Молекулы, связывающиеся с 4-1вв

Молекулы, связывающиеся с 4-1вв

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам и, в частности, антителам, связывающимся с человеческим 4-1ВВ.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

4-1ВВ (также называемый CD137, TNFRSF9 и так далее) представляет собой трансмембранный белок суперсемейства рецептора фактора некроза опухоли (TNFRS). Согласно современному пониманию 4-1ВВ, его экспрессия обычно зависит от активации и происходит в широком спектре иммунокомпетентных клеток, включая активированные NK- и МКТ-клетки, регуляторные Т-клетки, дендритные клетки (DC), стимулированные тучные клетки, дифференцирующиеся миелоидные клетки, моноциты, нейтрофилы и эозинофилы (Wang, 2009, Immunological Reviews 229: 192-215). Также была показана экспрессия 4-1ВВ в сосудистой сети опухолей (Broil, 2001, Amer. J Clin. Pathol. 115(4):543-549; Seaman, 2007, Cancer Cell 11: 539-554) и в областях воспаленного или атеросклеротического эндотелия (Drenkard, 2007 FASEB J. 21: 456-463; Olofsson, 2008, Circulation 117: 1292-1301). Лиганд, стимулирующий 4-1ВВ, то есть лиганд 4-1ВВ (4-1 BBL), экспрессирован на активированных антигенпрезентирующих клетках (АРС), миелоидных клетках-предшественниках и гемопоэтических стволовых клетках.

Человеческий 4-1ВВ представляет собой белок из 255 аминокислот (регистрационный номер NM_001561; NP_001552). Аминокислотная последовательность полноразмерного человеческого 4-1ВВ представлена в SEQ ID NO:68. Данный белок содержит сигнальную последовательность (аминокислотные остатки 1-17) с последующим внеклеточным доменом (169 аминокислот), трансмембранной областью (27 аминокислот) и внутриклеточным доменом (42 аминокислоты) (Cheuk АТС et al. 2004 Cancer Gene Therapy 11: 215-226). Данный рецептор экспрессирован на поверхности клеток в мономерной и димерной формах и, вероятно, тримеризуется с лигандом 4-1ВВ при передаче сигнала.

Многочисленные исследования мышиных и человеческих Т-клеток показывают, что 4-1ВВ стимулирует усиленную пролиферацию клеток, их выживание и образование цитокинов (Croft, 2009, Nat Rev Immunol 9:271-285). Исследования продемонстрировали, что некоторые агонисты моноклональных антител (mAb) 4-1ВВ повышают экспрессию костимулирующих молекул и заметно усиливают цитолитические Т-лимфоцитарные ответы, приводя к противоопухолевым эффектам во многих моделях. mAb-агонисты 4-1ВВ показали эффективность в профилактических и терапевтических условиях. Кроме того, в моделях опухолей с монотерапией и комбинированной терапией 4-1ВВ были получены продолжительные противоопухолевые защитные Т-клеточные ответы (Lynch, 2008, Immunol Rev. 22: 277-286). Также было показано, что агонисты 4-1ВВ ингибируют аутоиммунные реакции во многих моделях аутоиммунитета, известных в данной области техники (Vinay, 2006, J Mol Med 84:726-736). Эта двойная активность 4-1ВВ приводит к возможности обеспечения противоопухолевой активности с одновременным смягчением аутоиммунных побочных эффектов, которые могут быть связаны со способами иммунотерапии, приводящими к нарушению иммунологической толерантности.

Существует назревшая неудовлетворенная потребность в антителах, связывающихся с человеческим 4-1ВВ, усиливающих 4-1ВВ-опосредованный ответ и обеспечивающих посредством этого потенциальное лекарственное средство для лечения различных заболеваний и состояний, включая рак.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей изобретения является обеспечение выделенной связывающей молекулы, связывающейся с человеческим 4-1ВВ, такой как антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или его производное. Другой задачей изобретения является обеспечение композиции, содержащей связывающую молекулу, связывающуюся с 4-1ВВ. Задачей настоящего изобретения также является обеспечение способов лечения заболевания и/или состояния, связанного с или опосредованного передачей сигнала 4-1ВВ, с использованием одной или более связывающих молекул по изобретению. Эти и другие задачи изобретения описаны здесь более подробно.

