Специфические в отношении амилоида бета (а бета) 1-42 моноклональные антитела, обладающие терапевтическими свойствами

Специфические в отношении амилоида бета (а бета) 1-42 моноклональные антитела, обладающие терапевтическими свойствами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, предназначенным для терапевтического и диагностического применения при лечении заболеваний и нарушений, которые вызываются или ассоциированы с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая амилоидоз, группу нарушений и патологий, ассоциированных с амилоидным белком, таких как болезнь Альцгеймера.

Амилоидоз представляет собой не отдельное заболевание, а скорее группу разнообразных прогрессирующих болезненных процессов, которые характеризуются внеклеточными отложениями в ткани воскообразного крахмалоподобного белка, называемого амилоидом, который накапливается в одном или нескольких органах или системах организма. После образования амилоидных отложений они начинают препятствовать нормальному функционированию органа или системы организма. Существует по меньшей мере 15 различных типов амилоидоза. Основными формами являются первичный амилоидоз, не имеющий известных предвестников (состояний-предшественников) заболевания, вторичный амилоидоз, возникающий после определенного другого состояния, и наследственный амилоидоз.

Вторичный амилоидоз возникает у людей, страдающих хроническим инфекционным или воспалительным заболеванием, таким как туберкулез, бактериальная инфекция, которую называют семейной средиземноморской лихорадкой, костными инфекционные заболевания (остеомиелит), ревматоидный артрит, воспаление тонкого кишечника (гранулематозный илеит), болезнь Ходжкина и проказа.

Амилоидные отложения, как правило, включают три компонента. Амилоидные белковые фибриллы, на долю которых приходится примерно 90% амилоидного материала, состоят из одного или нескольких различных типов белков. Фибриллы этих белков обладают способностью принимать так называемую «бета-складчатую конформацию», представляющую собой уникальную конфигурацию белка, которая обладает сайтами связывания с красителем конго красным, что обусловливает уникальную способность амилоидного белка к окрашиванию. Кроме того, амилоидные отложения тесно ассоциированы с компонентом, представляющим собой амилоид Р (пентагональный) (АР), гликопротеин, родственный обычному сывороточному амилоиду Р (амилоидному белку) (SAP), и сульфатированными гликозаминогликанами (GAG), сложными углеводами, присутствующими в соединительной ткани.

Многие связанные с возрастом заболевания обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками и характеризуются, в частности, образованием внеклеточных отложений амилоида или амилоидоподобного материала, которые участвуют в патогенезе, а также в развитии заболевания. Такие заболевания включают (но не ограничиваясь ими) неврологические нарушения, такие как болезнь Альцгеймера (AD), включая заболевания или состояния, характеризующиеся утратой когнитивной способности к запоминанию, такие, например, как умеренное ухудшение когнитивной способности (MCI), деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственное церебральное кровоизлияние, сопровождающееся амилоидозом (типа Дутча); комплекс деменции Гуама-Паркинсона. Другие заболевания, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, представляют собой прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотрофический боковой склероз), миозит, вызываемый тельцами включения (IBM), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли и другие заболевания, включая дегенерацию желтого пятна.

Хотя патогенез этих заболеваний может быть различным, характерные для них отложения часто содержат многие сходные молекулярные компоненты. В значительной степени это может относиться к местной активации провоспалительных путей, приводя тем самым к конкурентному отложению компонентов активированного комплемента, реактантов острой фазы, иммуномодуляторов и других воспалительных медиаторов (McGeer и др., 1994).

Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой неврологическое нарушение, которое, как предполагается, вызывается прежде всего амилоидными бляшками, накоплением патологических отложений белков в головном мозге. Наиболее часто встречающийся тип амилоида, выявленный в головном мозге пораженных заболеванием индивидуумов, в основном состоит из Aβ-фибрилл. Научно доказано, что увеличение производства и накопления бета-амилоидного белка в бляшках приводит к гибели нервных клеток, что способствует возникновению и развитию болезни Альцгеймера. В свою очередь, утрата нервных клеток в стратегически важных областях головного мозга приводит к уменьшению уровня нейромедиаторов и ухудшению памяти. К белкам, которые в первую очередь ответственны за образование бляшки, относятся амилоидный белок-предшественник (АРР) и два пресенилина (пресенилин I и пресенилин II). Последовательное расщепление амилоидного белка-предшественника (АРР), который конститутивно экспрессируется и катаболизируется в большинстве клеток, ферментами β- и γ-секретазами приводит к высвобождению состоящего из 39-43 аминокислот Aβ-пептида. Расщепление АРР, по-видимому, приводит к повышению их способности к агрегации с образованием бляшек. Aβ(1-42)-фрагмент обладает прежде всего наиболее высокой способностью образовывать агрегаты благодаря наличию двух высокогидрофобных аминокислотных остатков на его С-конце. Поэтому предполагается, что прежде всего Aβ(1-42)-фрагмент участвует и ответственен за инициацию образования нейритной бляшки при болезни Альцгеймера и, следовательно, обладает высоким патологическим потенциалом. Таким образом, существует необходимость в создании специфических антител, которые могут направленно воздействовать на образование амилоидных бляшек и разрушать их.

Симптомы AD проявляются медленно, и первым симптомом может быть лишь слабая забывчивость. На этой стадии индивидуумы могут забывать последние события, действия, имена знакомых людей или названия вещей и могут быть не в состоянии решить простые математические задачи. По мере прогрессирования болезни симптомы становятся более заметными и настолько серьезными, что вынуждают людей, пораженных AD, или членов их семьи прибегать к медицинской помощи. Симптомы, характерные для средней стадии AD, включают забывание того, как выполнять простые функции, такие как приводить себя в порядок, при этом возникают проблемы с речью, пониманием, чтением или письмом. Пациенты на поздней стадии AD могут становиться боязливыми или агрессивными, могут уходить далеко от дома и, в конце концов, нуждаться в полном уходе.

В настоящее время единственным надежным путем диагностики AD является идентификация бляшек и сплетений в ткани головного мозга при вскрытии после смерти индивидуума. Таким образом, пока индивидуум еще жив, доктора могут ставить только диагноз «возможна» или «вероятна» AD. С помощью современных методов лечащие врачи могут правильно диагностировать вплоть до 90 процентов случаев AD с помощью ряда средств, позволяющих диагностировать «возможную» AD. Лечащие врачи задают вопросы об общем состоянии здоровья индивидуума, медицинских проблемах, имевших место в прошлом, и истории каких-либо затруднений у индивидуума при выполнении повседневных действий. Поведенческие тесты на память, решение задач, внимание, счет и речь позволяют получать информацию о когнитивной дегенерации, а медицинские анализы, такие как анализы крови, мочи или спинномозговой жидкости, и сканирование головного мозга могут дать некоторую дополнительную информацию.

Борьба с AD заключается в осуществлении лечения, основанного на применении лекарственных средств, и лечения без использования лекарственных средств (немедикаментозного лечения). Лечение с целью изменения основного течения болезни (замедления или реверсирования развития) до сих пор были по большей части безуспешными. Было продемонстрировано, что лекарственные средства, которые восстанавливают дефицит (дефект) или недостаточную функцию химических медиаторов нервных клеток (нейромедиаторов), в частности ингибиторы холинэстеразы (ChEI), такие как такрин и ривастигмин, позволяют улучшать симптомы. ChEI задерживают ферментативное расщепление нейромедиаторов, повышая тем самым количество химических медиаторов, пригодных для передачи нервных сигналов в головном мозге.

