Новые антитела, ингибирующие димеризацию с-мет, и их применения

Новые антитела, ингибирующие димеризацию с-мет, и их применения

Реферат

Область изобретения

Данное изобретение относится к новым антителам, способным специфично связываться с человеческим c-Met-рецептором и/или способным специфично ингибировать тирозинкиназную активность указанного рецептора, особенно к моноклональным антителам мышиного, химерного и гуманизированного происхождения, а также к аминокислотным и нуклеиновокислотным последовательностям, кодирующим эти антитела. В частности, антитела в соответствии с изобретением способны ингибировать димеризацию c-Met. Аналогичным образом изобретение включает в себя применение этих антител в качестве лекарственного средства для профилактики и/или терапевтического лечения раковых заболеваний или любой патологии, связанной со сверхэкспрессией указанного рецептора, а также в способах и наборах для диагностики заболеваний, связанных со сверхэкспрессией c-Met. Наконец, изобретение включает продукты и/или композиции, включающие такие антитела в сочетании с другими антителами и/или химическими соединениями, направленными против других факторов роста, участвующих в опухолевой прогрессии и метастазировании, и/или соединениями и/или противораковыми агентами или агентами, конъюгированными с токсинами, и их применение для профилактики и/или лечения некоторых раковых заболеваний.

Уровень техники

Агенты, мишенями которых является рецепторная тирозинкиназу (receptor tyrosine kinase, RTK), такие как ингибиторы трастуцумаб, цетуксимаб, бевацизумаб, иматиниб и гефитиниб, являются иллюстрацией существующего интереса к выбору этого класса белков в качестве мишеней при лечении отдельных раковых заболеваний.

c-Met является первым членом подсемейства RTK, которое также включает RON и SEA. Семейство c-Met RTK структурно отличается от других семейств RTK и является единственным известным высокоаффинным рецептором для фактора роста гепатоцитов (HGF), называемого также scater-фактором (SF) [D.P. Bottaro et al., Science 1991, 251:802-804; L Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:2867-2878]. c-Met и HGF широко экспрессируются различными тканями, и их экспрессия, как правило, ограничена клетками эпителиального и мезенхимального происхождения соответственно [M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6:1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123:223-235]. Оба они необходимы для нормального развития млекопитающих, и, как было показано, особенно важны для клеточной миграции, морфогенной дифференцировки и формирования трехмерных трубчатых структур, а также для роста и ангиогенеза [F. Baldt et al., Nature 1995, 376:768-771; С.Schmidt et al., Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101]. В то время, как было показано, что контролируемое регулирование c-Met и HGF важно для развития млекопитающих, поддержания и репарации тканей [Nagayama Т, Nagayama M, Kohara S, Kamiguchi H, Shibuya M, Katoh Y, Itoh J, Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5; 999(2):155-66; Tahara Y, Ido A, Yamamoto S, Miyata Y, Uto H, Hori T, Hayashi K, Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1):146-51], нарушение их регуляции участвует в прогрессировании раковых заболеваний.

Аберрантная сигнализация, движимая несоответствующей активацией с-Met, является одним из наиболее часто наблюдаемых изменений в раковых опухолях человека и играет важнейшую роль в образовании опухолей и метастазировании [Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino and Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2(4):289-300].

