 57 лет, поступил на стационарное лечение в гематологическое отделение ККБ №1 г. Красноярска с диагнозом: хронический миелолейкоз, развернутая стадия. При поступлении состояние больного средней степени тяжести, беспокоит выраженная слабость, повышенная утомляемость.

Проведено обследование по заявленному способу.

Активность ферментов в лимфоцитах крови составила:

Г3ФДГ: 1,17 мкЕ (вне интервала значений: 0-0,02 мкЕ)

ЛДГ: 14,9 мкЕ (вне интервала значений: 0,04-5,02 мкЕ)

Согласно изобретению, по результатам определения активности Г3ФДГ и ЛДГ развитие терминальной стадии не прогнозируют: у больного развернутая стадия хронического миелолейкоза. В гемограмме больного бластов нет, что подтвердило диагноз развернутой стадии. Больному назначен курс плановой химиотерапии.

Данный способ апробирован на 44 больных хроническим миелолейкозом, проходивших лечение в гематологическом отделении Краевой клинической больницы №1 г. Красноярска. Активность Г3ФДГ и ЛДГ в лимфоцитах крови определяли с помощью биолюминесцентного метода. У 24 больных хроническим миелолейкозом было спрогнозировано развитие терминальной стадии заболевания, которая в дальнейшем была подтверждена дополнительными методами исследования. У 2 больных прогноз не совпал. Таким образом, отмечено совпадение прогноза у 96% наблюдаемых больных.

Технический результат от реализации предлагаемого способа:

- повышение точности прогнозирования развития терминальной стадии у больных хроническим миелолейкозом за счет оценки особенностей метаболизма клеток иммунной системы;

- сокращение длительности исследования;

- возможность ранней диагностики терминальной стадии хронического лейкоза;

- расширение арсенала средств для прогнозирования возникновения терминальной стадии у больных хроническим миелолейкозом.

Таким образом, предложенный высокочувствительный информативный способ позволяет своевременно диагностировать прогрессирование заболевания, корректировать план и тактику лечения данной категории больных и улучшить результаты их реабилитации.

Источники информации

1. Патент №2098821 (RU). Способ дифференциальной диагностики развернутой и терминальной стадий хронического лейкоза / Литвинов А.В. /. Заявитель и патентообладатель: Смоленская государственная медицинская академия. Заявка 95121015/14; заявл. 30.11.1995; опубл. 10.12.1997.

2. АС №1750369 (SU). Способ прогнозирования течения хронических лейкозов. Заявка 4661262/30-14, бюл. №9227.

3. Патент №2052200 (RU). Способ оценки тяжести лейкозного процесса / Гусева С.А., Волкова Т.Г. /. Заявитель и патентообладатель: Киевский институт усовершенствования врачей МЗ Украина. Заявка 5054705/14; заявл. 10.07.1992; опубл. 10.01.1996.

4. Патент №2069858 (RU). Способ прогнозирования течения лейкоза / Гусева С.А., Мясников В.Г., Клименко Л.Н. /. Заявители и патентообладатели: Гусева С.А., Мясников В.Г., Клименко Л.Н. Заявка 5027086/14; заявл. 25.12.1991; опубл. 27.11.1996.

5. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом / Лаб. дело. 1989. №11. С.23-25.

Способ прогнозирования развития терминальной стадии у больных хроническим миелолейкозом путем исследования крови, отличающийся тем, что у больных в развернутой стадии хронического миелолейкоза в лимфоцитах периферической крови определяют активность двух дегидрогеназ - глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), и при сочетании активности Г3ФДГ в пределах от 0 до 0,02 мкЕ и активности ЛДГ в пределах от 0,04 до 5,02 мкЕ прогнозируют развитие терминальной стадии.