Для некоторых людей на ранней и средней стадиях заболевания такие лекарственные средства, как такрин (COGNEX®, Моррис-Плейнс, шт.Нью-Джерси), донепезил (ARICEPT®, Токио, Япония), ривастигмин (EXELON®, Ист-Хановер, шт.Нью-Джерси) или галантамин (REMINYL®, Нью-Брансуик, шт.Нью-Джерси), могут предупреждать ухудшение некоторых симптомов в течение ограниченного периода времени. Другое лекарственное средство, мемантин (NAMENDA®, Нью-Йорк, шт.Нью-Йорк), разрешено для лечения AD от средней до тяжелой степени. Лекарственные средства могут воздействовать также на психиатрические проявления AD. Некоторые лекарственные средства могут помогать также контролировать поведенческие симптомы AD, такие как бессонница, возбуждение, блуждание, тревога и депрессия. Лечение этих симптомов часто делает жизнь пациентов более комфортной и облегчает обслуживающему персоналу уход за ними. К сожалению, несмотря на значительные успехи лечения, демонстрирующие, что этот класс агентов существенно превосходит по эффективности плацебо, болезнь продолжает прогрессировать, а влияние на умственные функции в среднем является очень ограниченным. Многие лекарственные средства, применяемые для лечения AD, такие, например, как ChEI, обладают также побочными действиями, которые включают желудочно-кишечные нарушения, токсичность для печени и потерю веса.

К другим заболеваниям, которые обусловлены или ассоциированы с накоплением и отложением амилоидоподобного белка, относятся умеренное когнитивное нарушение, деменция, связанная с тельцами Леви (LBD), амиотрофический боковой склероз (ALS), миозит, вызываемый тельцами включения (IBM), и дегенерация желтого пятна, прежде всего связанная с возрастом дегенерация желтого пятна (AMD).

Умеренное когнитивное нарушение (MCI) является общим понятием, которое включает наиболее часто встречающиеся небольшие, но заметные нарушения памяти. Индивидуум, страдающий MCI, испытывает больше затруднений, связанных с памятью, чем это можно ожидать в связи с возрастом, однако не имеет других симптомов деменции, таких как нарушение рассудительности и логического хода мысли. MCI представляет собой состояние, которое часто является свидетельством преклинической стадии AD.

Отложение β-амилоида в энторинальной области коры головного мозга (ЕС), по-видимому, играет основную роль в развитии умеренного когнитивного нарушения (MCI) в престарелом возрасте. Это согласуется с данными о том, что уровни Аβ(1-42) в CSF (спинномозговая жидкость)-А существенно снижаются, когда клинические признаки AD становятся явными. В отличие от CSF-A, уровни Аβ(1-42) в CSF-тау существенно повышаются на стадии MCI, и эти уровни продолжают оставаться повышенными в дальнейшем, это свидетельствует о том, что повышенные уровни в CSF-тау можно использовать для обнаружения индивидуумов, страдающих MCI, которые предрасположены к развитию AD.

Деменция, связанная с тельцами Леви (LBD), представляет собой нейродегенеративное нарушение, которое может возникать у индивидуумов старше 65 лет, как правило, вызывающее симптомы когнитивного (мыслительного) нарушения и патологические изменения поведения. Симптомы могут включать когнитивное нарушение, неврологические признаки, нарушение сна и неспособность к самостоятельным действиям. Когнитивное нарушение в большинстве случаев является характерной особенностью LBD. У пациентов происходят повторяющиеся случаи замешательства, которые прогрессивно усугубляются. Флуктуации когнитивной способности часто ассоциированы со сдвигом уровня внимания и бдительности. Когнитивное нарушение и флуктуации мыслительной способности могут варьироваться в течение минут, часов или дней.

Тельца Леви образуются из фосфорилированных и нефосфорилированных нейрофиламентных белков; они содержат синаптический белок альфа-синуклеин, а также убикитин, который участвует в элиминации поврежденных или аномальных белков. Помимо телец Леви могут присутствовать также нейриты Леви, представляющие собой тельца включения, участвующие в клеточных процессах в нервных клетках. Амилоидные бляшки могут образовываться в головном мозге пациентов, пораженных LBD, однако, как правило, в меньшем количестве, чем у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера. Наличие нейрофибриллярных сплетений, представляющих собой еще один микропатологический признак AD, не является главной отличительной особенностью LBD, но они часто присутствуют в дополнение к амилоидным бляшкам.

Амиотрофический боковой склероз (ALS) характеризуется дегенерацией верхних и нижних двигательных нейронов. У некоторых пациентов с ALS может иметь место деменция или афазия (ALS-D). Деменция наиболее часто представляет собой лобно-височную деменцию (FTD), и во многих таких случаях имеются убикитин-положительные, тау-отрицательные включения в нейронах зубчатой извилины медиальной и нижней поверхности полушария головного мозга и поверхностных слоях лобной и височной долей головного мозга.

