Высокоаффинные человеческие антитела к pcsk9

Высокоаффинные человеческие антитела к pcsk9

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам человека и антигенсвязывающим фрагментам антител человека, которые специфическим образом связывают человеческую пропротеинконвертазу субтилизин/кексин тип 9 (PCSK9), и к терапевтическим методам применения указанных антител.

Известный уровень техники

Пропротеинконвертаза субтилизин/кексин тип 9 (PCSK9) относится к пропротеинконвертазам, входящим в подсемейство протеиназ К семейства секреторных субтилаз. Кодируемый белок синтезируется в виде растворимого зимогена, который проходит автокаталитическую внутримолекулярную трансформацию в эндоплазматическом ретикулуме. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что PCSK9 повышает ЛНП холестерин в плазме за счет стимулирования распада рецептора ЛНП, который опосредует эндоцитоз ЛНП в печени, являющийся основным каналом клиренса ЛНП из обращения. Структура белка PCSK9 указывает на наличие сигнальной последовательности, за которой идет продомен, каталитический домен, содержащий консервативную триаду остатков (D186, H226 и S386) и С-терминальный домен. Она синтезируется в виде растворимого предшественника 74 кДа, который претерпевает автокаталитический распад в ЭР с образованием продомена 14 кДа и каталитического фрагмента 60 кДа. Была продемонстрирована необходимость наличия автокаталитической активности для секреции. После распада продомен остается жестко связанным с каталитическим доменом.

Антитела к PCSK9 описаны, например, в заявках WO 2008/057457, WO 2008/057458, WO 2008/057459, WO 2008/063382, WO 2008/125623 и патенте US 2008/0008697.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекта изобретения предлагаются полностью человеческие моноклональные антитела (mAb) и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются и нейтрализуют активность человеческой PCSK9 (hPCSK9).

В одном осуществлении настоящее изобретение включает антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфически связывает hPCSK9 и характеризуется по крайней мере одним из следующих признаков:

(i) способностью снижать суммарный сывороточный холестерин не менее чем на 25-35% и поддерживать сниженный уровень в течение не менее чем 24-дневного периода по сравнению с уровнем до введения, предпочтительное снижение суммарного уровня холестерина составляет не менее чем приблизительно 30-40%;

(ii) способностью снижать сывороточный ЛНП холестерин не менее чем на приблизительно 65-80% и поддерживать сниженный уровень в течение не менее чем 24-дневного периода по сравнению с уровнем до введения;

(iii) способностью снизить уровень сывороточных триглицеридов не менее чем на приблизительно 25-40% по сравнению с уровнем до введения;

(iv) не приводит к снижению уровня сывороточного ЛВП холестерина или снижает уровень сывороточного ЛВП холестерина не более чем на 5% по сравнению с уровнем до введения.

В одном осуществлении настоящее изобретение включает антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфически связывает hPCSK9 и характеризуется по крайней мере одним из следующих признаков:

(i) способностью снижать сывороточный ЛНП холестерин не менее чем на приблизительно 40-70% и поддерживать сниженный уровень в течение не менее чем 60-дневного периода по сравнению с уровнем до введения;

(ii) способностью снизить уровень сывороточных триглицеридов не менее чем на приблизительно 25-40% по сравнению с уровнем до введения;

(iii) не приводит к снижению уровня сывороточного ЛВП холестерина или снижает уровень сывороточного ЛВП холестерина не более чем на 5% по сравнению с уровнем до введения.

В одном из осуществлений антитело или его фрагмент характеризуются как связывающие эпитоп, включающий аминокислотный остаток 238 от hPCSK9 (SEQ ID №: 755). В одном из более конкретных осуществлений антитело или его фрагмент связывают эпитоп, включающий один или несколько аминокислотных остатков 238, 153, 159 и 343 от hPCSK9 (SEQ ID №: 755). В более конкретном осуществлении антитело или его фрагмент характеризуются как связывающие эпитоп, не содержащий аминокислотный остаток в положениях 192, 194, 197 и/или 237 последовательности SEQ ID №: 755.

