Способ получения концентрированных полифенольных экстрактов в результате процесса перемешивания

Иллюстрации

Показать все

Настоящее изобретение относится к области разработки продуктов пивоваренной промышленности. Согласно изобретению способ получения экстракта полифенолов, образованных в результате процесса пивоварения, включает стадии: контактирование частично очищенного пива со смолой, которая адсорбирует полифенолы; десорбцию полифенолов, адсорбированных на смоле, контактировавшей с частично очищенным пивом; адсорбцию полифенолов на вторую смолу, отличную от первой, причем указанная вторая смола является гидрофобной и неионной; и десорбцию полифенолов, адсорбированных на второй смоле, с использованием органического растворителя, причем способ осуществляют без использования этилацетата. Также изобретение относится к способу получения экстракта полифенолов, образованных в результате процесса пивоварения, включающему следующие стадии: контактирование частично очищенного пива с гидрофобной и неионной смолой, которая адсорбирует полифенолы; и десорбцию полифенолов, адсорбированных на смоле, использованной на предыдущей стадии контактирования, с использованием органического растворителя, причем продукт десорбции содержит по меньшей мере 0,85 г полифенолов на грамм сухого материала. Изобретение также относится к экстракту полифенолов, полученному посредством указанных способов и содержащему катехин, эпикатехин, тирозол и феруловую кислоту. Изобретение относится также к косметическому продукту, функциональному продукту питания, добавке к пище, которые содержат указанный экстракт полифенолов в эффективном количестве. Также изобретением предусмотрено применение указанного косметического продукта для увлажнения кожи и/или предупреждения или замедления ее старения, применение экстракта полифенолов для получения антиоксидантной композиции. Изобретение обеспечивает получение экстрактов полифенолов без использования этилацетата и с высокой степенью чистоты продукта. 8 н. и 11 з.п. ф-лы, 23 ил., 22 табл., 6 пр.

Реферат

Настоящее изобретение относится к области разработки совместно производимых продуктов пивоваренной промышленности. В частности, настоящее изобретение относится к способам получения концентрированных полифенольных экстрактов, образующихся в результате процесса пивоварения, а также к некоторым применениям этих экстрактов, которые демонстрируют достойные внимания свойства.

Пиво получают из злаков (в основном, из ячменя, к которому могут быть добавлены другие злаки, такие как пшеница, рис или кукуруза), которое подвергают различным обработкам. Производство пива главным образом включает следующие стадии:

- Производство солода:

Эта стадия служит для активации ферментов в ячмене, которые превращают крахмал в сахара во время пивоварения. Ячмень, который представляет собой твердый злак, зерно которого богато нерастворимым крахмалом, превращается в солод, который является рыхлым и богат растворимыми веществами, посредством последовательного осуществления следующих трех стадий: погружения, во время которого зерно впитывает воду, проращивания и сушки в печи, которая останавливает прорастание.

- Пивоварение:

Неочищенный солод перемешивают с 2-3 объемами воды в резервуарах, называемых “бродильными чанами”; эта операция называется “затиранием солода”. После термической обработки при различных температурных стадиях в течение от 2 до 6 часов, солод становится пивным суслом. Во время этой операции, крахмал, содержащийся в солоде, превращается в сахар.

Такую же операцию можно проводить одновременно в другом чане, если используется неосоложенное зерно (неочищенное зерно).

Все количество затем перемешивают, чтобы получить сусло. Профильтрованное первый раз и с удаленными зерновыми пленками в фильтрационном чане, сусло становится “заторной водой”. Затем все количество переносят в бак для кипячения сусла с хмелем, где сусло варят при 100°C в течение от 1 до 2 часов и добавляют хмель в пропорции от 1 до 2 г на литр. Хмель придает пиву горечь и аромат и облегчает хранение вследствие его антисептических свойств.

Как само собой разумеется, термин «пивоварение» зачастую означает полный процесс производства пива (включая брожение).

- Брожение:

В охлажденное в теплообменнике при желаемой температуре брожения сусло вносят дрожжи, которые будут превращать сахар в спирт, вкусовые вещества и диоксид углерода. Брожение длится несколько недель и проводится в больших бродильных чанах.

В зависимости от желаемого вида пива, различаются используемые дрожжи; для пива типа эля используют дрожжи верхового брожения типа Saccharomyces cerevisisae, тогда как для светлого пива используют штаммы низового брожения типа Saccharomyces uvarum.