Миозит, связанный с тельцами включения (IBM), представляет собой калечащее заболевание, как правило, обнаруживаемое у людей старше 50 лет, при котором возникает воспаление мышечных волокон, и они начинают атрофироваться, но при этом головной мозг не нарушается, и пациенты полностью сохраняют свой интеллект. Обнаружено, что уровень двух ферментов, участвующих в производстве белка амилоида-β, повышен в мышечных клетках пациентов, страдающих этим часто встречающимся у пожилых людей прогрессирующим мышечным заболеванием, при этом повышается также уровень амилоида-β.

Еще одним заболеванием, обусловленным или ассоциированным с накоплением и отложением амилоидоподобного белка, является дегенерация желтого пятна.

Дегенерация желтого пятна представляет собой обычное заболевание глаза, которое вызывает деградацию желтого пятна, т.е. центральной области сетчатки (тонкий слой ткани на задней части глаза, откуда светочувствительные клетки посылают зрительные сигналы в головной мозг). Желтое пятно опосредует острое, четкое, «неискаженное» зрение. Повреждение желтого пятна приводит к развитию слепых пятен и затуманенному или нарушенному зрению. Связанная с возрастом дегенерация желтого пятна (AMD) является основной причиной ухудшения зрения в Соединенных Штатах, и у людей старше 65 лет она представляет собой основную причину медицински подтвержденной слепоты среди лиц кавказской расы. Примерно 1,8 миллионов американцев в возрасте 40 лет и старше имеют развитую AMD, а еще у 7,3 миллионов людей с умеренной AMD имеется значительный риск потери зрения. По оценкам правительства к 2020 г. 2,9 миллиона людей будут иметь развитую AMD. Жертвы AMD часто бывают удивлены и расстроены, когда узнают, как мало известно о причинах и методах лечения этого состояния слепоты.

Существует две формы дегенерации желтого пятна: сухая дегенерация желтого пятна и влажная дегенерация желтого пятна. Сухая форма, при которой клетки желтого пятна медленно начинают разрушаться, диагностирована в 85 процентах случаев дегенерации желтого пятна. Как правило, сухая AMD поражает оба глаза, хотя при этом один глаз может потерять зрение, а второй глаз оставаться непораженным. Обычно ранними признаками сухой AMD являются друзы, которые представляют собой отложения желтого тела под сетчаткой. Риск возникновения развитой сухой AMD или влажной AMD повышается с увеличением количества или размера друз. Сухая AMD может прогрессировать и вызывать потерю зрения, не превращаясь во влажную форму заболевания; однако на ранней стадии сухая AMD может внезапно переходить во влажную форму.

Хотя на долю влажной формы приходится только 15 процентов случаев, она в 90 процентах приводит к слепоте, и ее рассматривают как развитую AMD (не существует ранней или промежуточной стадии влажной AMD). Влажной AMD всегда предшествует сухая форма заболевания. При прогрессировании сухой формы у некоторых людей начинается патологический рост кровеносных сосудов позади желтого пятна. Эти сосуды являются очень хрупкими и из них просачивается жидкость и кровь (отсюда название «влажная» дегенерация желтого пятна), приводя к быстрому повреждению желтого пятна.

Сухая форма AMD первоначально часто вызывает слегка затуманенное зрение. Затем прежде всего центральная часть зрительного поля может становиться затуманенной, и эта область увеличивается в размерах по мере прогрессирования заболевания. Если поражен только один глаз, то симптомы могут оставаться незамеченными. В случае влажной AMD прямые линии могут представляться волнистыми, и при этом может быстро наступать потеря центрального зрения.