В одном из осуществлений антитело или его фрагмент характеризуются как связывающие эпитоп, включающий аминокислотный остаток 366 от hPCSK9 (SEQ ID №: 755). В одном из более конкретных осуществлений антитело или его фрагмент связывают эпитоп, включающий один или несколько аминокислотных остатков 147, 366 и 380 SEQ ID №: 755. В более конкретном осуществлении антитело или его фрагмент характеризуются как связывающие эпитоп, не содержащий аминокислотный остаток в положениях 215 и/или 238 последовательности SEQ ID №: 755.

В одном осуществлении антитело или его фрагмент характеризуются как проявляющие повышенную аффинность связывания (K_D) для hPCSK9 при pH 5,5 по сравнению с K_D при pH 7,4, как показывают результаты измерения поверхностным плазмонным резонансом. В одном конкретном осуществлении антитело или его фрагмент проявляют не менее чем 20-кратную, не менее чем 40-кратную или не менее чем 50-кратную повышенную аффинность к PCSK9 при кислом pH по сравнению с нейтральным pH, как показывают данные поверхностного плазмонного резонанса.

В одном осуществлении антитело или его фрагмент характеризуются как не проявляющие повышенную аффинность связывания для PCSK9 при кислом pH по сравнению с нейтральным pH, как показывают результаты измерения поверхностным плазмонным резонансом. В одном конкретном осуществлении связывание при кислом рН слабее, а T_1/2 короче, чем при нейтральном pH.

В другом осуществлении антитело или антигенсвязывающий фрагмент связываются с PCSK9 человека, человека с GOF-мутацией D374Y, яванского макака, макаки-резуса, мыши, крысы и хомяка.

В одном осуществлении антитело или антигенсвязывающий фрагмент связываются с PCSK9 человека и обезьяны, но не связывается с PCSK9 мыши, крысы и хомяка.

mAb могут быть полноразмерными (например, антитела IgG1 или IgG4) или включать только антигенсвязывающую часть (например, фрагмент Fab, F(ab')₂ или scFv) и могут быть модифицированы с целью воздействовать на функциональность, например, удалять остаточные эффекторные функции (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).

В одном осуществлении настоящее изобретение включает антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбираемую из группы SEQ ID №: 2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 402, 406, 410, 426, 430, 434, 450, 454, 458, 474, 478, 482, 498, 502, 506, 522, 526, 530, 546, 550, 554, 570, 574, 578, 594, 598, 602, 618, 622, 626, 642, 646, 650, 666, 670, 674, 690, 694, 698, 714, 718, 722, 738 и 742, или ее существенно аналогичную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В одном осуществлении HCVR является аминокислотной последовательностью, выбираемой из группы SEQ ID №: 50, 66, 70, 74, 90, 94, 122, 138, 142, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 314, 330 и 334. В более конкретном осуществлении HCVR содержит SEQ ID №: 90 или 218.

В одном осуществлении антитело или его фрагмент далее содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбираемую из группы SEQ ID №: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380, 384, 394, 404, 408, 418, 428, 432, 442, 452, 456, 466, 476, 480, 490, 500, 504, 514, 524, 528, 538, 548, 552, 562, 572, 576, 586, 596, 600, 610, 620, 624, 634, 644, 648, 658, 668, 672, 682, 692, 696, 706, 716, 720, 730, 740 и 744, или ее существенно аналогичную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В одном осуществлении LCVR является аминокислотной последовательностью, выбираемой из группы SEQ ID №: 58, 68, 72, 82, 92, 96, 130, 140, 144, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 322, 332 и 336. В более конкретном осуществлении LCVR содержит SEQ ID №: 92 или 226.