- Выдерживание:

Затем смесь фильтруют, таким образом, чтобы получить «зеленое пиво», которое помещают в чаны для выдерживания пива при температуре 0°C. Пиво созревает в этих чанах в течение нескольких недель, таким образом, чтобы образовался выдержанный эль. Во время этой фазы, пиво медленно улучшается и приобретает свой аромат и вкус вследствие работы дрожжей и холода (N.B.: это второе брожение систематически не проводится в современном пивоварении).

- Фильтрация:

Целью фильтрации является улучшение чистоты и пива путем удаления последних дрожжей и коллоидных частиц, все еще остающихся в суспензии. Пиво фильтруют через диатомитовые фильтры, диатомит, представляющий собой минеральный порошок, полученный из окаменелых диатомовых водорослей (морских микроорганизмов).

Эта стадия фильтрации не является достаточной. Это происходит потому, что даже после этого фильтрования пиво может стать мутным на холоде и эта мутность может стать постоянной при хранении пива. Эта мутность образуется за счет ассоциации полифенолов с белками, что в результате приводит к образованию нерастворимых соединений. Для того, чтобы обойти эту проблему, нежелательные полифенолы могут быть удалены из пива путем пропускания его через смолу: PVPP (поливинилпирролидон). PVPP представляет собой произвольно поперечно сшитый поли[1-(2-оксо-1-пирролидинил)этилен]. Его получают путем полимеризации N-винил-2-пирролидона в присутствии каустического катализатора или N,N'-дивинилимидазолидона. Его химическая формула представляет собой (C6H9NO)n. В настоящее время, его регенерируют путем промывания гидроксидом натрия и промывные воды отбрасывают.

Полифенолы (или полифенольные соединения) представляют собой молекулы, специфичные для царства растений. Основным структурным элементом является бензольное кольцо, с которым непосредственно связана одна или несколько свободных гидроксильных групп или гидроксильных групп, входящих в другую химическую функциональную группу. Более 8000 соединений соответствуют этому определению. Они разделяются на различные семейства, в соответствии с их характеристиками: фенольные кислоты, флавоноиды, таннины и лигнаны, которые, с изофлавонами, называют фитоэстрогенами. Эти соединения используют в промышленности, в частности, благодаря их красящим и антиоксидантным свойствам.

В этом контексте, авторы изобретения изучили возможность извлечения полифенолов, удаляемых из пива в конце его производства. Вследствие их общих биологических свойств (антиоксидантных, биоцидных, противовоспалительных, и так далее, свойств), полифенолы действительно могут представлять интерес в различных областях:

- косметике,

- пищевой промышленности/ в области нутрицевтиков,

- фитотерапии,

- ветеринарии,

- фармации.

Полифенольные экстракты, в настоящее время доступные на рынке, получают из следующих растительных веществ: оливок, кофе, какао, чая, винограда, вина, яблок, сои, водорослей, черной смородины или сосновой коры.

Авторы изобретения также изучили преимущества полифенолов, экстрагированных в результате процесса производства пива, после стадии брожения, в различных применениях. В особенности, фенольные соединения подвергались воздействию соложения, пивоварения и брожению, что, возможно, привело к модификациям в их структуре (связывание с белками, полисахаридами, частичное окисление и полимеризация). Существует риск, что эти модификации влияют на их свойства, в частности, их антиоксидантные свойства. Неожиданно авторы изобретения показали, что полифенолы, полученные в результате процесса пивоварения (взятого в широком смысле), демонстрируют прекрасные антиоксидантные свойства.

Настоящее изобретение, таким образом, относится, во-первых, к применению частично очищенного пива в качестве исходного материала для получения экстракта, богатого полифенолами. Термин «частично очищенное пиво» в настоящей заявке означает пиво, полученное после удаления дрожжей, растительного дебриса и коллоидных частиц, например, фильтрованием через диатомитовые фильтры (другие способы, в частности, основанные на центрифугировании, также были описаны для этой цели). «Экстракт, богатый полифенолами» или «полифенольный экстракт» или «полифенольный концентрат» означает растительный экстракт в любой форме (жидкой или твердой), суммарное содержание полифенолов которой составляет по меньшей мере 5%, предпочтительно по меньшей мере 10% для жидкой формы, и по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере от 60% до 80%, или даже больше, для твердой формы. Метод Фолин-Чокальтеу (Folin-Ciocalteu) (EBC стандарт) может, например, быть использован для определения содержания полифенолов в концентратах в соответствии с изобретением (Folin и Ciocalteu, 1927).

Способ получения экстракта полифенолов, в результате процесса пивоварения, предусматривает по меньшей мере одну стадию контактирования частично очищенного пива со смолой, которая адсорбирует полифенолы, с последующей стадией извлечения полифенолов, адсорбированных на указанной смоле, также является частью настоящего изобретения. Разумеется, выражение «процесс пивоварения» следует понимать в широком смысле, означающем процесс производства пива. Примером смолы, которая может быть использована для осуществления этого способа, является PVPP.