В некоторых аспектах согласно изобретению предложены выделенные антитела, связывающиеся с человеческим 4-1ВВ.

В одном конкретном аспекте выделенное антитело связывается с человеческим 4-1ВВ в эпитопе, содержащем аминокислотные остатки 115-156 SEQ ID NO:68. В некоторых конкретных воплощениях антитело содержит аминокислотную последовательность гипервариабельного участка 1 тяжелой цепи (H-CDR1) по SEQ ID NO:29, аминокислотную последовательность гипервариабельного участка 2 тяжелой цепи (H-CDR2) по SEQ ID NO:30 и аминокислотную последовательность гипервариабельного участка 3 тяжелой цепи (H-CDR3) по SEQ ID NO:31. В других определенных воплощениях антитело содержит аминокислотную последовательность гипервариабельного участка 1 легкой цепи (L-CDR1) по SEQ ID NO:34, аминокислотную последовательность гипервариабельного участка 2 легкой цепи (L-CDR2) по SEQ ID NO:35 и аминокислотную последовательность гипервариабельного участка 3 легкой цепи (L-CDR3) по SEQ ID NO:36.

В другом определенном аспекте выделенное антитело связывается с человеческим 4-1ВВ с константной диссоциации (Ко) 600 нМ или менее, 100 нМ или менее, 50 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5 нМ или менее, или 1 нМ или менее, как измерено для внеклеточного домена человеческого 4-1ВВ анализом BIACore, описанным в данном изобретении.

В другом определенном аспекте выделенное антитело содержит: (а) Н-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:15 или SEQ ID NO:29; (б) Н-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:30; и (в) Н-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17 или SEQ ID NO:31.

В другом определенном аспекте выделенное антитело содержит: (a) L-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:34; (б) L-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:35; и (в) L-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:55.

В другом аспекте выделенное антитело содержит: (а) H-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:15 или SEQ ID NO:29; (б) H-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:30; и (в) H-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17 или SEQ ID NO:31; и дополнительно содержит: (г) L-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:34; (д) L-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:35; и (e) L-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:55.

В некоторых других определенных аспектах выделенное антитело выбрано из группы, состоящей из:

а) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих: Н-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:1, H-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:2, и Н-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:3;

б) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих Н-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:15, H-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:16, и H-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:17, и

в) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих Н-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:29, H-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:30, и H-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:31.

В некоторых других аспектах согласно изобретению предложены выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично связывающиеся с человеческим 4-1ВВ, выбранные из группы, состоящей из:

а) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих L-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:6, L-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:7, и L-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:8;

б) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих L-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:20, L-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:21, и L-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:22;

в) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих L-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:34, L-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:35, и L-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:36; и

г) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих L-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:34, L-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:35, и L-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:55.

В некоторых других определенных аспектах выделенное антитело выбрано из группы, состоящей из:

а) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих: Н-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:1, H-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:2, Н-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:3; L-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:6, L-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:7, и L-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:8;

б) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих Н-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:15, H-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:16, Н-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:17; L-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:20, L-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:21, и L-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:22;

в) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих Н-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:29, H-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:30, Н-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:31; L-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:34, L-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:35, и L-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:36; и

г) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих Н-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:29, H-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:30, Н-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:31; L-CDR1, как изложено в SEQ ID NO:34, L-CDR2, как изложено в SEQ ID NO:35, и L-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:55.

В другом определенном аспекте выделенное антитело содержит аминокислотную последовательность цепи вариабельного домена (вариабельной области) тяжелой цепи (V_H), как изложено в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:43.

В другом определенном аспекте выделенное антитело содержит аминокислотную последовательность вариабельного домена (вариабельной области) легкой цепи (V_L), как изложено в SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:60 или SEQ ID NO:64.