В конкретных осуществлениях антитело или его фрагмент содержит пару последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), выбираемую из группы, включающей SEQ ID №: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500, 502/504, 506/514, 522/524, 526/528, 530/538, 546/548, 550/552, 554/562, 570/572, 574/576, 578/586, 594/596, 598/600, 602/610, 618/620, 622/624, 626/634, 642/644, 646/648, 650/658, 666/668, 670/672, 674/682, 690/692, 694/696, 698/706, 714/716, 718/720, 722/730, 738/740 и 742/744. В одном осуществлении HCVR и LCVR выбираются из пар аминокислотных последовательностей SEQ ID №: 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 122/130, 138/140, 142/144, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 314/322, 330/332 и 334/336. В более конкретном осуществлении пара HCVR/LCVR содержит SEQ ID №: 90/92 или 218/226.

Во втором аспекте настоящего изобретения приводится антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие домен CDR3 (HCDR3) тяжелой цепи, выбираемый из группы, включающей SEQ ID №: 8, 32, 56, 80, 104, 128, 152, 176, 200, 224, 248, 272, 296, 320, 344, 368, 392, 416, 440, 464, 488, 512, 536, 560, 584, 608, 632, 656, 680, 704 и 728, или его существенно аналогичную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и домен CDR3 (LCDR3) легкой цепи, выбираемый из группы, включающей SEQ ID №: 16, 40, 64, 88, 112, 136, 160, 184, 208, 232, 256, 280, 304, 328, 352, 376, 400, 424, 448, 472, 496, 520, 544, 568, 592, 616, 640, 664, 688, 712 и 736, или его существенно аналогичную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В одном осуществлении пары последовательностей HCVR/LCVR являются SEQ ID №: 56/64, 80/88, 128/136, 224/232, 248/256 или 320/328. В более конкретном осуществлении HCDR3/LCDR3 содержит SEQ ID №: 80/88 или 224/232.

В дальнейшем осуществлении настоящего изобретения приводится антитело или его фрагмент, дополнительно содержащие домен CDR1 (HCDR1) тяжелой цепи, выбираемый из группы, включающей SEQ ID №: 4, 28, 52, 76, 100, 124, 148, 172, 196, 220, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388, 412, 436, 460, 484, 508, 532, 556, 580, 604, 628, 652, 676, 700 и 724, или его существенно аналогичную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; домен CDR2 (HCDR2) тяжелой цепи, выбираемый из группы, включающей SEQ ID №: 6, 30, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 414, 438, 462, 486, 510, 534, 558, 582, 606, 630, 654, 678, 702 и 726, или его существенно аналогичную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; домен CDR1 (HCDR1) легкой цепи, выбираемый из группы, включающей SEQ ID №: 12, 36, 60, 84, 108, 132, 156, 180, 204, 228, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 420, 444, 468, 492, 516, 540, 564, 588, 612, 636, 660, 684, 708 и 732, или его существенно аналогичную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и домен CDR2 (HCDR2) легкой цепи, выбираемый из группы, включающей SEQ ID №: 14, 38, 62, 86, 110, 134, 158, 182, 206, 230, 254, 278, 302, 326, 350, 374, 398, 422, 446, 470, 494, 518, 542, 566, 590, 614, 638, 662, 686, 710 и 734, или его существенно аналогичную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В одном осуществлении последовательностями CDR тяжелой и легкой цепей являются SEQ ID №: 52, 54, 56, 60, 62, 64; 76, 78, 80, 84, 86, 88; 124, 126, 128, 132, 134, 136; 220, 222, 224, 228, 230, 232; 244, 246, 248, 252, 254, 256; и 316, 318, 320, 324, 326, 328. В более конкретных осуществлениях последовательностями CDR тяжелой и легкой цепей являются SEQ ID №: 76, 78, 80, 84, 86, 88; or 220, 222, 224, 228, 230, 232.