Стадия “извлечения” полифенолов, адсорбированных на смоле после ее контакта с частично очищенным пивом, включает эти полифенолы, десорбированные из указанной смолы, помещенные в условия, гарантирующие их стабильность и, где целесообразно, концентрацию и/или очистку. Эта стадия может, например, проводиться путем использования второй смолы для извлечения полифенолов после десорбции их из первой смолы. В одном предпочтительном варианте осуществления эта вторая смола является гидрофобной и неионной и позволяет проводить десорбцию полифенолов путем применения органического растворителя.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, проводятся следующие стадии:

(i) частично фильтрованное пиво приводят в контакт с полимером поливинилпирролидоном (PVPP);

(ii) PVPP промывают щелочным раствором;

(iii) промывочный раствор PVPP приводят в контакт со вторым полимером, который адсорбирует полифенолы;

(iv) полифенолы подвергают десорбции из второго полимера;

(v) полифенолы концентрируют.

Некоторые предпочтительные варианты осуществления этих различных стадий подробно описаны ниже. Эти конкретные варианты осуществления могут быть использованы независимо или в сочетании, в непрерывных или периодических способах.

На стадии (ii), PVPP может подвергаться двум промываниям гидроксидом натрия; в этом случае, только раствор гидроксида натрия от первого промывания или, когда это целесообразно, фракцию этого раствора, используют на стадии (iii). Предпочтительно, концентрация гидроксида натрия составляет от 1% до 2%; еще более предпочтительно концентрация составляет приблизительно 1,6%. Разумеется, другой щелочной раствор может быть использован вместо гидроксида натрия.

После десорбции полифенолов щелочным раствором, этот раствор предпочтительно будет быстро нейтрализован или даже подкислен, для предотвращения разрушения полифенолов. Это является особенно предпочтительным в случае периодического способа. Причина состоит в том, что в случае непрерывного способа, время, в течение которого полифенолы остаются в щелочном растворе, может быть сокращено, таким образом, чтобы покончить с проблемой разрушения полифенолов в щелочной среде, и, следовательно, необязательно, ликвидировать стадию нейтрализации или подкисления. Как описано в экспериментальном разделе, приведенном ниже, фосфорная кислота особенно подходит для нейтрализации или подкисления щелочного раствора в конце стадии (ii).

Вторая смола, используемая на стадии (iii), предпочтительно будет гидрофобной и неионной, адсорбирующей полимерной смолой, которая предпочтительно является ароматической. В качестве неограничивающих примеров таких смол, можно упомянуть смолу Amberlite™ XAD 1180 от компании Rohm & Haas S.A.S., а также ее пищевой вариант (Amberlite™ FPX 68), который предсталяет собой макропоперечносшитую адсорбирующую смолу, предназначенную для производства напитков, в особенности для экстракции флавоноидов. Также может быть использована смола Amberlite™ FPX66, которая делает возможным извлекать молекулы меньшего размера по сравнению с FPX 68.

Стадия промывания второй смолы водным раствором предпочтительно будет добавлена между стадиями (iii) и (iv).

Предпочтительно, десорбцию на стадии (iv) проводят путем пропускания раствора спирта или другого органического растворителя через смолу. Полифенолы затем могут быть концентрированы, например, путем выпаривания органического растворителя. Концентрированный раствор может быть лиофилизирован или высушен, с получением порошка и для улучшения стабильности полифенольного концентрата.

В настоящее время PVPP является единственным полимером, способным адсорбировать полифенолы и включенным в список технологических вспомогательных веществ, одобренных для производства пива в Европе. Однако, этот список подвержен модификации. Вариант способов, описанных выше, следовательно, предусмотренный в соответствии с настоящим изобретением, в котором частично профильтрованное пиво приводят в контакт непосредственно со смолой, которая адсорбирует полифенолы и дает возможность для их десорбции органическим растворителем. Для этого, предпочтительно может быть использована гидрофобная и неионная адсорбирующая смола, которая предпочтительно является ароматической, например, смолы XAD 1180, FPX 68 и FPX 66, упомянутые выше. Этот вариант дает возможность освободиться от стадий регенерации гидроксида натрия и нейтрализации кислоты, уменьшает количество солей и делает возможным улучшение выхода экстракции и чистоты полифенолов.