В другом определенном аспекте выделенное антитело содержит аминокислотную последовательность домена V_H, как изложено в любой из SEQ ID NO:4, 18, 32 и 43, и дополнительно содержит аминокислотную последовательность домена V_L, как изложено в любой из SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:60 и SEQ ID NO:64.

В другом определенном аспекте выделенное антитело выбрано из группы, состоящей из:

а) антитела, содержащего аминокислотную последовательность цепи V_H, как изложено в SEQ ID NO:4, и аминокислотную последовательность цепи V_L, как изложено в SEQ ID NO:9;

б) антитела, содержащего аминокислотную последовательность цепи V_H, как изложено в SEQ ID NO:18, и аминокислотную последовательность цепи V_L, как изложено в SEQ ID NO:23;

в) антитела, содержащего аминокислотную последовательность цепи V_H, как изложено в SEQ ID NO:32, и аминокислотную последовательность цепи V_L, как изложено в SEQ ID NO:37 или SEQ ID NO:56; и

г) антитела, содержащего аминокислотную последовательность цепи V_H, как изложено в SEQ ID NO:43, и аминокислотную последовательность цепи V_L, как изложено в SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:60 или SEQ ID NO:64.

В другом определенном аспекте выделенное антитело, предложенное согласно настоящему изобретению, содержит цепь V_H, кодируемую (1) последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47, или (2) последовательностями нуклеиновых кислот, гибридизующимися в строгих условиях с комплементарной цепью SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:39 или SEQ ID NO:47.

В другом определенном аспекте выделенное антитело содержит цепь V_L, кодируемую (1) последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62 или SEQ ID NO:66, или (2) последовательностями нуклеиновых кислот, гибридизующимися в строгих условиях с комплементарной цепью SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62 или SEQ ID NO:66.

В другом определенном аспекте предложено выделенное антитело, конкурирующее и/или перекрестно конкурирующее за связывание с человеческим 4-1ВВ с иллюстративным антителом, выбранным из MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR 7483, MOR-7483.1 или MOR-7483.2.

В другом определенном аспекте предложено выделенное антитело, связывающееся с тем же эпитопом человеческого 4-1ВВ, что и любое из антител, описанных здесь. В некоторых воплощениях согласно изобретению предложено выделенное антитело, связывающееся с тем же эпитопом человеческого 4-1ВВ, что и иллюстративное антитело, выбранное из MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR 7483, MOR-7483.1 или MOR-7483.2.

В другом определенном аспекте согласно настоящему изобретению предложено выделенное антитело, связывающееся с человеческим 4-1ВВ, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, являющуюся продуктом или имеющую происхождение от человеческого гена V_H 3-23, гена V_H 1-69 или V_H 5. В другом определенном аспекте согласно настоящему изобретению предложено выделенное антитело, связывающееся с человеческим 4-1ВВ, содержащее вариабельную область легкой цепи, являющуюся продуктом или имеющую происхождение от человеческого гена V_L A3 или А1-13.

В некоторых воплощениях выделенные антитела, описанные здесь, имеют одно или более из следующих свойств или характеристик:

а) специфично связываются с человеческим 4-1ВВ;

б) связываются с человеческим 4-1ВВ и 4-1ВВ яванского макака;

в) связываются с человеческим 4-1ВВ или 4-1ВВ яванского макака, но не с крысиным или мышиным 4-1ВВ;

г) представляют собой IgG, такой как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4; и

д) представляют собой человеческие антитела или гуманизированные антитела.

В некоторых других аспектах согласно настоящему изобретению предложен антигенсвязывающий фрагмент любого из антител, предложенных согласно настоящему изобретению. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab- или scFv-фрагмент.

В некоторых других аспектах согласно настоящему изобретению предложено производное любого из антител, предложенных согласно настоящему изобретению.