В связанном осуществлении настоящего изобретения приводится антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие домен, который специфическим образом связывает hPCSK9, где антитело или его фрагмент содержит домены тяжелой и легкой цепей CDR, находящиеся в парах последовательностей тяжелой и легкой цепей, выбираемых из группы, включающей SEQ ID №: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500, 502/504, 506/514, 522/524, 526/528, 530/538, 546/548, 550/552, 554/562, 570/572, 574/576, 578/586, 594/596, 598/600, 602/610, 618/620, 622/624, 626/634, 642/644, 646/648, 650/658, 666/668, 670/672, 674/682, 690/692, 694/696, 698/706, 714/716, 718/720, 722/730, 738/740 и 742/744. В одном осуществлении последовательности CDR, содержащиеся в HCVR и LCVR, выбираются из пар аминокислотных последовательностей SEQ ID №: 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 122/130, 138/140, 142/144, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 314/322, 330/332 и 334/336. В более конкретных осуществлениях последовательности CDR, содержащиеся в HCVR и LCVR, выбираются из пар аминокислотных последовательностей SEQ ID №: 90/92 или 218/226.

В одном осуществлении настоящего изобретения приводится полное моноклональное антитело человека, или его антиген-связывающий фрагмент, которое специфическим образом связывает и нейтрализует активность hPCSK9, при этом антитело или его фрагмент демонстрирует одну или более из следующих характеристик:

(i) способность снижать суммарный сывороточный холестерин не менее чем на 25-35% и поддерживать сниженный уровень в течение не менее чем 24-дневного периода по сравнению с уровнем до введения, предпочтительное снижение суммарного уровня сывороточного холестерина составляет не менее чем приблизительно 30-40%;

(ii) способность снижать сывороточный ЛНП холестерин не менее чем на приблизительно 65-80% и поддерживать сниженный уровень в течение не менее чем 24-дневного периода по сравнению с уровнем до введения;

(iii) способность снизить уровень сывороточных триглицеридов не менее чем на приблизительно 25-40% по сравнению с уровнем до введения;

(iv) не приводит к снижению уровня сывороточного ЛВП холестерина или снижает уровень сывороточного ЛВП холестерина не более чем на 5% по сравнению с уровнем до введения;

(v) связывает эпитоп, содержащий аминокислотные остатки 238 hPCSK9 (SEQ ID №: 755);

(vi) проявляет повышенную аффинность связывания (K_D) для hPCSK9 при pH 5,5 по сравнению с K_D при pH 7,4, как показывают измерения с помощью поверхностного плазмонного резонанса, причем такая повышенная аффинность представляет собой не менее чем 20-50-кратное повышение аффинности;

(vii) связывает с PCSK9 человека, человека с GOF-мутацией D374Y, яванского макака, макаки-резуса, мыши, крысы и хомяка;

(viii) содержит последовательности CDR3 тяжелой и легкой цепи, содержащие SEQ ID №: 80 и 88;

(ix) содержит последовательности CDR из SEQ ID №: 90 и 92.

В одном осуществлении настоящего изобретения приводится полное моноклональное антитело человека, или его антиген-связывающий фрагмент, которое специфическим образом связывает и нейтрализует активность hPCSK9, при этом антитело или его фрагмент демонстрирует одну или более из следующих характеристик:

(i) способность снижать сывороточный ЛНП холестерин не менее чем на приблизительно 40-70% и поддерживать сниженный уровень в течение не менее чем 60-дневного периода по сравнению с уровнем до введения;

(ii) способность снизить уровень сывороточных триглицеридов не менее чем на приблизительно 25-40% по сравнению с уровнем до введения;

(iii) не приводит к снижению уровня сывороточного ЛВП холестерина или снижает уровень сывороточного ЛВП холестерина не более чем на 5% по сравнению с уровнем до введения;

(iv) связывает эпитоп, содержащий аминокислотные остатки 366 hPCSK9 (SEQ ID №: 755);

(v) не проявляет повышенную аффинность связывания для PCSK9 при кислом pH по сравнению с нейтральным pH, как показывают результаты измерения поверхностного плазмонного резонанса;

(vi) связывает с PCSK9 человека и обезьяны, но не связывает с PCSK9 мыши, крысы и хомяка;

(vii) содержит последовательности CDR3 тяжелой и легкой цепи, содержащие SEQ ID №: 224 и 232; и

(viii) содержит последовательности CDR из SEQ ID №: 218 и 226.