Для установления диагноза дегенерации желтого пятна, как правило, проводят исследование расширенного глаза (зрачка), тест на остроту зрения и обследование задней стенки глаза с использованием процедуры, называемой фундоскопией, помогающей установлению диагноза AMD, и, если имеется предположение о наличии влажной AMD, то может быть проведена ангиография с использованием флуоресцеина. В настоящее время отсутствуют средства лечения, позволяющие предупреждать потерю зрения, если сухая AMD достигла развитой стадии. Однако применение определенной композиции, содержащей высокую дозу антиоксидантов и цинка, может замедлять или предупреждать прогрессирование промежуточной стадии AMD, приводящее к переходу в развитую стадию. Macugen® (инъекция пегаптаниба натрия), лазерное фотокоагулирование и фотодинамическая терапия позволяют контролировать патологический рост кровеносных сосудов и кровоизлияние в желтом пятне, что является полезным для определенной группы людей с влажной AMD; однако зрение, если оно уже почти потеряно, не может быть восстановлено с помощью таких методов. Если зрение почти потеряно, то существуют средства для слабого зрения, которые могут помочь улучшить качество жизни.

Одним из самых ранних признаков связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD) является накопление внеклеточных отложений, известных как друзы, в области, находящейся между базальным слоем пигментированного эпителия сетчатки (RPE) и базальной оболочкой Бруха (ВМ). Результаты современных исследований, проведенных Anderson с соавторами, подтвердили, что друзы содержат амилоид-бета (Experimental Eye Research 78, 2004, сс.243-256).

В настоящее время проводятся исследования, в которых изучают факторы окружающей среды, генетические и связанные с питанием факторы, которые могут влиять на AMD. Исследуют также новые стратегии лечения, включая применение трансплантатов клеток сетчатки, лекарственных средств, которые должны предупреждать или замедлять прогрессирование заболевания, лучевой терапии, генной терапии, компьютерного чипа, имплантированного в сетчатку, который может стимулировать зрение, и агентов, которые должны предупреждать рост новых кровеносных сосудов под желтым пятном.

Важным фактором, который необходимо принимать во внимание при разработке новых лекарственных средств, является простота их применения пациентами, для которых они предназначены. На долю вводимых оральным путем лекарственных средств, в частности таблеток, капсул и мягких гелей, приходится 70% всех применяемых лекарственных форм из-за удобства их применения пациентами. Разработчики лекарственных средств признают, что пациенты предпочитают оральное применение по сравнению с инъекциями или другими более инвазивными формами, применяемыми в медицине. Также предпочтительными являются препаративные формы, которые позволяют снижать количество доз (т.е. формы, применяемые один раз в день, или формы с пролонгированным высвобождением). Простота применения антибиотиков в виде оральных лекарственных форм приводит к тому, что соблюдение пациентом режима и схемы лечения в процессе лечения улучшается.

Существует необходимость в создании эффективных методов и композиций для получения высокоспецифических и высокоэффективных антител, предпосылкой для создания которых является возможность применения антител в оральной лекарственной форме. Предпочтительно такие антитела должны распознавать специфические эпитопы на различных антигенах, таких как амилоидный белок.

Таким образом, необходима разработка эффективных композиций и методов, направленных на борьбу с осложнениями, ассоциированными с болезнями и нарушениями, которые вызываются или ассоциированы с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая амилоидоз, группу заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но, не ограничиваясь ими) неврологические заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (AD), включая заболевания или состояния, характеризующиеся утратой когнитивной способности к запоминанию, такие, например, как умеренное ухудшение когнитивной способности (MCI), деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственное церебральное кровоизлияние, сопровождающееся амилоидозом (типа Дутча); комплекс деменции Гуама-Паркинсона, а также другие заболевания, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, такие как прогрессирующий надьядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотрофический боковой склероз), миозит, вызываемый тельцами включения (IBM), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли и другие заболевания, включая дегенерацию желтого пятна. В частности, существует необходимость в разработке специализированных и высокоэффективных антител, которые позволяют противодействовать физиологическим проявлениям заболевания, таким как образование бляшек, ассоциированное с агрегацией волокон амилоида или амилоидоподобного пептида.

Было установлено, что антитела к амилоидам, которые вырабатываются при инокуляции Aβ1-42, смешанным с полным или неполным адъювантом Фрейнда, обладают способностью снижать амилоидную нагрузку у трансгенных мышей, на которых смоделирована человеческая болезнь Альцгеймера (Schenk и др., 1999).

