Новая ацетил-coa-карбоксилаза

Новая ацетил-coa-карбоксилаза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новой ацетил-CoA-карбоксилазе.

Предпосылки создания изобретения

Жирные кислоты являются важными составляющими липидов, таких как фосфолипиды и триацилглицериды. Известно, что жирные кислоты, содержащие две или более ненасыщенных связей, которые обобщенно называются полиненасыщенными жирными кислотами (PUFA), включают арахидоновую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и докозагексаеновую кислоту. В литературе опубликованы данные о различных видах физиологической активности таких жирных кислот (непатентный документ 1).

Среди них привлекает внимание арахидоновая кислота в качестве промежуточного метаболита при синтезе простагландинов, лейкотриенов и т.п., и было предпринято множество попыток использовать ее в качестве материала для функциональных продуктов питания и лекарственных средств. Кроме того, арахидоновая кислота содержится в грудном молоке, так что она важна для роста младенцев, особенно, для роста и развития мозга эмбриона, и поэтому она привлекает внимание также как и DHA (докозагексаеновая кислота) в пищевом аспекте как необходимый компонент для роста младенцев.

Предполагается, что такие полиненасыщенные жирные кислоты найдут применение в различных областях, но некоторые из них не могут быть синтезированы in vivo у животных. Это привело к разработке способов получения полиненасыщенных жирных кислот путем культивирования различных микроорганизмов. Также предпринимались попытки продукции полиненасыщенных жирных кислот в растениях. В этом случае известно, что полиненасыщенные жирные кислоты накапливаются в виде компонентов запасных липидов, таких как триацилглицериды, например, в микробных клетках или семенах растений.

Хотя молекулярные структуры ферментов, вовлеченных в de novo синтез жирных кислот и удлинение цепей жирных кислот, отличаются у прокариотов и эукариотов, механизмы ферментативных реакций похожи для любых типов клеток. Биосинтез жирных кислот начинается с ацетил-CoA, и из ацетил-CoA образуется малонил-CoA в результате катализа ацетил-CoA-карбоксилазой (E.C.6.4.1.2). Различные насыщенные жирные кислоты синтезируют путем добавления двух атомов углерода посредством декарбоксилирующего сочетания ацетил-CoA с малонил-CoA в серии реакций конденсации-восстановления-дегидратации-восстановления, катализируемых синтетазами жирных кислот (FAS). Аналогичным образом, реакции удлинения цепи жирной кислоты включают добавление двух атомов углерода посредством декарбоксилирующего сочетания ацетил-CoA с малонил-CoA в серии реакций конденсации-восстановления-дегидратации-восстановления.

В настоящее время ацетил-CoA-карбоксилазы (далее также называемые «АСС») известны для нескольких организмов. АСС млекопитающих представляют собой конкретные аллостерические ферменты, активируемые лимонной кислотой, ингибируемые сложными эфирами CoA и длинноцепочечных жирных кислот и инактивируемые фосфорилированием. У грибов интенсивно исследуется АСС из дрожжей (Saccharomyces cerevisiae).

АСС из S. cerevisiae локализована в цитоплазме и митохондриях и кодируется генами ACC1 и HFA1, соответственно. Известно, что ген АСС1 является необходимым геном, делеция которого приводит к гибели клетки (непатентный документ 2). Анализ различных штаммов выявил, что ген АСС1 также вовлечен в транспорт (полиА+)мРНК из ядра, а также имеет другие функции (непатентный документ 3).

Предпринимались попытки увеличить содержание жиров в семенах растений с использованием генов АСС (непатентный документ 4). Например, опубликовано, что содержание жирных кислот в расчете на сухую массу увеличивается, а также изменяется соотношение состава жирных кислот в семенах трансгенной Brassica napus L., экспрессирующей ACC из Arabidopsis thaliana (непатентный документ 5). Однако картина изменения соотношения состава жирных кислот зависит от соотношения состава жирных кислот, присущих организму-хозяину, и трансдуцированного гена АСС. С другой стороны, активность АСС регулируется различным образом не только на уровне экспрессии, но также и на уровне белка (непатентные документы 3 и 4), а также на нее влияют взаимодействия с другими ферментами, функционирующими в ряде систем синтеза жирных кислот. Поэтому, для получения желаемой композиции жирных кислот в зависимости от трансформируемого организма-хозяина может потребоваться соответствующий ген АСС.