Несоответствующая активация c-Met может возникнуть путем лиганд-зависимых и лиганд-независимых механизмов, которые включают сверхэкспрессию c-Met и/или паракринную или аутокринную активацию, или путем усиления функции мутации [J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R., Cancer Latters. 2005, 226:1-26]. Однако олигомеризация c-Met-рецептора в присутствии или в отсутствие лиганда необходима для регулирования аффинности связывания и кинетики связывания киназы с АТФ и тирозин-содержащими пептидными субстратами [Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 Aug 17, 43:10570-8]. Активированный c-Met привлекает сигнальные эффекторы к месту своего скопления, расположенному в цитоплазматическом домене, что приводит к активации ряда ключевых сигнальных путей, в том числе Ras-MAPK, PI3K, Src и Stat3 [Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1):49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]. Эти пути имеют важное значение для пролиферации опухолевых клеток, инвазии и ангиогенеза и для уклонения от апоптоза [Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000, 19(49):5582-9; Gu H, Neel BG, Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3):122-30; Fan S, Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q, Cao Y, Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 2000 Apr 27, 19(18):2212-23]. Кроме того, уникальным аспектом c-Met-сигнализации по сравнению с другими РТК является выявленное взаимодействие его с фокальными адгезионными комплексами и некиназными связывающими партнерами, такими как интегрины α6β4 [Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM, Cell. 2001, 107:643-54], CD44v6 [Van der Voort R, Taher ТЕ, Wielenga VJ, Spaargaren M, Prevo R, Smit L, David G, Hartmann G, Gherardi E, Pals ST, J Biol Chem. 1999, 274(10):6499-506], плексин В1 или семафорины [Giordano S, Corso S, Conrotto P, Artigiani S, Gilestro G, Barberis D, Tamagnone L, Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9)720-4; Conrotto P, Valdembri D, Corso S, Serini G, Tamagnone L, Comoglio PM, Bussolino F, Giordano S, Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P, Corso S, Gamberini S, Comoglio PM, Giordano S, Oncogene. 2004, 23:5131-7], которые могут еще больше усложнить регуляцию клеточной функции этим рецептором. Наконец, недавние данные показывают, что c-Met может быть вовлечен в формирование опухолевой резистентности к гефитинибу или эрлотинибу, подтверждая, что комбинация соединения, направленного на EGFR, и c-Met, может представлять значительный интерес [Engelman JA at al., Science, 2007, 316:1039-43].

В последние несколько лет многие различные стратегии были разработаны с целью смягчения c-Met-сигнализации в линиях раковых клеток. Эти стратегии включают i) нейтрализующие антитела против c-Met или HGF/SF [Сао В, Su Y, Oskarsson M, Zhao P, Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98(13):7443-8; Martens T, Schmidt NO, Eckerich C, Fillbrandt R, Merchant M, Schwall R, Westphal M, Lamszus K, Clin Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52] или использование HGF/SF-антагониста NK4 для предотвращения связывания лиганда с c-Met [Kuba K, Matsumoto K, Date K, Shimura H, Tanaka M, Nakamura T, Cancer Res., 2000, 60:6737-43], ii) низкомолекулярные ингибиторы сайта связывания АТФ на c-Met для блокирования киназной активности [Christensen JG, Schreck R, Burrows J, Kuruganti P, Chan E, Le P, Chen J, Wang X, Ruslim L, Blake R, Lipson KE, Ramphal J, Do S, Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63:7345-55], iii) сконструированный полипептидный домен SH2, который препятствует подходу к месту скопления РНК или рибозима, уменьшая экспрессию рецептора или лиганда. Большинство из этих подходов отображает селективное ингибирование c-Met, приводящее к ингибированию опухоли и показывающее, что c-Met может представлять интерес для терапевтического вмешательства при раке.

Среди молекул, созданных для действия на c-Met, есть некоторые антитела.

Наиболее подробно описанным является антитело анти-c-Met 5D5, созданное Genentech [WO96/38557], которое ведет себя как мощный агонист при добавлении его одного в различных моделях, и как антагонист при использовании его в качестве фрагмента Fab. Моновалентная сконструированная форма этого антитела, описанная как 5D5 с одной ветвью (OA5D5) и полученная как рекомбинантный белок в Е.Coli, также является предметом патентной заявки [WO2006/015371] от Genentech. Однако эта молекула, которая не может рассматриваться в качестве антитела из-за своего особого остова, демонстрирует также мутации, которые могут быть иммуногенными у людей. С точки зрения активности эта негликозилированная молекула лишена эффекторных функций и, наконец, отсутствие четких данных показывает, что OA5D5 ингибирует димеризацию c-Met. Кроме того, при испытании на модели in vivo G55, клеточной линии глиобластомы, которая экспрессирует мРНК и белок c-Met, но не HGF, и которая растет независимо от лиганда, анти-c-Met с одной ветвью не оказывает существенного влияния на рост опухоли G55, подтверждая, что OA5D5 действует главным образом путем блокирования связывания HGF и не способен воздействовать на опухоли, активированные независимо от HGF [Martens Т. et al, Clin. Cancer Res., 2006, 12(20):6144-6152].

