Способ получения из каллусных культур пектинов с увеличенным содержанием остатков галактозы

Способ получения из каллусных культур пектинов с увеличенным содержанием остатков галактозы

Реферат

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается получения лекарственных препаратов на основе пектиновых полисахаридов.

Известен способ получения пектина из морских трав (SU 921500 А1; МКИ A23L 1/04, С08В 37/06), включающий измельчение сырья, обработку его соляной кислотой при рН 4-5, промывку водой, экстракцию 1%-ным раствором оксалата аммония, осаждение этанолом, фильтрование, измельчение пектина, промывку этанолом, обработку метанолом в присутствии хлористого ацетила, повторное фильтрование, последовательную промывку метанолом и этанолом, сушку пектина.

Однако известный способ отличается трудоемкостью, использованием ядовитого вещества метанола и не позволяет получить из биомассы культивируемых in vitro тканей растений целевой продукт с заданной структурой и стабильным химическим составом.

Известен способ получения пектина из травы фиалки собачьей Viola canina L. (RU патент 2285536 C1; МКИ А61К 36/86), включающий предварительную экстракцию 70% этиловым спиртом, фильтрование, экстракцию горячей водой, повторное фильтрование, экстракцию 0,5% раствором щавелевой кислоты, фильтрование, упаривание экстрактов, осаждение и промывание осадка 96% этиловым спиртом, сушку.

Однако известный способ не позволяет получить из биомассы культивируемых тканей растений целевой продукт с заданной структурой и стабильным химическим составом.

Наиболее близким является способ получения пектиновых полисахаридов из биомассы культивируемых тканей растений Silene vulgaris (М.) G, Tanacetum vulgare L, Lemna minor L. (RU патент 2175843 C1; МКИ 7 A23L 1/0524, С08В 37/06), включающий разрушение сырья, отделение от жидкой фракции, обработку этанолом и хлороформом для удаления низкомолекулярных примесей, экстрагирование водой для удаления водорастворимых полисахаридов, обработку сырья раствором соляной кислоты, промывку водой, экстракцию пектиновых полисахаридов водным раствором оксалата аммония, концентрирование экстракта, осаждение этанолом, диализ и лиофильную сушку (прототип).

Однако известный способ не позволяет получить из биомассы культивируемых in vitro тканей растений целевой продукт с заданной структурой.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа получения пектиновых полисахаридов из биомассы культивируемых тканей растений, который позволяет получить физиологически активные пектины с заданной структурой, обладающие стабильным химическим составом, в частности модифицированные пектины из биомассы культуры ткани Silene vulgaris (М.) G. с увеличенным содержанием остатков галактозы в боковых углеводных цепях.

Технический результат достигается тем, что каллусные культуры выращивают на агаризованной модифицированной питательной среде, которая содержит фермент 1,4-β-D-галактозилтрансферазу (ЕС 2.4.1.22). Далее сырье разрушают, отделяют от жидкой фракции, экстрагируют водой для удаления водорастворимых полисахаридов, далее обрабатывают раствором соляной кислоты при рН 3.7-4.3, затем осуществляют экстракцию пектиновых полисахаридов водным раствором оксалата аммония, экстракт концентрируют, осаждают этанолом, диализуют и лиофильно высушивают, при этом в качестве сырья используют биомассу культивируемых тканей растений, например смолевки обыкновенной (Silene vulgaris).

Полученные пектиновые полисахариды обладают иммуномодулирующей активностью, тонкое строение боковых углеводных цепей пектинов (в частности, линейные и разветвленные блоки галактана и арабинана) определяет способность стимулировать активность лейкоцитов. На основе пектинов с развитой разветвленной областью возможно получение адъювантов для пероральной иммунизации людей и животных.

Способ осуществляется следующим образом. Для выращивания каллусной ткани Silene vulgaris готовят питательную среду, используя химически чистые реактивы (хч, чда). Предварительно готовят концентрат макросолей по Мурасиге и Скугу, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей по Мурасиге и Скугу, Fe-хелата, витаминов по Стаба, 1,4-β-D-галактозилтрансферазы. Макро- и микросоли, Fe-хелат, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП, 2,4-Д, сахарозу и все тщательно перемешивают.Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л и устанавливают рН 5.6-5.8. В колбы на 250 мл насыпают по 2 г агар-агара, разливают среду по 250 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 2-3 атм. Концентрат 1,4-β-D-галактозилтрансферазы стерилизуют с помощью фильтров с размером пор 22 мкм, затем добавляют в колбы после автоклавирования питательной среды. В стерильном боксе в чашки Петри разливают по 30 мл питательной среды. Культивирование каллусной ткани проводится в термостате при 26±1°C в условиях непрерывной темноты. Спустя 21 сутки из выросшего каллуса выделяют пектиновые полисахариды.