Для продуцирующего липиды гриба Mortierella alpina (далее также называемого «M. alpina») в качестве гена АСС ранее был известен фрагмент гена гомолога АСС из штамма CBS 528.72, предположительно обладающего АСС-активностью (ацетил-CoA-карбоксилазной активностью) (непатентный документ 6). Однако до настоящего времени не было подтверждено, что белок, содержащий такой фрагмент, обладает АСС-активностью. Была проведена оценка штамма M. alpina CBS696.70 по накоплению жира и ацетил-CoA-карбоксилазной активности (непатентный документ 7).

Ссылки

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Lipids, 39, 1147 (2004)

Непатентный документ 2: Giaever G. et al. Nature 418, 387-91 (2002)

Непатентный документ 3: O. Tehlivets et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1771, 255-270 (2007)

Непатентный документ 4: Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (6), 1175-1184, (2004)

Непатентный документ 5: Plant Physiol. 113, 75-81 (1997)

Непатентный документ 6: The International Nucleotide Sequence Database accession number AJ586915

Непатентный документ 7: Microbiology, 145, 1911-1917 (1999)

Краткое описание сущности изобретения

Технические проблемы

Однако известно, что гены АСС, о которых сообщалось до настоящего времени, не обладают достаточным влиянием на метаболизм липидов при их переносе и экспрессии в организмах-хозяевах. Их недостатком также является то, что они недостаточно эффективно увеличивают или уменьшают накопление жиров или жирных кислот в некоторых хозяевах. Поэтому необходим новый белок, который при переносе и экспрессии в клетке-хозяине будет влиять на метаболизм липидов хозяина. Также необходим новый белок, способный продуцировать жиры с высоким содержанием промышленно значимых жирных кислот.

Способ решения проблем

Задачей настоящего изобретения является предоставление белков и нуклеиновых кислот, способных продуцировать ценные жиры путем экспрессии в клетке-хозяине для влияния на метаболизм липидов хозяина или для увеличения содержания желаемой жирной кислоты.

Для достижения поставленной задачи авторы изобретения провели тщательные исследования. Во-первых, с помощью EST-анализа продуцирующего липиды гриба M. alpina были выявлены последовательности, имеющие высокую гомологию с известными генами АСС. Для получения полноразмерной открытой рамки считывания (ORF), кодирующей АСС, при помощи скрининга кДНК-библиотеки или ПЦР была клонирована полноразмерная кДНК. Путем ее трансформации в высокопролиферирующую клетку-хозяина, такую как дрожжевая клетка, авторы изобретения предприняли попытку продуцировать композицию жирных кислот и успешно клонировали ген новой АСС, способной продуцировать композицию жирных кислот, отличающуюся от композиции, продуцируемой хозяевами, экспрессирующими обычные АСС, и в итоге осуществили настоящее изобретение. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает следующие аспекты:

(1) Нуклеиновую кислоту по любому из (а)-(e) ниже:

(а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью;

(b) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью;

(c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью;

(d) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью; и

(e) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью.

(2) Нуклеиновую кислоту по пункту (1), которой является любая из (а)-(e) ниже:

(а) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью;

(b) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью; и

(c) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 90% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью;

(d) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 90% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью; и

(e) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью.

(3) Нуклеиновую кислоту по любому из (а)-(c) ниже:

(а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1, или ее фрагмент;

(b) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, или ее фрагмент;

(c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:4, или ее фрагмент.

(4) Нуклеиновую кислоту по любому из (а)-(e) ниже:

(а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах;

(b) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах;

(c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах;

(d) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах; и

(e) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах.

(5) Нуклеиновую кислоту по пункту (4), которой является любая из (а)-(e) ниже:

(а) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах;

(b) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах;

(c) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 90% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах;

(d) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 90% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах; и

(e) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах.

(6) Белок по (а) или (b) ниже:

(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью; или

(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью.

(7) Белок по (а) или (b) ниже:

(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью; или

(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 90% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активность

(8) Белок по (а) или (b) ниже:

(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, восполняющей отсутствие ацетил-CoA-карбоксилазы у дрожжей; или

(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, восполняющей отсутствие ацетил-CoA-карбоксилазы у дрожжей.

(9) Белок по (а) или (b) ниже:

(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, восполняющей отсутствие ацетил-CoA-карбоксилазы у дрожжей; или

(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 90% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, восполняющей отсутствие ацетил-CoA-карбоксилазы у дрожжей.

(10) Белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2.

(11) Рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пунктов (1)-(5).