Другое антитело, направленное на c-Met, Pfizer описывает как антитело, действующее "по большей части как c-Met-антагонист, а в некоторых случаях как с-Met-агонист" [WO 2005/016382]. Нет данных, свидетельствующих о каком-либо влиянии антител Pfizer'a на димеризацию c-Met, описанную в этой заявке.

Одним из инновационных аспектов данного изобретения является создание мышиных моноклональных антител без внутренней агонистической активности и ингибирующих димеризацию c-Met. Кроме целевых лиганд-зависимых опухолей, этот подход будет также ограничивать лиганд-независимую активацию c-Met благодаря его сверхэкспрессии или мутациям во внутриклеточных доменах, которым по-прежнему необходима олигомеризация для сигнализации. Другим аспектом активности таких антител может быть стерическое препятствие взаимодействию c-Met с его партнерами, что приведет к ослаблению функций с-Met. Эти антитела будут гуманизированными и предпочтительно сконструированными в качестве человеческого lgG1, но не ограничиваясь этим, для получения эффекторных функций, таких как ADCC и CDC, в дополнение к функциям, связанным со специфической блокадой c-Met-рецепторов.

Раскрытие изобретения

Удивительно, но в первый раз изобретателям удалось создать антитело, способное связываться с c-Met, а также способное ингибировать димеризацию с-Met. Если правда, что в предыдущей области иногда полагали, что антитело, способное ингибировать димеризацию c-Met с его партнерами, может быть интересным, то антитело, способное делать это, никогда не было раскрыто или ясно предложено. Кроме того, что касается специфичности антитела, то достижение успеха в получении такого активного антитела не было очевидным для всех.

В первом аспекте предметом данного изобретения является способ получения и отбора антител в соответствии с изобретением.

В частности, изобретение относится к способу отбора анти-с-Met-антитела или одного из его функциональных фрагментов или производных, способного ингибировать как лиганд-зависимую, так и лиганд-независимую активацию c-Met, при этом указанный способ включает следующие этапы:

i) скрининг полученных антител и отбор антител, способных специфично связываться с c-Met;

ii) оценка in vitro отобранных антител этапа i) и отбор антител, способных ингибировать по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 60%, 70% или 80%, опухолевую пролиферацию клеток по меньшей мере одного типа опухоли; а затем

iii) испытание отобранных антител этапа ii) и отбор антител, способных ингибировать димеризацию c-Met.

Как объяснялось ранее, ингибирование димеризации c-Met является главным аспектом изобретения, т.к. такие антитела будут представлять реальный интерес для широкой группы пациентов. Не только лиганд-зависимый активированный c-Met-рак, как это было до данного изобретения, но также и лиганд-независимый активированный c-Met-рак можно лечить с помощью антител, созданных в способе данного изобретения.

Создание антитела может быть реализовано любым способом, известным специалисту в данной области, таким как, например, слияние миеломой клетки с клетками селезенки иммунизированных мышей или других видов, совместимых с отобранными клетками миеломы [Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]. Иммунизированные животные могут включать трансгенных мышей с человеческими иммуноглобулиновыми локусами, которые затем непосредственно продуцируют человеческие антитела. Другое возможное воплощение может состоять в использовании технологий фагового дисплея для скрининга библиотек.

Этап скрининга i) может быть реализован с помощью любого способа или процесса, известного специалисту в данной области. В качестве не ограничивающих примеров можно упомянуть ИФА, BIAcore, иммуногистохимию, FACS-анализ и функциональную оценку. Предпочтительный способ состоит в скрининге с помощью ИФА по рекомбинантному белку c-Met, а затем в FACS-анализе по меньшей мере опухолевой клеточной линии, чтобы убедиться, что производимые антитела смогут также распознавать нативные рецепторы на опухолевых клетках. Этот способ более точно будет описан в следующих примерах.