В некоторых других аспектах согласно изобретению предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая цепь V_H антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, связывающегося с человеческим 4-1ВВ, выбранная из группы, состоящей из:

1) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность цепи V_H, как изложено в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:18. SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:43;

2) последовательности нуклеиновой кислоты, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:39 или SEQ ID NO:47; или

3) последовательности нуклеиновой кислоты, гибридизующейся в строгих условиях с комплементарной цепью последовательности нуклеиновой кислоты, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:39 или SEQ ID NO:47.

В некоторых других аспектах согласно изобретению предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая цепь V_L антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, связывающихся с человеческим 4-1ВВ, выбранная из группы, состоящей из:

1) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность цепи V_L, как изложено в SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:60, или SEQ ID NO:64;

2) последовательности нуклеиновой кислоты, как изложено в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62 или SEQ ID NO:66; или

3) последовательностей нуклеиновых кислот, гибридизующихся в строгих условиях с комплементарной цепью последовательности нуклеиновой кислоты, как изложено в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62 или SEQ ID NO:66.

В некоторых других аспектах согласно изобретению предложен вектор, содержащий любую из нуклеиновых кислот, описанных здесь. В другом аспекте согласно изобретению предложена клетка-хозяин, содержащая любой из векторов, описанных здесь. Такие клетки-хозяева могут представлять собой бактериальные клетки или клетки млекопитающих.

В некоторых других аспектах согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая любые из антител, их антигенсвязывающие фрагменты или их производные и фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно изобретению также предложены способы лечения аномального клеточного роста у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение субъекту эффективного количества связывающей молекулы по изобретению или фармацевтической композиции, описанной здесь. Согласно изобретению также предложены способы уменьшения метастазирования опухолевых клеток у субъекта, включающие введение указанному субъекту эффективного количества связывающей молекулы или фармацевтических композиций, описанных здесь.

В другом аспекте согласно изобретению предложено применение любой из связывающих молекул или фармацевтической композиции, описанной здесь, для изготовления лекарственного средства для лечения аномального клеточного роста у субъекта, нуждающегося в этом. В другом аспекте согласно изобретению предложена связывающая молекула или фармацевтическая композиция, как описано здесь, для применения в лечении аномального клеточного роста у субъекта, нуждающегося в этом. В другом аспекте согласно изобретению предложена связывающая молекула или фармацевтическая композиция, как описано здесь, для применения в лечении метастазирования опухолевых клеток у субъекта, нуждающегося в этом. В другом аспекте согласно изобретению предложено применение любой из связывающих молекул или фармацевтической композиции, описанной здесь, для изготовления лекарственного средства для лечения метастазирования опухолевых клеток у субъекта, нуждающегося в этом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1 представлены четыре столбчатые диаграммы, на которых показана средняя интенсивность флуоресценции нестимулированных (черные столбцы) и стимулированных фитогемагглютинином (РНА) (светло-серые столбцы) первичных мононуклеарных клеток периферической крови (РМВС) человека (сверху слева), яванского макака (сверху справа), собаки (снизу слева) и крысы (снизу справа), инкубированных с указанным антителом против 4-1ВВ или контрольным антителом, конъюгированными с Alexafluor 647. Диаграммы демонстрируют связывание с человеческими РВМС и РВМС яванского макака, стимулированными РНА.

На Фиг.2 представлены две линейные диаграммы, на которых показана активность репортерного гена люциферазы в клетках 293Т, экспрессирующих 4-1ВВ, стимулированных несколькими концентрациями mAb, специфичных в отношении 4-1ВВ, или контрольным mAb того же изотипа. На левой диаграмме показана активность репортерного гена в клетках, экспрессирующих 4-1ВВ яванского макака. На правой диаграмме показана активность в клетках, экспрессирующих человеческий 4-1ВВ. Данные представлены как кратность стимуляции по сравнению с контрольным mAb того же изотипа.