(12) Клетку, трансформированную рекомбинантным вектором по пункту (11).

(13) Композицию жирных кислот, полученную культивированием трансформированной клетки по пункту (12).

(14) Способ получения композиции жирных кислот по пункту (13), включающий сбор композиции жирных кислот из культуры трансформированных клеток по пункту (12).

(15) Продукт питания, содержащий композицию жирных кислот по пункту (13).

(16) Нуклеиновую кислоту по любому из (а)-(e) ниже:

(а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина;

(b) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина;

(c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина;

(d) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина; и

(e) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина.

(17) Белок по (а) или (b) ниже:

(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина; или

(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина.

Дополнительно, настоящее изобретение также охватывает следующие аспекты:

(А) Нуклеиновую кислоту по любому из (а)-(e) ниже:

(а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина;

(b) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях, предпочтительно, в условиях 2×SSC при 50°C, с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина;

(c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность, предпочтительно, 90% или большую с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина;

(d) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 80% идентичность или большую, предпочтительно, 90% идентичность или большую с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина; и

(e) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях, предпочтительно, в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина.

(B) Белок по (а) или (b) ниже:

(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина; или

(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 80% идентичность или большую, предпочтительно, 90% или большую с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина.

Дополнительно, настоящее изобретение также охватывает: (C) рекомбинантный вектор, содержащий любую из нуклеиновых кислот, представленных в пункте (А); (D) клетку, трансформированную рекомбинантным вектором; (E) композицию жирных кислот, полученную культивированием трансформированной клетки, имеющей измененное содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот по сравнению с параметрами, характерными для культур хозяина, не трансформированных рекомбинантным вектором по пункту (C); (F) способ получения композиции жирных кислот по пункту (E), включающий сбор композиции жирных кислот по пункту (E) из культур трансформированных клеток по пункту (D); и (G) продукт питания, содержащий композицию жирных кислот по пункту (E).

Предпочтительные эффекты изобретения

АСС настоящего изобретения улучшает способность продуцировать жирные кислоты и/или запасные липиды и, поэтому, предпочтительна в качестве средства улучшения продукции полиненасыщенных жирных кислот у микроорганизмов и растений. Таким образом, из них можно получить липиды с желаемыми характеристиками или эффектами, которые пригодны для использования в продуктах питания, косметических продуктах, фармацевтических продуктах, мылах и т.д.

Краткое описание фигур

На фиг.1А показана полноразмерная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) ACC из штамма M. alpina 1S-4 и выведенная из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2).

На фиг.1В показана полноразмерная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) ACC из штамма M. alpina 1S-4 и выведенная из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2).

На фиг.1С показана полноразмерная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) ACC из штамма M. alpina 1S-4 и выведенная из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2).

На фиг.1D показана полноразмерная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) ACC из штамма M. alpina 1S-4 и выведенная из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2).

На фиг.2А показано сравнение между полноразмерной последовательностью кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4 и нуклеотидной последовательностью фрагмента гомолога АСС из известного штамма M. alpina CBS528.72.

На фиг.2В показано сравнение между полноразмерной последовательностью кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4 и нуклеотидной последовательностью фрагмента гомолога АСС из известного штамма M. alpina CBS528.72.

На фиг.2С показано сравнение между полноразмерной последовательностью кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4 и нуклеотидной последовательностью фрагмента гомолога АСС из известного штамма M. alpina CBS528.72.

На фиг.2D показано сравнение между полноразмерной последовательностью кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4 и нуклеотидной последовательностью фрагмента гомолога АСС из известного штамма M. alpina CBS528.72.

На фиг.3А показано сравнение между аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:25), образованной из фрагмента кДНК АСС из штамма M. alpina CBS528.72.

На фиг.3В показано сравнение между аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:25), образованной из фрагмента кДНК АСС из штамма M. alpina CBS528.72.

На фиг.3С показано сравнение между аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:25), образованной из фрагмента кДНК АСС из штамма M. alpina CBS528.72.