Внутрибрюшинная инокуляция тетрапальмитоилированного Aβ1-16, реконструированного в липосомах, трансгенным мышам линии NORBA приводила к получению высоких титров антител к амилоидам, которые обладали также способностью солюбилизировать амилоидные волокна и бляшки in vitro и in vivo (Nicolau и др., 2002).

Впервые гипотеза о возможном механизме, посредством которого происходит растворение амилоидных бляшек и волокон, была предложена Bard с соавторами, 2000, которые основывались на собственных результатах о том, что антитела опсонизируют бляшки, которые затем разрушаются макрофагами микроглии. De Mattos с соавторами, 2001, установили, что МАт к центральному домену β-амилоида обладало способностью связываться и полностью разрушать амилоид в плазме. Они доказали, что присутствие указанных МАт в кровотоке сдвигало равновесие Aβ между головным мозгом и плазмой в сторону периферического клиренса и катаболизма вместо накопления в головном мозге.

В настоящем изобретении предложены новые способы и композиции, содержащие высокоспецифические и высокоэффективные антитела, которые обладают способностью специфически распознавать и связываться со специфическими эпитопами, характерными для широкого разнообразия β-амилоидных антигенов. Согласно настоящему изобретению антитела особенно предпочтительно применять для лечения заболеваний и нарушений, которые вызываются или ассоциированы с амилоидом или амилоидоподобными белками, включая амилоидоз, группу заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но не ограничиваясь ими) неврологические заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (AD), включая заболевания или состояния, характеризующиеся утратой когнитивной способности к запоминанию, такие, например, как умеренное ухудшение когнитивной способности (MCI), деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственное церебральное кровоизлияние, сопровождающееся амилоидозом (типа Дутча); комплекс деменции Гуама-Паркинсона, а также другие заболевания, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, такие как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотрофический боковой склероз), миозит, вызываемый тельцами включения (IBM), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли и другие заболевания, включая дегенерацию желтого пятна, но не ограничиваясь ими.

Кроме того, в настоящем изобретении предложены новые способы и композиции, предназначенные для сохранения или повышения когнитивной способности к запоминанию у млекопитающего, которое страдает ассоциированным с амилоидом заболеванием или состоянием, заключающиеся в том, что животному прежде всего млекопитающему, более предпочтительно человеку, который нуждается в таком лечении, вводят в терапевтически эффективном количестве моноклональное антитело, предлагаемое в изобретении.

Краткое описание чертежей и последовательностей

На чертежах показано:

на фиг.1 - пептиды, выведенные из последовательность Aβ 1-15, 1-16 и 1-16(Δ14), 22-35 и 29-40;

на фиг.2 - данные о связывании моноклонального антитела mACI-01-Ab7 С2 с видами амилоидов, полученные с помощью Вестерн-блоттинга и дот-блоттинга;

на фиг.3 - данные о связывании моноклонального антитела mACI-01-Ab7 С2 с амилоидными волокнами, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа;

на фиг.4 - результаты параллельного эксперимента (эксперимента по типу «голова-к-голове»), включающего флуоресцентный анализ с использованием Th-Т (тиофлавин-Т) и ЯМР-спектроскопию твердого тела меченного с помощью U¹³-C Tyr10 и Val12-пептида β-амилоида 1-42.

SEQ ID NO:1: Антигенный пептид Aβ_1-15,

SEQ ID NO:2: Антигенный пептид Aβ_1-16,

SEQ ID NO:3: Антигенный пептид Aβ_1-16(Δ14),

SEQ ID NO:4: Антигенный пептид Aβ_22-35,

SEQ ID NO:5: Антигенный пептид Aβ_29-40,

SEQ ID NO:6: Антигенный пептид Aβ_1-17,

SEQ ID NO:7: Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного C2,

SEQ ID NO:8: Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного C2,

SEQ ID NO:9: Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного C2,

SEQ ID NO:10: Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного C2, включая сигнальные последовательности,

SEQ ID NO:11: Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного C2,

SEQ ID NO:12: Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного C2, включая сигнальные последовательности,

SEQ ID NO:13-20: Аминокислотные последовательности вариантов эпитопной области Aβ-пептида,

SEQ ID NO:21: Аминокислотная последовательность легкой цепи мышиного C2,

SEQ ID NO:22: Аминокислотная последовательность тяжелой цепи мышиного C2.