Таким же образом этап ii) может быть классически реализован в соответствии с известным способом или процессом, таким как, например, с помощью ³H-тимидина или любого другого ДНК-окрашивающего агента, МТТ-тест, определение АТФ и т.д. Предпочтительной опухолевой клеточной моделью в данном изобретении может быть ВхРС3-модель.

Под ингибированием димеризации c-Met предпочтительно следует понимать гомодимеризацию c-Met.

В предпочтительном воплощении этапа iii) отбора способа изобретения указанный этап iii) состоит в оценке антител на основе BRET-анализа клеток, экспрессирующих c-Met-RLuc/c-Met-YFP, и в отборе антител, способных ингибировать по меньшей мере на 30%, предпочтительно на 35%, 40%, 45%, 50%, 55% и наиболее предпочтительно на 60% BRET-сигнал.

Технология BRET представляет собой технологию, известную в качестве образцовой для димеризации белка [Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89].

BRET-технология, используемая в этапе iii) способа, хорошо известна специалисту в данной области и будет подробно описана в следующих примерах. В частности, BRET (bioluminescence resonance energy transfer, резонансный перенос энергии биолюминесценции) представляет собой нерадиационный перенос энергии, возникающий между биолюминесцентным донором (люциферазой Renilla (Rluc)) и флуоресцентным акцептором, мутантом GFP (green fluorescent protein, зеленый флуоресцентный белок) или YFP (yellow fluorescent protein, желтый флуоресцентный белок). В данном случае был использован EYFP (enhanced yellow fluorescent protein, усиленный желтый флуоресцентный белок). Эффективность переноса зависит от ориентации и расстояния между донором и акцептором. Затем, передача энергии может происходить только тогда, когда две молекулы находятся в непосредственной близости (1-10 нм). Это свойство используется для проведения анализа белково-белковых взаимодействий. Действительно, в целях изучения взаимодействия между двумя партнерами первый из них генетически сливают с люциферазой Renilla, а второй с желтым мутантом GFP. Гибридные белки, как правило, но не обязательно, экспрессируются клетками млекопитающих. В присутствии своего мембранно-проницаемого субстрата (коэлентеразин) Rluc испускает синий свет. Если мутант GFP находится ближе 10 нм к Rluc, то может возникнуть передача энергии, и будет обнаружен дополнительный желтый сигнал. Сигнал BRET измеряется как соотношение между светом, излучаемым акцептором, и светом, излучаемым донором. Так, BRET-сигнал будет увеличиваться по мере сближения двух гибридных белков, или если конформационное изменение сблизит Rluc и GFP-мутант.

Если BRET-анализ включен в предпочтительное воплощение, то любой способ, известный специалисту в данной области, можно использовать для измерения димеризации c-Met. He ограничивая, можно отметить следующие технологии: FRET (fluorescence resonance energy transfer, резонансный перенос энергии флуоресценции), HTRF (homogenous time resolved fluorescence, гомогенная флуоресценция с временным разрешением), FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy, флуоресцентная микроскопия с изображением по времени жизни флуоресценции) или SW-FCCS (single wavelength fluorescence cross-correlation spectroscopy, кросс-корреляционная спектроскопия флуоресценции одной длины волны).

Также могут быть использованы другие классические технологии, например коиммунопреципитация, Alpha Screen, химическое сшивание, двойной гибрид, аффинная хроматография, ИФА и фар-вестерн-блоттинг.

Во втором аспекте предметом изобретения является изолированное антитело или один из его функциональных фрагментов или производных, полученных в указанном способе. Указанное антитело или один из его указанных фрагментов или производных способно к специфическому связыванию человеческого c-Met, и кроме того, при необходимости предпочтительно способно ингибировать природное присоединение его лиганда HGF и/или способно специфически ингибировать тирозинкиназную активность указанного c-Met; указанное антитело также будет способно ингибировать димеризацию c-Met. В частности, указанные антитела будут способны ингибировать как лиганд-зависимую, так и лиганд-независимую активацию c-Met.