Другим аспектом настоящего изобретения является полифенольный концентрат, который может быть получен с помощью способа, описанного выше. Различные стадии процесса пивоварения, которым подвергаются эти полифенолы, придают им оригинальные свойства и, в частности, состав, богатый катехинами и эпикатехинами, и их полимерами. Концентрат, в соответствии с настоящим изобретением, может быть в твердой форме, например в форме порошка, или в жидкой форме, например в водном или спиртовом растворе или в глицерине.

Полифенольный концентрат в соответствии с настоящим изобретением может быть использован для получения антиоксидантной композиции, не зависимо от назначения этой композиции.

В частности, антиоксидантные свойства концентратов по настоящему изобретению делают их превосходными кандидатами в качестве компонентов для косметических продуктов. Эти концентраты, действительно могут быть добавлены в большое разнообразие косметических продуктов, таких как кремы или лосьоны для увлажнения кожи, растворы для умывания или промывания кожи или волос, маски, продукцию декоративной косметики и так далее. Концентраты по настоящему изобретению могут быть включены в косметические продукты в качестве активных продуктов, например, благодаря их антиоксидантным, увлажняющим и стимулирующим свойствам, а также в качестве средств для облегчения хранения косметических продуктов. Косметический продукт в соответствии с настоящим изобретением может, разумеется, быть составлен для местного применения, а также может быть составлен для перорального применения, в форме гелевых капсул, таблеток для рассасывания, сиропа или в любой другой форме. Авторы настоящего изобретения действительно продемонстрировали на модели кожи в культуре благоприятное действие полифенолов при контакте с эпидермальными клетками на качество кожи. Косметические продукты по настоящему изобретению, в частности, могут быть использованы для увлажнения кожи и/или предотвращения или замедления ее старения. Чтобы обратить внимание, косметические композиции, содержащие от 0,25% до 0,5% твердого экстракта, богатого полифенолами (содержащие приблизительно 80% полифенолов), могут быть предпочтительно использованы для этих показаний.

В соответствии с другим конкретным аспектом настоящего изобретения, полифенолы, полученные в результате процесса пивоварения, используют в нутрицевтической композиции, такой как функциональные продукты питания или пищевая добавка. Термин «функциональный продукт питания» означает продукт питания, употребляемый как обычная пища, хотя он приносит пользу, которая превосходит обычное питание. Функциональный продукт питания, содержащий полифенолы, который может быть получен в соответствии с настоящим изобретением, следовательно, является неотъемлемой частью настоящего изобретения. В качестве неограничивающих примеров функциональных продуктов питания в соответствии с настоящим изобретением, могут быть упомянуты фруктовые соки, тонизирующие прохладительные и другие безалкогольные напитки, продукты на основе круп, йогурты и молочные продукты, шоколад, маргарин и другие, легко намазывающиеся жиры, печенье и так далее.

Помимо благоприятных свойств для здоровья, полифенолы по настоящему изобретению могут быть использованы в продуктах питания в качестве консервантов, например, для замены некоторых синтетических продуктов, таких как витамин C, BHA (бутилгидроксианизол) и BHT (бутилгидрокситолуол).

Пищевые добавки, содержащие полифенольный концентрат, полученный в соответствии с настоящим изобретением, также являются частью настоящего изобретения. Эти добавки могут быть, например, в форме гелевых капсул, порошков или таблеток. Разумеется, они могут содержать другие активные ингредиенты, такие как антиоксидантные витамины (в частности, C и E), витамины группы B, витамин D, кальций, магний, омега-3 жирные кислоты, фосфолипиды, растительные экстракты и так далее.

Конкретное применение полифенольных концентратов по настоящему изобретению, проиллюстрированное в экспериментальных примерах, приведенных далее, представляет собой получение композиций, предназначенных для улучшения уровней когнитивной деятельности индивидуума. Термин «уровни когнитивной деятельности» в настоящем описании означает, в широком смысле, память, способность к обучению, логическому мышлению, но также способность к концентрации, вниманию, стрессоустойчивость, скорость реакции и так далее. Такая композиция может быть в форме пищевой добавки, а также в любой другой форме, в частности, галеновой форме.

В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение относится к применению полифенольного концентрата, который может быть получен с помощью описанного выше способа, для получения композиции против старения. В частности, такая композиция может быть использована для ограничения или задержки последствий старения головного мозга, таких как потеря памяти, деменция и так далее. Такая композиция против старения может быть предназначена для людей или для использования в ветеринарии. Все формы введения, описанные выше, могут быть предусмотрены для такой композиции.

В качестве примера, полифенолы по настоящему изобретению могут вводиться в пропорции от 100 до 400 мг в день для взрослого человека.