На Фиг.3 (3А и 3Б) представлены линейные диаграммы, на которых показана концентрация человеческого интерлейкина-2 (IL-2), присутствующего в культуральной среде клеток через 72 часа стимуляции человеческих Т-клеток антителом против CD3 и несколькими концентрациями антител против 4-1ВВ. Каждая из диаграмм (А и Б) относится к отдельному донору.

На Фиг.4 представлена диаграмма рассеяния, на которой показана экспансия человеческих мононуклеарных клеток периферической крови у мышей, которым вводили mAb против 4-1ВВ или контрольное mAb того же изотипа. Данные представлены как процент клеток, экспрессирующих человеческий CD45, в периферической крови отдельных мышей NSG на 24-28 сутки исследования, которым были проведены инъекции шести миллионов человеческих мононуклеарных клеток периферической крови на 0 сутки и инъекции 1 мг/кг mAb против 4-1ВВ или контрольного mAb того же изотипа на 9 сутки. Статистическую значимость определяли двусторонним критерием Манна-Уитни, *р<0,05, **р<0,005. «Без НВРТ» относится к животным, которым не проводили инъекцию человеческих клеток.

На Фиг.5 представлены две столбчатые диаграммы, на которых показано изменение пролиферации CD8 центральных Т-клеток памяти в нескольких временных точках после введения mAb против 4-1ВВ у яванских макаков. Данные показаны в форме столбцов, соответствующих отдельным животным, обозначенным как (уровень дозы - номер животного), и представлены как изменение числа KJ-67+ клеток у животного по сравнению с их числом до исследования {[(число KJ-67+клеток на указанные сутки исследования - число KI-67+ клеток перед введением)/число KJ-67+ клеток перед введением]*100}. CD8 центральные клетки памяти определяли как CD3+, CD8+, CD28+ и CD95+.

На Фиг.6 представлены линейные диаграммы, на которых показан рост опухолей после подкожного введения опухолевых клеток (РС3, левая диаграмма; LOVO, правая диаграмма) и человеческих мононуклеарных клеток периферической крови на 0 сутки исследования. Мышам вводили 10 мг/кг указанных mAb против 4-1ВВ на 0 сутки.

Фиг.7. Слева представлена диаграмма рассеяния, на которой показан процент РВМС, положительных в отношении поверхностного маркера Т-клеток CD8+и содержащих нуклеозидный аналог бромдезоксиуридин (BrdU) после введения 4-1ВВ - «нок-ин» мышам mAb против 4-1ВВ или контроля наполнителем. Справа представлена линейная диаграмма, на которой показан рост опухолей мышиной меланомы, введенных подкожно 4-1ВВ «нок-ин» мышам, которым вводили mAb против 4-1ВВ в указанной концентрации.

На Фиг.8 показаны выравнивания аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи (с подчеркнутыми гипервариабельными областями (CDR)) с соответствующими последовательностями эмбрионального типа. «GERMLINE VH1-69» - эмбриональный V_H 1-69; «GERMLINE VH3-23» - эмбриональный V_H 3-23; «GERMLINE VH5» - эмбриональный V_H 5; «GERMLINE VL3-r» - эмбриональный V_L 3-r.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

А. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если здесь не определено иное, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, имеют значение, обычно подразумеваемое специалистами в данной области техники. Кроме того, если контекст не требует иного, термины в единственном числе включают множественное число, и термины во множественном числе включают единственное число. Обычно методики клеточных и тканевых культур, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, химии белков и нуклеиновых кислот и гибридизации, описанные здесь, и используемые в связи с ними номенклатуры являются хорошо известными и широко применяемыми в данной области техники.

При использовании здесь каждый из следующих терминов имеет значение, связанное с ним в данном разделе.

Термин «антитело против 4-1ВВ» относится к антителу, как определено здесь, способному связываться с человеческим рецептором 4-1ВВ.