Биомассу разрушают путем ее однократного замораживания-оттаивания, отделяют от жидкой фракции методом центрифугирования, экстрагируют водой в соотношении сырье (сырая масса): вода 1:7-20 при температуре 45-70°C в течение 2-4 ч для удаления водорастворимых полисахаридов, обрабатывают раствором соляной кислоты (рН 3.7-4.3; соотношение сырье:раствор 1:4-10) при 45-55°C в течение 3-4 ч, биомассу промывают водой, затем осуществляют экстракцию пектиновых полисахаридов водным 0.3-0.7%-ным раствором оксалата аммония в соотношении сырье:раствор 1:10-20 при 65-75°C в течение 2-6 ч, после чего экстракт концентрируют, осаждают 96%-ным этанолом в соотношении экстракт: спирт 1:2-4 в течение 2-24 ч, диализуют и лиофильно высушивают, в качестве сырья используют биомассу культивируемых тканей растений, например, Silene vulgaris.

Пример 1 (контроль). Для выращивания каллусной ткани Silene vulgaris готовят питательную среду, используя химически чистые реактивы (хч, чда). Предварительно готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, Fe-хелата, витаминов. Макро- и микросоли, Fe-хелат, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 0.5 мг/л 6-БАП, 1.0 мг/л 2,4-Д, 15 г/л сахарозы, 15 г/л глюкозы и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л и устанавливают рН 5.6. В колбы на 250 мл насыпают по 2 г агар-агара, разливают среду по 250 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 2-3 атм. Чашки Петри стерилизуют в сухожаровом шкафу при 180°C, завернутые в бумагу Крафт. В стерильном боксе в чашки Петри разливают по 30 мл питательной среды. Культивирование каллусной ткани проводится в термостате при 26±1°C в условиях непрерывной темноты. Спустя 21 сутки из выросшего каллуса выделяют пектиновые полисахариды.

Биомассу разрушают путем ее однократного замораживания-оттаивания, отделяют от жидкой фракции методом центрифугирования, дважды экстрагируют водой в соотношении сырье (сырая масса): вода 1:10 при температуре 50°C в течение 2 ч для удаления водорастворимых полисахаридов, обрабатывают раствором соляной кислоты (рН 3.9-4.1; соотношение сырье:раствор 1:10) при 50°C в течение 3 ч, биомассу промывают водой, затем осуществляют дважды экстракцию пектиновых полисахаридов водным 0.7%-ным раствором оксалата аммония в соотношении сырье: раствор 1:10 при 68-70°C в течение 2 ч, после чего экстракт концентрируют, осаждают 96%-ным этанолом в соотношении экстракт:спирт 1:2 в течение 24 ч, отделяют центрифугированием, растворяют в дистиллированной воде и диализуют против дистиллированной воды. Полученный полисахарид высушивают лиофильно. Выход целевого продукта составил 3.1% от сухой биомассы, содержание D-галактроновой кислоты в выделенном пектиновом полисахариде 65%, содержание остатков галактозы 2.9%. Результаты испытания представлены в таблице 1.

Примеры 2-4. Выращивание каллусной ткани Silene vulgaris и выделение из нее пектинов проводят аналогично примеру 1, различием является модификация питательной среды, включающая 1,4-β-D-галактозилтрансферазу в концентрации 0.001, 0.01 и 0.1 мг/мл. Выход целевого продукта от сухой биомассы составил 3.2, 2.4 и 2.3% соответственно. Содержание D-галактроновой кислоты в выделенных пектинах 70, 69 и 73% соответственно, содержание остатков галактозы 4.7, 3.7 и 4.0% соответственно. Результаты испытания 3 модификаций питательных сред представлены в таблице 1.

Таблица 1
Вариант	1,4-β-D-галактозилтрансфераза, мг/мл	D-галактуроновая кислота, %	Галактоза, %
1 (контроль)	0	65.1±6.4	2.9±0.3
2	0.001	69.8±4.3	4.7±0.1∗
3	0.01	68.6±1.8	3.7±0.2∗
4	0.1	73.4±3.2	4.0±0.5∗
∗ Различия достоверны при р<0.05.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить с высоким выходом модифицированные пектиновые полисахариды с увеличенным содержанием остатков галактозы в боковых углеводных цепях из биомассы культивируемых тканей растений, что важно для получения пектинов с заданной структурой, обладающих определенными видами физиологической активности.

Способ получения из каллусных культур пектинов с увеличенным содержанием остатков галактозы в боковых углеводных цепях, включающий разрушение сырья, экстракцию водой для удаления водорастворимых полисахаридов, обработку биомассы раствором соляной кислоты, промывку водой, экстракцию раствором оксалата аммония, осаждение полисахарида этанолом, диализ и лиофилизацию, отличающийся тем, что предварительно каллусные культуры в течение 21 суток выращивают на агаризованной питательной среде, которая содержит фермент 1,4-β-D-галактозилтрансферазу в концентрации 0.001-0.1 мг/мл, а в качестве сырья используют биомассу культивируемых тканей растений Silene vulgaris.