Помимо указанных выше средств, настоящее изобретение также включает другие средства, которые будут следовать из приведенных ниже экспериментальных примеров и из прилагаемых чертежей.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: Схема принципа PVPP фильтрации/регенерации.

Фигура 2: Полифенолы, находящиеся в регенерационном растворе, в зависимости от pH.

Фигура 3: Изменение суммарных полифенолов с течением времени.

Фигура 4: Изменение антиоксидантной активности в зависимости от температуры.

Фигура 5: Изменение содержания полифенолов во время регенерации.

Фигура 6: Схема экспериментальной проверки.

Фигура 7: Содержание полифенолов в течение 5 регенераций.

Фигура 8: Схема принципа замены PVPP другой смолой, XAD.

Фигура 9: Изменение массы тела у крыс во время экспериментального периода (среднее ± SEM).

Фигура 10: Потребление пищи (г/кг/д) (среднее ± SEM).

Фигура 11: Потребление воды (г/кг/д) (среднее ± SEM).

Фигура 12: Общее число нажатий двух рычагов в течение 10 минут периода адаптации к испытанию (среднее ± SEM).

Фигура 13: Различие между активным рычагом и неактивным рычагом в течение 10 минут периода адаптации к испытанию (среднее ± SEM).

Фигура 14: Общее число нажатий двух рычагов в течение 20 минут периода испытания (среднее ± SEM).

Фигура 15: Различие между активным рычагом и неактивным рычагом в течение 20 минут периода испытания (среднее ± SEM).

Фигура 16: время задержки (с) до достижения зоны плато (среднее ± SEM).

Фигура 17: Наблюдение под микроскопом необработанных эксплантатов в D0 (A) и D6 (B).

Фигура 18: Наблюдение под микроскопом эксплантатов в D6, обработанных составом, содержащим ретинол (A) или эксципиентом (B).

Фигура 19: Наблюдение под микроскопом в D6 после окрашивания GAG: контроль (A), эталон (B), обработанные полифенолами в концентрации 0,5% местно (C), и обработанные полифенолами в концентрации 0,025% в среде.

Фигура 20: Наблюдение под микроскопом в D6, после иммуномечения ламинина-5: контроль (A), эталон (B), обработанный полифенолами в концентрации 0,5% местно (C), и обработанный полифенолами в концентрации 0,025% в среде.

Фигура 21: Наблюдение под микроскопом в D6, после иммуномечения коллагена III: контроль (A), эталон (B), обработанные полифенолами в концентрации 0,5% местно (C), и обработанные полифенолами в концентрации 0,025% в среде.

Фигура 22: Наблюдение под микроскопом в D6, после иммуномечения коллагена IV: контроль (A), эталон (B), обработанные полифенолами в концентрации 0,5% местно (C), и обработанные полифенолами в концентрации 0,025% в среде.

Фигура 23: Состав флаволола и фенолокислоты образцов (% по массе).

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Лабораторные испытания

1.1 Контекст

Процесс фильтрования пива проводят в две стадии:

1. Пропускание через диатомитовый фильтр и элиминация остаточных твердых частиц («частично фильтрованное» пиво),

2. Снижение приблизительно на 40%-50% концентрации полифенолов в пиве с использованием PVPP.

Фильтрованное пиво в дальнейшем хранят, а затем упаковывают.

PVPP добавляют к частично профильтрованному пиву по мере его выхода из диатомитового фильтра. PVPP адсорбирует полифенолы, а затем удерживается на PVPP фильтре. Промывание фильтра горячим гидроксидом натрия в концентрации 1,6% (две части по 120 гл) дает возможность удалить полифенолы и регенерировать PVPP для следующего использования. Первую порцию гидроксида натрия отправляют на очистительную установку, вторую извлекают и повторно используют во время следующей регенерации. Использование и регенерация PVPP представлены на Фигуре 1. В примерах, которые следуют далее, «регенерационный раствор» будет означать первую порцию гидроксида натрия (гидроксид натрия 1).

1.2 Стабильность полифенолов в регенерационном растворе

Стабильность полифенолов регенерационного раствора определяют в различных условиях (pH, время, температура). Суммарные полифенолы исследуют в различные периоды времени для каждого из условий, на 5 взятых образцах. Прошло два часа между взятием образца и первым измерением.

Фигура 2 демонстрирует влияние pH на сохранение полифенолов. Через 2 часа, потеря полифенолов составляет более 55% в неподкисленном гидроксиде натрия. Основной раствор должен быть нейтрализован или подкислен сразу же по мере выхода из PVPP фильтра для того, чтобы быть пригодным для использования. Температура не оказывает влияния между 3 и 80°C.