В третьем аспекте настоящего изобретения приводятся молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела анти-PCSK9 или их фрагменты. Настоящее изобретение также охватывает рекомбинантные векторы экспрессии, несущие нуклеиновые кислоты настоящего изобретения, и клетки-хозяева, в которые включаются такие векторы, а также способы получения антител путем культивирования клеток-хозяев в условиях, допускающих продуцирование антител и получение продуцированных антител.

В одном осуществлении настоящего изобретения приводится антитело или его фрагмент, содержащие HCVR, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №: 1, 17, 21, 25, 41, 45, 49, 65, 69, 73, 89, 93, 97, 113, 117, 121, 137, 141, 145, 161, 165, 169, 185, 189, 193, 209, 213, 217, 233, 237, 241, 257, 261, 265, 281, 285, 289, 305, 309, 313, 329, 333, 337, 353, 357, 361, 377, 381, 385, 401, 405, 409, 425, 429, 433, 449, 453, 457, 473, 477, 481, 497, 501, 505, 521, 525, 529, 545, 549, 553, 569, 573, 577, 593, 597, 601, 617, 621, 625, 641, 645, 649, 665, 669, 673, 689, 693, 697, 713, 717, 721, 737 и 741, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В одном осуществлении HCVR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №: 49, 65, 69, 73, 89, 93, 121, 137, 141, 217, 233, 237, 241, 257, 261, 313, 329 и 333. В более конкретных осуществлениях HCVR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №: 89 и 217.

В одном осуществлении антитело или его фрагмент дополнительно содержит LCVR, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №: 99, 19, 23, 33, 43, 47, 57, 67, 71, 81, 91, 95, 105, 115, 119, 129, 139, 143, 153, 163, 167, 177, 187, 191, 201, 211, 215, 225, 235, 239, 249, 259, 263, 273, 283, 287, 297, 307, 311, 321, 331, 335, 345, 355, 359, 369, 379, 383, 393, 403, 407, 417, 427, 431, 441, 451, 455, 465, 475, 479, 489, 499, 503, 513, 523, 527, 537, 547, 551, 561, 571, 575, 585, 595, 599, 609, 619, 623, 633, 643, 647, 657, 667, 671, 681, 691, 695, 705, 715, 719, 729, 739 и 743, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В одном осуществлении LCVR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №: 57, 67, 71, 81, 91, 95, 129, 139, 143, 225, 235, 239, 249, 259, 263, 321, 331 и 335. В более конкретных осуществлениях LCVR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №: 91 и 225.

В одном осуществлении настоящего изобретения приводится антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие домен HCDR3, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №: 7, 31, 55, 79, 103, 127, 151, 175, 199, 223, 247, 271, 295, 319, 343, 367, 391, 415, 439, 463, 487, 511, 535, 559, 583, 607, 631, 655, 679, 703 и 727, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и домен LCDR3, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №: 15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231, 255, 279, 303, 327, 351, 375, 399, 423, 447, 471, 495, 519, 543, 567, 591, 615, 639, 663, 687, 711 и 735, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В одном осуществлении последовательности HCDR3 и LCDR3 кодируются последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID №: 55/63, 79/87, 127/135, 223/231, 247/255 и 319/327 соответственно. В более конкретных осуществлениях пара последовательностей HCDR3 и LCDR3 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID №: 79/87 и 223/231.