Настоящее изобретение относится к применению презентации антигена, которая приводит к повышенной доступности и стабилизации предпочтительной конформации антигена и в конце концов к образованию антител с уникальными свойствами.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, включая любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, или более предпочтительно моноклональное антитело, включая любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, выработанное в ответ на обработку надмолекулярной антигенной конструкцией, которая содержит антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, прежде всего β-амилоидного пептида Aβ_1-15, Aβ_1-16 и Aβ_1-16(Δ14), модифицированного с помощью гидрофобного фрагмента, такого, например, как пальмитиновая кислота, или гидрофильного фрагмента, такого, например, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), или комбинации обоих указанных агентов, где гидрофобный и гидрофильный фрагмент соответственно связывают с помощью ковалентной связи с каждым концом антигенного пептида по меньшей мере через одну, прежде все одну или две аминокислоты, такие, например, как лизин, глутаминовая кислота и цистеи или любая другая приемлемая аминокислота или аналог аминокислоты, который может служить в качестве соединяющего элемента для сшивания гидрофобного и гидрофильного фрагмента с пептидным фрагментом. Когда в качестве гидрофильного фрагмента применяют ПЭГ, то свободные концы ПЭГ ковалентно связывают с фосфатидилэтаноламином или любым другим соединением, которое может функционировать в качестве «заякоривающего» элемента, предназначенного для встраивания антигенной конструкции в бислой липосомы.

Другим вариантом осуществления изобретения является антитело, прежде всего моноклональное антитело, включая любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, которое распознает нативную конформацию амилоида, в результате оно специфично связывается с амилоидными олигомерами и волокнами, но не связывается с линеаризованными видами амилоидов.

Следующим вариантом осуществления изобретения является антитело, прежде всего моноклональное антитело, включая любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, предлагаемое в настоящем изобретении и описанное выше, где антитело или его фрагмент связывается с мономером Aβ, при этом аффинность к связыванию составляет от по меньшей мере примерно 1×10^-6 до по меньшей мере примерно 1×10^-8, прежде всего от по меньшей мере примерно 1×10^-6 до по меньшей мере примерно 1×10^-7, более предпочтительно от по меньшей мере примерно 1×10^-7 до по меньшей мере примерно 1×10^-8, еще более предпочтительно от по меньшей мере примерно 1×10^-7 до по меньшей мере примерно 4×10^-7, но предпочтительно не обладает никакой заметной перекрестной реактивностью с амилоидным белком-предшественником (АРР).

Еще одним вариантом осуществления изобретения является антитело, прежде всего моноклональное антитело, включая любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, предлагаемое в настоящем изобретении и описанное выше, где антитело или его фрагмент связывается с волокном, фибриллой или филаментом Aβ, при этом аффинность к связыванию составляет от по меньшей мере примерно 1×10^-7 до по меньшей мере примерно 1×10^-9, прежде всего от по меньшей мере примерно 1×10^-7 до по меньшей мере примерно 1×10^-8, более предпочтительно от по меньшей мере примерно 1×10^-8 до по меньшей мере примерно 1×10^-9, еще более предпочтительно от по меньшей мере примерно 1×10^-8 до по меньшей мере примерно 5×10^-8, но предпочтительно не обладает никакой заметной перекрестной реактивностью с амилоидным белком-предшественником (АРР).

Следующим вариантом осуществления изобретения является антитело, прежде всего моноклональное антитело, включая любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, предлагаемое в настоящем изобретении и описанное выше, аффинность к связыванию которого с волокном, фибриллой или филаментом Aβ по меньшей мере в 5 раз, прежде всего по меньшей мере в 10 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 15 раз выше, чем аффинность к связыванию с мономером Aβ.