На фиг.4А показано сравнение аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:34) цитоплазматической АСС, Асс1р, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:35) митохондриальной ACC, Hfa1p, из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

На фиг.4В показано сравнение аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:34) цитоплазматической АСС, Асс1р, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:35) митохондриальной ACC, Hfa1p, из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

На фиг.4С показано сравнение аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:34) цитоплазматической АСС, Асс1р, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:35) митохондриальной ACC, Hfa1p, из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

На фиг.4D показано сравнение аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:34) цитоплазматической АСС, Асс1р, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:35) митохондриальной ACC, Hfa1p, из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

На фиг.4Е показано сравнение аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:34) цитоплазматической АСС, Асс1р, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:35) митохондриальной ACC, Hfa1p, из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Фиг.5 является схематической диаграммой, на которой показана плазмида pSDY-ACC. На данной фигуре hisH4.1p представляет промотор гена гистона H4.1 из M. alpina, trpCt представляет терминатор гена trpC из Aspergillus nidulans, ura5 представляет ген ura5 из M. alpina, и рДНК представляет часть 18S рДНК (рибосомной ДНК) из M. alpina. Стрелки (→) на схеме указывают положения праймеров ACC-F7 и trpCt-R, используемых для идентификации трансформированных штаммов.

Фиг.6 является графиком, показывающим изменение во времени сухой массы клеток трансформированных штаммов M. alpina. Ось ординат: сухая масса клеток (г/пробирка); ось абсцисс: время инкубации (дни).

Фиг.7 является графиком, показывающим изменение во времени количества жирных кислот, продуцируемых трансформированными штаммами M. alpina. Ось ординат: количество продуцируемых жирных кислот (мг/л среды); ось абсцисс: время инкубации (дни).

Фиг.8 является графиком, показывающим соотношение состава жирных кислот трансформированных штаммов M. alpina на 8-й день инкубации. Ось ординат: соотношение состава жирных кислот; ось абсцисс: клетка-хозяин и трансформированные штаммы. Условные обозначения на графике: EPA: эйкозапентаеновая кислота; ARA: арахидоновая кислота; DGLA: дигомо-γ-линоленовая кислота; GLA: γ-линоленовая кислота; LA: линолевая кислота; OA: олеиновая кислота; SA: стеариновая кислота; PA: пальмитиновая кислота.

Описание вариантов осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к новой ацетил-CoA-карбоксилазе из рода Mortierella, характеризуемой катализируемой реакцией получения малонил-CoA посредством АТФ-зависимого карбоксилирования ацетил-CoA.

Реакция получения малонил-CoA из ацетил-CoA, опосредуемая ацетил-CoA-карбоксилазой настоящего изобретения (далее также называемой «АСС»), является ключевой, лимитирующей стадией в биосинтезе жирных кислот. Это означает, что АСС представляет собой ключевой фермент, отвечающий за поставку малонил-CoA, который является важным промежуточным соединением в синтезе жирных кислот. Более конкретно, АСС представляет собой фермент, катализирующий следующую реакцию:

[Формула 1]

АТФ+ацетил-CoA+HCO₃ ^-<=>АДФ+Pi+малонил-CoA

Таким образом, такие ферменты катализируют реакцию получения малонил-CoA посредством АТФ-зависимого карбоксилирования ацетил-CoA. Эта реакция проходит в две стадии, показанные ниже:

[Формула 2]

(1) BCCP*+HCO₃ ^-+Mg₂ ⁺-АТФ→BCCP-CO₂ ^-+Mg₂ ⁺-АДФ+Pi (биотин-карбоксилтранфераза)

(2) BCCP-CO₂ ^-+ацетил-CoA→BCCP+малонил-CoA (карбоксилтрансфераза)

BCCP*: белок-носитель биотинкарбоксила

Малонил-CoA, продуцируемый по данной реакции, служит в качестве субстрата для de novo реакции синтеза жирных кислот или реакции удлинения цепи жирной кислоты при синтезе различных жирных кислот. Таким образом, известно, что АСС настоящего изобретения играет важную роль в регуляции биосинтеза жирных кислот или метаболизма липидов.

Малонил-CoA, продуцируемый АСС настоящего изобретения, является субстратом в синтезе жирных кислот, описанном выше, и скорость продукции малонил-CoA определяет скорость in vivo биосинтеза жирных кислот. Более конкретно, de novo синтез жирных кислот начинается с ацетил-CoA, к которому для синтеза новых жирных кислот добавляют два атома углерода путем декарбоксилирующего присоединения малонил-CoA в серии реакций конденсации-восстановления-дегидратации-восстановления. Например, пальмитиновую кислоту, содержащую 16 атомов углерода, синтезируют семью циклами серий реакций конденсации-восстановления-дегидратации-восстановления, при этом два атома углерода на метильном конце данной пальмитиновой кислоты являются производными ацетил-CoA, и другие являются производными малонил-CoA. Малонил-CoA не только является промежуточным соединением в биосинтезе жирных кислот, но также является промежуточным соединением в биосинтезе поликетидов.