Фигура 3 представляет изменение суммарных полифенолов в регенерационном растворе на протяжении периода 9 дней. Регенерационный раствор отбирают непосредственно при выходе из PVPP фильтра. Образцы стандартизируют и сразу же подкисляют технической кислотой.

Были протестированы следующие условия:

- кислотность

- pH между 2 и 3 для подкисленных образцов,

- pH=13 для необработанных образцов гидроксида натрия

- природа используемой кислоты

* фосфорная кислота (H3PO4)

* соляная кислота (HCl)

- температура: -20°C, 4°C или 20°C.

На этой Фигуре показано, что:

1. Когда раствор подкисляют фосфорной кислотой, 88% полифенолов сохраняется вплоть до 9-го дня.

2. Предпочтительно использовать фосфорную кислоту, а не соляную кислоту.

3. Основной раствор следует нейтрализовать сразу же для сохранения полифенолов (уже упомянуто выше).

4. Независимо от условий, полифенолы подвергаются трансформации. Этот феномен был описан для полифенолов в вине (Tubaro et al., 1999). По-видимому, происходит димеризация полифенолов (Brouillard et al., 1997).

5. Влияние температуры (4°C в сравнении с 20°C) является очень небольшим.

Влияние температуры на стабильность полифенолов впоследствии измеряли через антиоксидантную активность раствора полифенолов (Фигура 4). Образцы того же раствора держали при различных температурах (между 35 и 75°C) в течение 10, 20 или 30 минут. Антиоксидантную активность измеряли с помощью DPPH метода (Brand-Williams et al., 1995).

На Фигуре 4 показано, что:

1. Антиоксидантная активность (2,11 г Тролокс экв./г полифенолов) является стабильной между 20 и 75°C.

2. Наблюдаемые варианты (± 5%) относятся к экспериментальным отклонениям и не являются значимыми.

NB: Эти результаты подтверждались в опытной партии между 40 и 70°C.

1.3 Лабораторное получение экстрактов, обогащенных полифенолами

Для того чтобы определить полифенольный состав пива, McMurrough et al. проводили экстракцию этилацетатом на дегазированном пиве, а затем анализировали экстракт с помощью ВЭЖХ (McMurrough et al., 1984). Первую экстракцию проводили по этой методике для того, чтобы экстрагировать полифенолы регенерационного раствора.

Полифенолы, таким образом, были экстрагированы из PVPP-регенерационного раствора гидроксида натрия путем применения следующего протокола:

1. подкисление раствора гидроксида натрия до pH 2 с использованием HCl,

2. добавление этилацетата (соотношение гидроксида натрия/этилацетата: 1/1,5, об/об),

3. перемешивание в течение 2 часов, скорость 300-500 об/мин, затем оставляют стоять в течение 2 часов и разделяют фазы,

4. извлечение органической фазы, упаривание или лиофилизация.

Характеристики полученных экстрактов суммированы в таблице 2 (колонка A).

Предыдущий способ дает возможность получать полифенолы с чистотой 77%. Выход экстракции, с другой стороны, является низким (приблизительно 37%). Другие условия были протестированы для повышения выхода экстракции. Модификация относится к:

- pH (между 1 и 7),

- растворителю для экстракции (простой эфир, дихлорметан),

- добавлению хлорида натрия для улучшения отделения органической и водной фаз.

Характеристики полученных экстрактов суммированы в таблице 2 (колонка B). В целом, при использовании этих вариантов, выход экстракции меняется до 32%. Полученные экстракты содержат больше солей, чем ранее, и титр полифенола составил только 42%. Различные варианты, следовательно, не сделали возможным улучшить эффективность методики экстракции.

Для разработки способа для извлечения полифенолов в большем количестве в условиях, более совместимых с промышленной эксплуатацией, подходящей для существующих предприятий, и с предусмотренной аппаратурой, были предусмотрены другие методики для обессоливания и концентрирования полифенолов. Эти возможности суммированы в таблице 1.

Таблица 1Предложенные способы концентрирования и обессоливания
Задача Способ Прочая информация
Подкисление (быстро, при выходе из PVPP фильтра) и обессоливание Непосредственное подкисление Образование солейТребуется удаление соли
Катионообменная смола Отсутствие дополнительной стадии обессоливанияРегенерация смолы кислотой (HCl, H2SO4)
Концентрирование Мембранная фильтрация Удаление части воды, концентрирование в 5 разДавление 40-50 бар
Адсорбция полифенолов на смоле Регенерация спиртомПерегонка под пониженным давлением

Выбор остановился на смоле для адсорбции полифенола, разработанной компанией Rohm & Haas. Полифенолы, следовательно, были экстрагированы из нейтрализованного PVPP-регенерирующего гидроксида натрия путем применения следующего способа.