Термины «4-1ВВ» и «рецептор 4-1ВВ» использованы в настоящей заявке взаимозаменяемо и включают человеческий рецептор 4-1ВВ, а также его варианты, изоформы и видовые гомологи. Соответственно, связывающая молекула, как определено и раскрыто здесь, может также связываться с формами 4-1ВВ, отличными от человеческой. В других случаях связывающая молекула может быть полностью специфична в отношении человеческого 4-1ВВ и может не демонстрировать перекрестную реактивность с другими видами или другими типами.

Формы единственного числа относятся к одному или более (то есть по меньшей мере одному) грамматическим объектам. Например, «элемент» означает один элемент или более чем один элемент.

Термин «агонист» относится к связывающей молекуле, как определено здесь, которая при связывании с 4-1ВВ (1) стимулирует или активирует 4-1ВВ, (2) усиливает, повышает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие 4-1ВВ, или (3) усиливает, повышает, стимулирует или индуцирует экспрессию 4-1ВВ.

Термин «аминокислота» относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, функционирующим сходным с встречающимися в природе аминокислотами образом. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, модифицируемые позднее, например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Термин «аналоги аминокислот» относится к соединениям, имеющим такую же основную химическую структуру, как встречающаяся в природе аминокислота, но С-концевая карбоксильная группа, N-концевая аминогруппа или функциональная группа боковой цепи были химически модифицированы с образованием другой функциональной группы. Термин «миметики аминокислот» относится к химическим соединениям, имеющим структуру, отличную от обычной химической структуры аминокислоты, но функционирующим сходным образом с встречающейся в природе аминокислотой.

Термин «антитело» является термином, известным в данной области техники, и относится к антигенсвязывающему белку (то есть иммуноглобулину), имеющему основную структуру из четырех полипептидных цепей, состоящую из двух идентичных тяжелых (Н) цепей и двух идентичных легких (L) цепей. Каждая L-цепь связана с Н-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как две Н-цепи связаны друг с другом одной или более дисульфидными связями, в зависимости от изотипа Н-цепей. Каждая тяжелая цепь имеет на N-конце вариабельную область (обозначаемую здесь аббревиатурой V_H) с последующей константной областью. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь имеет на N-конце вариабельную область (обозначаемую здесь аббревиатурой V_L) с последующей константной областью на ее другом конце. Константная область легкой цепи состоит из одного домена C_L. V_L расположена напротив V_H, и C_L расположена напротив первого константного домена тяжелой цепи (СН1). Совместно пара V_H и V_L образует один антигенсвязывающий сайт. Антитело IgM состоит из 5 основных гетеротетра мерных единиц вместе с дополнительным полипептидом, называемым J-цепью, и, таким образом, содержит 10 антигенсвязывающих сайтов, в то время как секретируемые антитела IgA способны к полимеризации с образованием поливалентных структур, содержащих 2-5 основных 4-хцепочечных единиц с J-цепью.

Области V_H и V_L могут быть дополнительно разделены на гипервариабельные участки, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), разделенные более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). CDR-участки могут быть определены с использованием систем нумерации Kabat или Chothia, обе из которых хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Kabat, Е.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных, от М-конца к С-концу, в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В настоящем изобретении три CDR тяжелой цепи названы H-CDR1, H-CDR2 и Н-CDR3. Сходным образом, три CDR легкой цепи названы L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, взаимодействующий с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. В легкой и тяжелой цепях вариабельные и константные области соединены «J»-областью из приблизительно 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также содержит «D»-o6nacTb из приблизительно 10 или более аминокислот. В целом, см. Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2^nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)).

L-цепь любого вида позвоночных может быть отнесена к одному из двух четко разделенных типов, называемых каппа и лямбда, на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей (СН), антитела могут быть отнесены к различным классам или изотипам. Существует пять классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющие тяжелые цепи, обозначаемые а (альфа), 5 (дельта), £ (эпсилон), у (гамма) и р (мю), соответственно. Класс антител IgG может быть дополнительно разделен на четыре подкласса: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, на основании тяжелых цепей гамма, Y1-Y4, соответственно.