Кроме того, ацетил-CoA-карбоксилаза настоящего изобретения обладает активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах, которая подробно описана ниже.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие ацетил-CoA-карбоксилазу настоящего изобретения

Последовательности, относящиеся к ацетил-CoA-карбоксилазе настоящего изобретения (АСС), включают SEQ ID NO:1, представляющую собой область открытой рамки считывания (ORF-область) ACC из M. alpina 1S-4; SEQ ID NO:2, представляющую собой ее аминокислотную последовательность; SEQ ID NO:3, представляющую собой область кодирующей последовательности (CDS-область); SEQ ID NO:4, представляющую собой нуклеотидную последовательность кДНК; и SEQ ID NO:5, представляющую собой геномную нуклеотидную последовательность. Более конкретно, SEQ ID NO:3 соответствует нуклеотидам 45-6734 из SEQ ID NO:4, и SEQ ID NO:1 соответствует нуклеотидам 45-6731 из SEQ ID NO:4 и нуклеотидам 1-6684 из SEQ ID NO:3. Геномная последовательность SEQ ID NO:5 содержит пять интронных и экзонных областей, соответствующих нуклеотидам 1-27, 315-665, 1271-2828, 2917-3463, 3590-6239 и 6339-7889 из SEQ ID NO:5.

Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения включают одноцепочечные и двухцепочечные ДНК, а также комплементарную им РНК, и могут быть либо природными, либо полученными искусственно. Например, ДНК включает, но не ограничивается ими, геномную ДНК, кДНК, соответствующую геномной ДНК, химически синтезированную ДНК, ПЦР-амплифицированную ДНК и их комбинации, а также ДНК/РНК-гибриды.

Предпочтительные варианты нуклеиновых кислот настоящего изобретения включают (а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1; (b) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2; (c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:4; или (d) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:5, и т.д.

Для получения вышеперечисленных нуклеотидных последовательностей можно провести поиск нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки, имеющие высокий процент идентичности с известным белком с АСС-активностью, по базе данных нуклеотидных последовательностей EST или геномной ДНК из организма, обладающего АСС-активностью. Организмом, обладающим АСС-активностью, предпочтительно, является продуцирующие липиды грибки, такие как, но без ограничения, M. alpina.

Для проведения EST-анализа сначала конструируют кДНК-библиотеку. Методики создания кДНК-библиотеки можно найти в «Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.» (Cold Spring Harbor Press (2001)). Также можно использовать коммерчески доступные наборы для создания кДНК-библиотеки. Например, методика создания кДНК-библиотеки, подходящей для настоящего изобретения, является следующей. А именно, соответствующую среду инокулируют соответствующим штаммом продуцирующих липиды грибков M. alpina, и предварительно культивируют в течение соответствующего периода времени. Например, условия культивирования, подходящие для данного предварительного культивирования, включают среду, состоящую из 1,8% глюкозы, 1% дрожжевого экстракта, рН 6,0, и культивирование в течение 3 дней при температуре инкубации 28°C. Затем из продукта предварительного культивирования получают основную культуру в соответствующих условиях. Например, композиция культуральной среды, подходящей для основной культуры, может содержать 1,8% глюкозы, 1% порошка соевых бобов, 0,1% оливкового масла, 0,01% адеканола, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% Na₂SO₄, 0,05% CaCl₂·2H₂O, 0,05% MgCl₂·6H₂O, pH 6,0. Условия инкубации, подходящие для основной культуры, включают инкубацию при аэрации и встряхивании при 300 об/мин, 1 vvm, 26°C, в течение 8 дней. В ходе инкубации можно добавлять соответствующее количество глюкозы. Культуры собирают в соответствующих временных точках в ходе основного культивирования, и клетки собирают для получения тотальной РНК. Тотальную РНК можно выделить с помощью известной методики, такой как способ с использованием гуанидинхлорида/CsCl. Поли(А)+РНК можно очистить из полученной тотальной РНК с помощью коммерчески доступного набора. Кроме того, кДНК-библиотеку можно создать, используя коммерчески доступный набор. Затем можно получить данные о EST путем определения нуклеотидных последовательностей любых клонов из созданной кДНК-библиотеки, используя праймеры, подобранные для секвенирования вставки в векторе. Например, можно провести направленное клонирование, когда кДНК-библ