1. Пропускание раствора гидроксида натрия через колонку, содержащую смолу XAD1180, и адсорбция полифенолов. Адсорбционная способность смолы составляет 20 г полифенолов на литр смолы,

2. Промывание смолы водой для удаления следов солей и других примесей,

3. Элюция полифенолов этанолом,

4. Извлечение органической фазы, упаривание и лиофилизация.

150 мл воды и 150 мл спирта использовали на 100 мл смолы.

Характеристики полученных экстрактов суммированы в таблице 2 (колонка C).

Этот способ решает проблемы, связанные с применением этилацетата.

- Увеличивается экстракция имеющихся полифенолов (экстракция 65%),

- повышается чистота экстрактов до 85-90%,

- этанол используется или присутствует во многих производственных процессах (фармация) или общеупотребительных продуктах (пиво, противокашлевые средства).

1.4 Полифенольные экстракты, полученные в лаборатории

Характеристики экстрактов, полученных в лаборатории с помощью трех способов, описанных выше, суммированы в приведенной ниже таблице 2.

Таблица 2Сравнение экстрактов, полученных различными способами на различных образцах
Серия экспериментов A B C
Способ Этилацетат Варианты Смола + спирт
Количество полученного сухого вещества (г) 9,3 29,6 17,5
Титр полифенолов (г/г DM) 0,77 0,42 0,85
Масса полифенолов (г) 7,2 12,4 14,9
Доступный выход экстракции полифенолов (%) 37 32 65
Антиоксидантная активность
мг DPPH/г DM 2,5-3,0 1,2-1,5 3,7-4,5
мг DPPH/г полифенолов 3,2-3,9 2,8-3,6 4,4-5,3
Эквивалентность Тролоксу (г/г DM) 1,08-1,31 0,50-0,67 1,62-1,96
Эквивалентность Тролоксу (г/г полифенолов) 1,4-1,7 1,2-1,6 1,9-2,3

Пример 2: Увеличение масштаба от лаборатории к производству

2.1 Контрольное испытание

Взятые образцы показали, что во время регенерации PVPP, только первое промывание гидроксидом натрия богато полифенолами. Кроме того, концентрация полифенолов варьирует во время регенерации PVPP. Представлено для одной регенерации на Фигуре 5.

Количество полифенолов оценивают путем интегрирования площади поверхности под кривой. В соответствии с видом кривой приблизительно 65% полифенолов, содержащихся в регенерирующем растворе, удалено на протяжении периода 2 минуты (заштрихованная часть на Фигуре 5). Следовательно, на протяжении этого периода времени, приблизительно 10 гл гидроксида натрия было взято в качестве образца для проведения контрольного испытания.

Подтверждение достоверности предложенного способа требует, чтобы контрольное испытание проводилось для получения приблизительно от 5 до 10 кг полифенолов.

Образец гидроксида натрия брали непосредственно на выходе из PVPP фильтра после приостановки последовательности стандартной регенерации на 3-й минуте (Фигура 5, заштрихованная часть). Раствор сразу же подкисляли 20 литрами фосфорной кислоты во время заполнения емкости, используемой для транспортировки.

Содержание полифенолов в образце гидроксида натрия (800 л) составило 19 г/л. Подкисленный гидроксид натрия (H3PO4, pH 5) обрабатывали частями приблизительно по 100 литров. Используемое устройство схематически представлено на Фигуре 6.

Разновидность этого устройства состоит из рециркулирующего органического растворителя (пунктирная стрелка, отмеченная звездочкой *). В этом случае, объем органического растворителя может быть уменьшен. Таким образом, например, 100 л спирта может быть использовано вместо 1000 л, как показано на Фигуре 6. Этот вариант имеет некоторые преимущества: (i) полифенолы могут быть получены в более высоких концентрациях; (ii) упаривание становится необязательным или даже излишним, и это возможно сделать без испарителя (это также верно в варианте, где используют одну смолу, как показано на Фигуре 8); (iii) устранение стадии упаривания, что в результате приводит к непосредственной лиофилизации продукта, делает этот процесс более экономичным.

Металлический фильтр помещали в контейнер Cornelius, циркуляцию жидкости вызывали со дна на верх во избежание проблем засорения.

Выход экстракции 60% может быть увеличен путем улучшения условий обработки гидроксида натрия.