Термин «производное антитела» или «производное» антитела относится к молекуле, способной связываться с тем же антигеном (то есть 4-1ВВ), с которым связывается антитело, и содержащей аминокислотную последовательность антитела, связанную с дополнительной молекулярной группировкой. Аминокислотная последовательность антитела, входящая в производное антитела, может представлять собой полноразмерную тяжелую цепь, полноразмерную легкую цепь, любую часть или части полноразмерной тяжелой цепи, любую часть или части полноразмерной легкой цепи антитела, любой(ые) другой(ие) фрагмент(ы) антитела или полноразмерное антитело. Дополнительная молекулярная группировка может представлять собой химическую или биологическую молекулу. Примеры дополнительных молекулярных группировок включают химические группы, аминокислоты, пептиды, белки (такие как ферменты, антитела) и химические соединения. Дополнительная молекулярная группировка может быть использована в качестве, например, агента для выявления, метки, маркера, фармацевтического или терапевтического агента. Аминокислотная последовательность антитела может быть присоединена или связана с дополнительной молекулярной группировкой химическим сочетанием, генетическим слиянием, нековалентным соединением или иным образом. Термин «производное антитела» также включает химерные антитела, гуманизированные антитела и молекулы, имеющие происхождение от модификаций аминокислотных последовательностей антитела против 4-1ВВ, таких как консервативные аминокислотные замены, присоединения и вставки.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» или «антигенсвязывающая часть» антитела относится к одной или более частям антитела, сохраняющим способность связываться с антигеном, с которым связывается антитело (например, 4-1ВВ). Примеры «антигенсвязывающего фрагмента» антитела включают: (1) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; (2) F(ab')₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидной связью в шарнирной области; (3) Fd-фрагмент, состоящий из доменов V_H и C_H1; (4) Fv-фрагмент, состоящий из доменов V_L и V_H одной части антитела, (5) dAb-фрагмент (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)), состоящий из домена V_H; и (6) выделенный гипервариабельный участок (CDR).

Термин «связывающая молекула» включает: (1) антитело; (2) антигенсвязывающий фрагмент антитела; и (3) производное антитела, как они определены здесь.

Термин «связывание 4-1ВВ», «связывает 4-1ВВ», «связывание с 4-1ВВ» или «связывается с 4-1ВВ» относится к связыванию связывающей молекулы, как определено здесь, с человеческим 4-1ВВ в in vitro-анализе, таком как анализ BIAcore, как описано в Примере 6, с аффинностью (K_D) 500 нМ или менее.

Термин «химерное антитело» относится к антителу, содержащему аминокислотные последовательности, имеющие происхождение от разных видов животных, такому как антитела, имеющие вариабельную область, имеющую происхождение от человеческого антитела, и константную область мышиного иммуноглобулина.

Термин «конкурирует за связывание» относится к взаимодействию двух антител при их связывании с мишенью связывания. Первое антитело конкурирует за связывание со вторым антителом, если связывание первого антитела с его когнатным эпитопом выявляемо снижено в присутствии второго антитела по сравнению со связыванием первого антитела в отсутствие второго антитела. Возможен, но не обязателен, альтернативный вариант, где связывание второго антитела с его эпитопом также выявляемо снижено в присутствии первого антитела. То есть, первое антитело может ингибировать связывание второго антитела с его эпитопом без ингибирования вторым антителом связывания первого антитела с его соответствующим эпитопом. Тем не менее, если каждое антитело выявляемо ингибирует связывание другого антитела с его когнатным эпитопом, в такой же, большей или меньшей степени, говорят, что антитела «перекрестно конкурируют» друг с другом за связывание с их соответствующим(и) эпитопом(ами).