Выражения "функциональные фрагменты и производные" подробно будут определены ниже в данном описании.

Следует понимать здесь, что изобретение не относится к антителам в природной форме, то есть они находятся не в их природной среде, но что они могут быть выделены или получены путем очистки из природных источников, либо получены путем генетической рекомбинации, либо путем химического синтеза, и что они могут содержать неприродные аминокислоты, как будет описано ниже.

В частности, в соответствии с другим аспектом изобретения, заявлено антитело или один из его функциональных фрагментов или производных, охарактеризованное тем, что оно содержит по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность (CDR), выбранный среди CDR, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID №№1-17 и 56-61.

Любое антитело или фрагмент или производное, имеющее по меньшей мере один CDR, последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентична после оптимального выравнивания с последовательностью SEQ ID №№1-17 и 56-61, следует понимать как эквивалент и, следовательно, как часть изобретения.

Термин «CDR-участки», или «CDR», предназначен для обозначения гипервариабельных участков тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, как это определено в IMGT.

Уникальная нумерация IMGT была создана для сравнения вариабельных доменов независимо от антигенного рецептора, типа цепи или вида [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, С., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. В уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда занимают одну и ту же позицию, например цистеин 23 (1-CYS), триптофан 41 (CONSERVED-TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2-CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT предусматривает стандартизированное разграничение каркасных участков (FR1-IMGT: позиции 1-26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 и FR4-IMGT: 118-128) и участков, определяющих комплементарность: CDR1-IMGT: 27-38, CDR2-IMGT: 56-65 и CDR3-IMGT: 105-117. Т.к. разрывы представляют собой незанятые позиции, то длины CDR-IMGT (показаны в скобках и разделенных точками, например [8.8.13]) становятся важной информацией. Уникальная нумерация IMGT используется в 2D-графическом представлении, созданном как IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], и в 3D-CTpyKrypax в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Т cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Существует три тяжелых цепи CDR и 3 легких цепи CDR. Термин «CDR» применяется здесь для обозначения в зависимости от случая одного из этих участков или нескольких, или даже всех этих участков, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинное связывание антитела с антигеном или эпитопом, который он распознает.

Термин "процент идентичности" двух нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей в контексте данного изобретения применяется для указания процента нуклеотидов или идентичных аминокислотных остатков в двух сравниваемых последовательностях, полученного после лучшего выравнивания (оптимального выравнивания); этот процент не чисто статистический и различия между двумя последовательностями распределяются случайным образом и по всей их длине. Сравнение двух нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей традиционно проводится путем сравнения этих последовательностей после выравнивания их оптимальным образом; указанное сравнение может осуществляться по сегментам или с помощью "окна сравнения". Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть осуществлено, в дополнение к ручному, с помощью алгоритма локальной гомологии Смита-Уотермана (1981) [Ad. App. Math. 2:482], с помощью алгоритма локальной гомологии Нидлмана-Вунша (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], с помощью способа поиска сходства Пирсона и Липмана (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), с помощью компьютерного программного обеспечения с использованием этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, либо с помощью программного обеспечения для сравнения BLAST N или BLAST Р).

Процент идентичности двух нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей определяют путем сравнения этих двух последовательностей, выравненных оптимальным образом, в котором сравниваемая нуклеиновокислотная или аминокислотная последовательность может включать добавления или делеции по сравнению с исходной последовательностью для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Процент идентичности рассчитывается путем определения числа идентичных позиций, в которых нуклеотид или аминокислотный остаток идентичен для двух последовательностей, деления этого количества идентичных позиций на общее количество позиций в «окне сравнения» и умножения полученного результата на 100, чтобы получить процент идентичности этих двух последовательностей.