Количество выделенных полифенолов составило приблизительно 9 кг и чистота была более 80%. Антиоксидантная активность полученного продукта была выше, чем в лабораторных испытаниях, поскольку выполнение пробного опыта позволило избежать попадания воздуха в циркуляцию во время перемещения между различными жидкостями и, следовательно, разрушения полифенолов.

Таблица 3Сравнение экстрактов, полученных выбранным способом
Серия экспериментов Лабораторное Пробный опыт
Количество сухого вещества (полученное в лаборатории, рассчитанное для пробного опыта) 17,5 г 10,96 кг
Титр полифенолов(г/г DM) 0,85 0,81
Масса полифенолов 14,9 г 8,82 кг
Доступный выход экстракции полифенолов (%) 65 60
Антиоксидантная активность
мг DPPH/г DM 3,7-4,5 5,3
мг DPPH/г полифенолов 4,4-5,3 6,6
Эквивалентность Тролоксу (г/г DM) 1,62-1,96 2,24
Эквивалентность Тролоксу (г/г полифенолов) 1,9-2,3 2,8

2.2 Промышленные аспекты

Для установления воспроизводимости полученных выше результатов, эти операции повторяли в течение пяти регенераций (Фигура 7).

Вследствие промышленных ограничений, проводили 5 регенерацию, хотя было использовано только 75% доступного PVPP, и количества определяемых полифенолов были низкими.

Образцы гидроксида натрия, взятые на различных PVPP фильтрах, показали сходные характеристики (таблица 4):

- потенциал доступного полифенола приблизительно составляет от 55 до 65 кг на регенерацию,

- в соответствии с видом кривой 65% полифенолов, содержащихся в регенерационном растворе, концентрируется за период 2 минуты (заштрихованная область на Фигуре 5).

Таблица 4Данные, характеризующие регенерацию
Прохождение гидроксида натрия 1 Период удержания Относительное содержание (%)
Длительность (минут) 7 ~ 2 25-30
Объем гидроксида натрия (гл) 120 ~ 35 25-30
Доступные полифенолы (кг) 55-65 35-45 60-65

Пример 3: Вариант извлечения полифенолов, полученных из пива

Другая возможность извлечения полифенолов состоит в замене PVPP смолой, разработанной Rohm & Haas (Фигура 8). Поскольку десорбцию этой смолы проводят с использованием спирта, соли поступают только из пива, а не из гидроксида натрия, нейтрализованного кислотой (нулевое потребление гидроксида натрия и кислоты). Возможно предложить продукт, имеющий минимальный титр полифенолов 95%. Помимо чистоты, увеличивается количество извлекаемых полифенолов, и достигает 60 кг на регенерацию. Для осуществления в промышленных масштабах, этот вариант требует модификации перечня технологических вспомогательных веществ, разрешенных для обработки пива, а также развития исследования для установления влияния этих модификаций на физические и органолептические характеристики пива.

Пример 4: Изучение профилактического действия полифенолов, полученных из побочных продуктов пивоваренной промышленности, на антиоксидантную активность и на когнитивную сферу после теплового удара у взрослых самцов крыс Sprague Dawley

4.1 Введение

Профилактическое действие полифенолов, полученных из побочных продуктов пивоваренной промышленности, на антиоксидантную активность, а также на когнитивную сферу после теплового удара, оценивали у взрослых самцов крыс Sprague Dawley.

Животных различных групп подвергали воздействию полифенолов в течение трех недель (D1-D22), вводимых перорально в дозах 25 и 50 мг/кг, или носителя (родниковая вода). Антиоксидантную активность полифенолов оценивали в цельной крови в начале и в конце профилактического воздействия, а затем в день после теплового удара, проводимого на 16 день. Обучающие тесты проводили как на модели выработки условного оборонительного рефлекса на вызывающий отвращение световой стимул (эффекторный условный рефлекс) на 19 день, так и в тесте водного лабиринта Морриса (пространственная память) на 21 и 22 день, для оценки защитного действия полифенолов против когнитивных расстройств, индуцированных чрезмерной продукцией свободных радикалов после теплового удара.

4.2 Материалы и методы

Животные

Использовали шестьдесят четыре самца крыс Sprague Dawley (Harlan, Holland) с массой тела от 250 до 275 г. При получении, крыс метили и разделяли на группы по четыре в поликарбонатные клетки F типа (48×27×20 см, U.A.R., 91 - Epinay-Sur-Orge, France). Животных размещали в помещении для животных, оборудованном установкой для кондиционирования воздуха при температуре 22±1°C. Крысы получали обычный корм 2016 (Harlan, France) и питье без ограничения (ad libitum) и подвергались 12-часовому инвертированному циклу дня и ноч