Антитела, предлагаемые в изобретении, обладают способностью ингибировать in vitro и in vivo агрегацию амилоидогенных мономерных пептидов, в частности, β-амилоидных мономерных пептидов, таких, например, как мономерные Aβ-пептиды 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 или 1-43, но особенно предпочтительно мономерных Aβ_1-42-пептидов, приводящую к образованию высокомолекулярных полимерных амилоидных фибрилл или филаментов.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является антитело, прежде всего моноклональное антитело, включая любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, где антитело при совместной инкубации, прежде всего при совместной инкубации с амилоидными мономерными пептидами, прежде всего β-амилоидными мономерными пептидами, такими, например, как мономерные Aβ-пептиды 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 или 1-43, но предпочтительно мономерными Aβ_1-42-пептидами, ингибирует агрегацию Aβ-мономеров, приводящую к образованию высокомолекулярных полимерных фибрилл.

Следующим вариантом осуществления изобретения является антитело, прежде всего моноклональное антитело, включая любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, где антитело при совместной инкубации, прежде всего при совместной инкубации при соотношении молярных концентраций вплоть до 1:100, более предпочтительно при соотношении молярных концентраций от 1:30 до 1:100, но особенно предпочтительно при соотношении молярных концентраций 1:100, с амилоидными мономерными пептидами, прежде всего с β-амилоидными мономерными пептидами, такими, например, как мономерные Aβ-пептиды 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 или 1-43, но предпочтительно мономерными Aβ_1-42-пептидами, ингибирует агрегацию Aβ-мономеров с образованием высокомолекулярных полимерных фибрилл. В частности, уровни ингибирования составляют по меньшей мере 50%, прежде всего по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере 85-90% или более по сравнению с вариантом, в котором соответствующие амилоидные мономерные пептиды инкубировали в буфере (контроль).

В частности, совместную инкубацию антитела, предлагаемого в изобретении, с амилоидными мономерными пептидами осуществляют в течение периода времени, составляющего от 24 до 60 ч, прежде всего от 30 до 50 ч, более предпочтительно в течение 48 ч при температуре от 28 до 40°C, прежде всего от 32 до 38°C, более предпочтительно при 37°C.

Следующим вариантом осуществления изобретения является антитело, прежде всего моноклональное антитело, включая любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, где антитело при совместной инкубации в течение 48 ч при 37°C при соотношении молярных концентраций 1:100 с амилоидными мономерными пептидами, прежде всего с β-амилоидным мономерным пептидом, таким, например, как мономерный Aβ-пептид 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 или 1-43, но предпочтительно мономерным Aβ_1-42-пептидом, обладает способностью ингибировать агрегацию амилоидных мономеров, прежде всего агрегацию мономерных β-амилоидных пептидов, таких, например, как мономерные Aβ пептиды 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 или 1-43, но особенно предпочтительно мономерный Aβ_1-42-пептид, приводящую к образованию высокомолекулярных полимерных фибрилл или филаментов, по меньшей мере на 85%, прежде всего по меньшей мере на 89% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% по сравнению с вариантом, в котором соответствующие амилоидные мономерные пептиды инкубировали в буфере (контроль).

Конкретным вариантом осуществления изобретения является антитело, прежде всего моноклональное антитело, включая любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, которое обладает высокой специфичностью в отношении мономерных Aβ_1-42-пептидов, но практически не обладает или обладает лишь незначительной перекрестной реактивностью на мономерные пептиды Aβ_1-38, Aβ_1-39, Aβ_1-40 и/или Aβ_1-41, прежде всего антитело, но особенно предпочтительно моноклональное антитело, включая любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, где чувствительность антитела к амилоидному Aβ_1-42-пептиду превышает его чувствительность к Aβ_1-38, Aβ_1-39, Aβ_1-40, Aβ_1-41 вплоть до 100 раз, предпочтительно от 50 до 100 раз, более предпочтительно от 80 до 100 раз, но наиболее предпочтительно в 100 раз, и чувствительность антитела к амилоидному Aβ_1-42-пептиду превышает его чувствительность к Aβ_1-38 вплоть до раз 1000 раз, предпочтительно от 500 до 1000 раз, более предпочтительно от 800 до 1000 раз, но особенно предпочт