Термин «эпитоп» относится к части антигена, с которой связывается антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент). Эпитопы могут быть образованы смежными аминокислотами или несмежными аминокислотами, расположенными рядом друг с другом при формировании третичной структуры белка. Эпитопы, образованные смежными аминокислотами, обычно сохраняются при обработке денатурирующими растворителями, тогда как эпитопы, образованные при формировании третичной структуры, обычно не сохраняются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп может содержать различные количества аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс.См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, G.E. Morris, Ed. (1996). После определения желаемого эпитопа на антигене могут быть получены антитела к данному эпитопу, например, с применением методик, описанных здесь. При получении и определении свойств антител можно также получить информацию о желаемых эпитопах. На основании этой информации затем можно проводить конкурентный скрининг антител на связывание с одним и тем же эпитопом. Одним способом достижения описанного выше является проведение перекрестие-конкурентных исследований для обнаружения антител с конкурентным связыванием друг относительно друга, то есть антител, конкурирующих за связывание с антигеном. Высокоэффективный способ «селекции» антител на основании их перекрестной конкуренции описан в РСТ-публикации № WO 03/48731.

Термин «эмбриональный» относится к нуклеотидным последовательностям генов и сегментов генов антител при их передаче от родителей потомству через половые клетки. Эмбриональная последовательность отличается от нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела в зрелых В-клетках, измененных рекомбинацией и гипермутацией при созревании В-клеток.

Термин «сайты гликозилирования» относится к аминокислотным остаткам, распознаваемым эукариотической клеткой как места присоединения сахарных остатков. Аминокислоты, к которым происходит присоединение углевода, такого как олигосахарид, обычно представляют собой остатки аспарагина (N-связь), серина (O-связь) и треонина (O-связь). На точное место присоединения обычно указывает последовательность аминокислот, называемая здесь «последовательностью сайта гликозилирования». Последовательность сайта гликозилирования для N-гликозилирования представляет собой -Asn-X-Ser- или -Asn-X-Thr-, где Х может представлять собой любую обычную аминокислоту, не являющуюся пролином. Термины «N-гликозилирование» и «O-гликозилирование» относятся к химической группе, используемой в качестве сайта присоединения между молекулой сахара и аминокислотным остатком. Присоединение N-связанных Сахаров происходит через аминогруппу; присоединение O-связанных Сахаров происходит через гидроксильную группу. Термин «степень гликозилирования» относится к присутствию углеводной группировки, связанной с сайтом гликозилирования (то есть сайт гликозилирования занят). Там, где на пептиде присутствуют по меньшей мере два возможных сайта гликозилирования, углеводными группировками может не быть занят ни один сайт (степень гликозилирования 0), может быть занят один сайт (степень гликозилирования 1) или оба сайта (степень гликозилирования 2).

Термин «клетка-хозяин» относится к клеточной системе, которая может быть сконструирована для получения белков, фрагментов белков или интересующих пептидов. Клетки-хозяева включают, без ограничения, культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, имеющие происхождение от грызунов (крыс, мышей, морских свинок или хомяков), такие как СНО, ВНК, NSO, SP2/0, YB2/0, или человеческие ткани или клетки гибридом, дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки трансгенного животного или культивированной ткани. Данный термин включает не только конкретную рассматриваемую клетку, но также потомство такой клетки. Поскольку в последующих поколениях возможны определенные модификации, обусловленные мутацией или влияниями среды, такое потомство может не быть идентичным исходной клетке, но оно все равно включено в объем термина «клетка-хозяин».

Термин «человеческое антитело» относится к антителу, в котором все аминокислотные последовательности легких цепей и тяжелых цепей имеют происхождение от генов человеческих иммуноглобулинов. Человеческое антитело может содержать мышиные углеводные цепи, если оно получено в мыши, мышиной клетке или в гибридоме, имеющей происхождение от мышиной клетки. Человеческие антитела могут быть получены множеством способов, известных в данной области техники.

Термин «гуманизированное антитело» относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки, имеющие происхождение от последовательностей человеческих антител. Гуманизированное антитело может содержать некоторые или все CDR антитела животного, не являющегося человеком, в то время как каркасные и константные области антитела содержат аминокислотные остатки, имеющие происхождение от последовательностей человеческих антител.

Термин «иллюстративное антитело» относится к любому из антител, описанных в изоб