Например, программа BLAST "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250), доступная на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, может быть использована с параметрами по умолчанию (в частности с параметрами "штраф за открытие делеции": 5 и "штраф за удлинение делеции": 2; выбранной матрицей будет, например, матрица "BLOSUM 62", предложенная в программе); процентная идентичность двух сравниваемых последовательностей рассчитывается непосредственно в программе.

Среди аминокислотных последовательностей, имеющих по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, 90%, 95% и 98% идентичности с исходной аминокислотной последовательностью, предпочтительными являются те, которые по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью имеют определенные изменения, в частности делецию, добавление или замену по меньшей мере одной аминокислоты, усечения или удлинения. В случае замены одной или более последовательных или непоследовательных аминокислот(ы), предпочтительными являются такие замены, в которых замененные аминокислоты заменены "эквивалентными" аминокислотами. Выражение "эквивалентные аминокислоты" используется здесь для обозначения любой аминокислоты, которая может быть заменена одной аминокислотой из основной структуры, но без значительного изменения биологической активности соответствующих антител, и таких аминокислот, какие будут определены позже, особенно в примерах. Эти эквивалентные аминокислоты могут быть определены либо на основании их структурной гомологии с аминокислотами, которые они заменяют, либо по результатам сравнительных исследований биологической активности различных антител, на которую они способны.

К примеру, упоминается возможность выполнения замены без глубокого изменения биологической активности соответствующего модифицированного антитела.

В качестве неограничивающего примера следующая таблица 1 показывает замены, возможные с сохранением биологической активности модифицированного антитела. Обратные замены, конечно, также возможны в тех же условиях.

Таблица 1
Исходный остаток	Замена(ы)
Ala (A)	Val, Gly, Pro
Arg (R)	Lys, His
Asn (N)	Gln
Asp (D)	Glu
Cys (C)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (G)	Asp
Gly (G)	Ala
His (H)	Arg
Ile (I)	Leu
Leu (L)	Ile, Val, Met
Lys (K)	Arg
Met (M)	Leu
Phe (F)	Tyr
Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr, Cys
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Phe, Trp
Val (V)	Leu, Ala

Следует понимать здесь, что изобретение не относится к антителам в природной форме, то есть они находятся не в их природной среде, но что они могут быть выделены или получены путем очистки из природных источников, либо получены путем генетической рекомбинации, либо путем химического синтеза, и что они могут содержать неприродные аминокислоты, как будет описано ниже.

Согласно первому подходу, антитело будет определяться по последовательности его тяжелой цепи. В частности, антитело изобретения или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь по меньшей мере с одним CDR, выбранным из CDR, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID №№1-9 и 56-58.

Упомянутыми последовательностями являются следующие:

SEQ ID №1:	GYIFTAYT
SEQ ID №2:	IKPNNGLA
SEQ ID №3:	ARSEITTEFDY
SEQ ID №4:	GYSFTDYT
SEQ ID №5:	INPYNGGT
SEQ ID №6:	AREEITKDFDF
SEQ ID №7:	GYTFTDYN
SEQ ID №8:	INPNNGGT
SEQ ID №9:	ARGRYVGYYYAMDY
SEQ ID №56:	GYTFTSYW
SEQ ID №57:	INPTTGST
SEQ ID №58:	AIGGYGSWFAY

CDR тяжелой цепи могут быть выбраны случайным образом из предыдущих последовательностей, т.е. SEQ ID №№1-9 и 56-58.

В соответствии с предпочтительным аспектом антитело изобретения или один из его функциональных фрагментов или производных содержит тяжелую цепь по меньшей мере с одним CDR, выбранным среди CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где:

- CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №1, 4, 7 или 56,

- CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №2, 5, 8 или 57, и

- CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №3, 6, 9 или 58.

В соответствии с первым воплощением указанного аспекта антитело изобретения или один из его функциональных фрагментов или производных содержит тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №1, CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №2, а CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №3.

В частности, указанное антитело или один из его функциональных фрагментов или производных в соответствии с этим первым воплощением содержит тяжелую цепь с последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID №18.

SEQ ID №18: EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYIFTAYTMHWVRQSLG ESLDWIGGIKPNNGLANYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCARSEITTEFDYWGQGTALTVSS

В соответствии со вторым воплощением указанного аспекта антитело изобретения или один из его функциональных фрагментов или производных содержит тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №4, CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №5, а CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №6.

Антитело или один из его функциональных фрагментов или производных в соответствии с указанным вторым воплощением будет предпочтительно содержать тяжелую цепь с последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID №19.

SEQ ID №19: EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYTLNWVKQSH GKTLEWIGLINPYNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCAREEITKDFDFWGQGTTLTVSS

В соответствии с третьим воплощением указанного аспекта антитело изобретения или один из его функциональных фрагментов или производных содержит тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №7, CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №8, а CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №9.

Антитело или один из его функциональных фрагментов или производных в соответствии с указанным третьим воплощением предпочтительно будет содержать тяжелую цепь с последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID №20.

SEQ ID №20: EVLLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSH GMSLEWIGDINPNNGGTIFNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARGRYVGYYYAMDYWGQGTSVTVSS

В соответствии с четвертым воплощением указанного аспекта антитело изобретения или один из его функциональных фрагментов или производных содержит тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №56, CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №57, а CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №ID №58.

Антитело или один из его функциональных фрагментов или производных в соответствии с указанным четвертым воплощением предпочтительно будет содержать тяжелую цепь с последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID №62.

SEQ ID №62:

QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGYINPTTGSTDYNQKLKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAIGGYGSWFAYWGQGTLVTVSA

Во втором подходе антитело теперь будет определяться по последовательности его легкой цепи. В частности, в соответствии со вторым частным аспектом изобретения антитело или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что содержит легкую цепь по меньшей мере с одним CDR, выбранным из CDR, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID №№10-17 и 59-61.

Упомянутыми последовательностями являются следующие:

SEQ ID №10: ESVDSYANSF

SEQ ID №11: RAS

SEQ ID №12: QQSKEDPLT

SEQ ID №13: ESIDTYGNSF

SEQ ID №14: QQSNEDPFT

SEQ ID №15: ENIYSN

SEQ ID №16: AAT

SEQ ID №17: QHFWGPPYT

SEQ ID №59: SSVSSTY

SEQ ID №60: TTS

SEQ ID №61: HQWSSYPFT

CDR легкой цепи могут быть выбраны случайным образом из предыдущих последовательностей, т.е. SEQ ID №№10-17 и 59-61.

В соответствии с другим предпочтительным аспектом антитело изобретения или один из его функциональных фрагментов или производных содержит легкую цепь по меньшей мере с одним CDR, выбранным среди CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где:

- CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №10, 13, 15 или 59;

- CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №11, 16 или 60; а

- CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №12, 14, 17 или 61.

В соответствии с первым воплощением указанного другого аспекта антитело изобретения или один из его функциональных фрагментов или производных содержит легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №10, CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №11, а CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №12.

В частности, указанное антитело или один из его функциональных фрагментов или производных в соответствии с этим первым воплощением содержит легкую цепь с последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID №21.

SEQ ID №21: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYANSFMHWYQQ KPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSKEDPLTFGSGTKLEMK

В соответствии со вторым воплощением указанного другого аспекта антитело изобретения или один из его функциональных фрагментов или производных содержит легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №13, CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №11, а CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №14.

Антитело или один из его функциональных фрагментов или производных в соответствии с указанным вторым воплощением будет предпочтительно содержать легкую цепь с последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID №22.

SEQ ID №22: GIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRVSESIDTYGNSFIHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDSATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEMK

В соответствии с третьим воплощением указанного другого аспекта антитело изобретения или один из его функциональных фрагментов или производных содержит легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №15, CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №16, а CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №17.

Антитело или один из его функциональных фрагментов или производных в соответствии с указанным третьим воплощением будет предпочтительно содержать легкую цепь с последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID №23.

SEQ ID №23: DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLVDGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGPPYTFGGGTKLEIK

В соответствии с четвертым воплощением указанного другого аспекта антитело изобретения или один из его функциональных фрагментов или производных содержит легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №59, CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №60, а CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №61.

Антитело или один из его функциональных фрагментов или производных в соответствии с указанным четвертым воплощением будет предпочтительно содержать легкую цепь с последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID №63.

SEQ ID №63:

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSTYLYWYQQKPGSSPKLWIYTTSILASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAASYFCHQWSSYPFTFGSGTKLDIK

В соответствии с третьим подходом антитело теперь будет определяться как по последовательности его легкой цепи, так и по последовательности его тяжелой цепи. Антитело изобретения или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что содержит тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №18, 19, 20 или 62 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №21, 22, 23 или 63.

В частности, предпочтительное антитело, названное 224G11, или один из его функциональных фрагментов или производных в соответствии с изобретением содержит тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащие соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID №№1, 2 и 3; а также легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащие соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID №10, 11 и 12.

В другом аспекте антитело 224G11 содержит тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №18 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №21.

Другое предпочтительное антитело, названное 227Н1, или один из его функциональных фрагментов или производных в соответствии с изобретением содержит тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащие соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID №4, 5 и 6; а также легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащие соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID №13, 11 и 14.

В другом аспекте антитело 227Н1 содержит тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №19 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №22.

Еще одно предпочтительное антитело, названное 223С4, или один из его функциональных фрагментов или производных в соответствии с изобретением содержит тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащие соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID №7, 8 и 9; а также легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащие соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID №15, 16 и 17.

В другом аспекте антитело 223С4 содержит тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №20 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №23.

Еще одно предпочтительное антитело, названное 11Е1, или один из его функциональных фрагментов или производных в соответствии с изобретением содержит тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащие соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID №56, 57 и 58; а также легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащие соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID №59, 60 и 61.

В другом аспекте антитело 11Е1 содержит тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №62 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №63.

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к мышиной гибридоме, способной секретировать моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением, особенно к гибридоме мышиного происхождения, такой как депонированная в Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Национальная коллекция культур микроорганизмов) (Институт Пастера, Париж, Франция).

Моноклональные антитела в соответствии с изобретением или один из их функциональных фрагментов или производных, охарактеризованные как такие указанные антитела, секретируемые гибридомой, хранятся в CNCM с 03/14/2007 под номерами CNCM I-3724 (соответствует 11Е1), I-3731 (соответствует 224G11), I-3732 (соответствует 227Н1) и с 07/06/2007 под номером I-3786 (соответствует 223С4). Эти гибридомы являются мышиными гибридомами, полученными в результате клеточного слияния иммунизированных мышиных спленоцитов с миеломной клеточной линией (Sp20 Ад 14).

В следующей таблице 2 объединены элементы, связанные с предпочтительными антителами.

Таблица 2
	224G11 I-3731		227Н1 I-3732		223С4 I-3786		11Е1 I-3724
	Бел к. SEQ ID	Нукл. SEQ ID	Белк. SEQ ID	Нукл. SEQ ID	Белк. SEQ ID	Нукл. SEQ ID	Белк. SEQ ID	Нукл. SEQ ID
CDR-H1	1	24	4	27	7	30	56	64
CDR-H2	2	25	5	28	8	31	57	65
CDR-H3	3	26	6	29	9	32	58	66
тяжелая цепь	18	41	19	42	20	43	62	70
CDR-L1	10	33	13	36	15	38	59	67
CDR-L2	11	34	11	34	16	39	60	68
CDR-L3	12	35	14	37	17	40	61	69
легкая цепь	21	44	22	45	23	46	63	71

Из таблицы 2 совершенно очевидно, что CDR-L2 из антител 227Н1 и 224G11 аналогичны. Этот пример четко поддерживает пункты данной заявки, охватывающие антитела, содержащие по меньшей мере один CDR, случайно выбранны