В еще одном осуществлении антитело или его фрагмент дополнительно содержит домен HCDR1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №: 3, 27, 51, 75, 99, 123, 147, 171, 195, 219, 243, 267, 291, 315, 339, 363, 387, 411, 435, 459, 483, 507, 531, 555, 579, 603, 627, 651, 675, 699 и 723, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; домен HCDR2, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №: 5, 29, 53, 77, 101, 125, 149, 173, 197, 221, 245, 269, 293, 317, 341, 365, 389, 413, 437, 461, 485, 509, 533, 557, 581, 605, 629, 653, 677, 701 и 725, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; домен LCDR1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №: 11, 35, 59, 83, 107, 131, 155, 179, 203, 227, 251, 275, 299, 323, 347, 371, 395, 419, 443, 467, 491, 515, 539, 563, 587, 611, 635, 659, 683, 707 и 731, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; домен LCDR2, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №: 13, 37, 61, 85, 109, 133, 157, 181, 205, 229, 253, 277, 301, 325, 349, 373, 397, 421, 445, 469, 493, 517, 541, 565, 589, 613, 637, 661, 685, 709 и 733, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В одном осуществлении последовательности CDR тяжелой и легкой цепей кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID №: 51, 53, 55, 59, 61, 63; 75, 77, 79, 83, 85, 87; 123, 125, 127, 131, 133, 135; 219, 221, 223, 227, 229, 231; 243, 245, 247, 251, 253, 255; и 315, 317, 319, 323, 325, 327. В более конкретных осуществлениях последовательности CDR тяжелой и легкой цепей кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID №: 75, 77, 79, 83, 85, 87; и 219, 221, 223, 227, 229, 231.

В четвертом аспекте настоящего изобретения приводится изолированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфическим образом связывают hPCSK9, содержащий HCDR3 и LCDR3, где HCDR3 содержит аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹-X¹²-X¹³-X¹⁴-X¹⁵-X¹⁶-X¹⁷-X¹⁸-X¹⁹-X²⁰ (SEQ ID №: 747), где X¹ - Ala, X² - Arg или Lys, X³ - Asp, X⁴ - Ser или Ile, X⁵ - Asn или Val, X⁶ - Leu или Trp, X⁷ - Gly или Met, X⁸ - Asn или Val, X⁹ - Phe или Tyr, X¹⁰ - Asp, X¹¹ - Leu или Met, X¹² - Asp или отсутствует, X¹³ - Tyr или отсутствует, X¹⁴ - Tyr или отсутствует, X¹⁵ - Tyr или отсутствует, X¹⁶ - Tyr или отсутствует, X¹⁷ - Gly или отсутствует, X¹⁸ - Met или отсутствует, X¹⁹ - Asp или отсутствует и X²⁰ - Val или отсутствует; и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹ (SEQ ID №: 750), где X¹ - Gln или Met, X² - Gln, X³ - Tyr или Thr, X⁴ - Tyr или Leu, X⁵ - Thr или Gln, X⁶ - Thr, X⁷ - Pro, X⁸ - Tyr или Leu и X⁹ - Thr.

В еще одном осуществлении антитело или его фрагмент дополнительно содержит последовательность HCDR1 формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸ (SEQ ID №: 745), где X¹ - Gly, X² - Phe, X³ - Thr, X⁴ - Phe, X⁵ - Ser или Asn, X⁶ - Ser или Asn, X⁷ - Tyr или H- и X⁸ - Ala или Trp; последовательность HCDR2 формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸ (SEQ ID №: 746), где X¹ - Ile, X² - Ser или Asn, X³ - Gly или Gln, X⁴ - Asp или Ser, X⁵ - Gly, X⁶ - Ser или Gly, X⁷ - Thr или Glu и X⁸ - Thr или Lys; последовательность LCDR1 формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X^6-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹-X¹² (SEQ ID №: 748), где X¹ - Gln, X² - Ser, X³ - Val или Leu, X⁴ - Leu, X⁵ - H- или Tyr, X⁶ - Arg или Ser, X⁷ - Ser или Asn, X⁸ - Asn или Gly, X⁹ - Asn, X¹⁰ - Arg или Asn, X¹¹ - Asn или Tyr и X¹² - Phe или отсутствует; последовательность LCDR2 формулы X¹-X²-X³ (SEQ ID №: 749), где X¹ - Trp или Leu, X² - Ala или Gly и X³ - Ser. На фиг.1 приводится совмещение последовательностей вариабельных участков тяжелой и легкой цепи для 316P и 300N mAb.

В пятом аспекте настоящего изобретения приводится антитело анти-PCSK9 человека или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), кодируемую сегментами нуклеотидной последовательности, полученными из последовательностей зародышевых линий V_H, D_H и J_H, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), кодируемую сегментами нуклеотидной последовательности, полученными из последовательностей зародышевых линий V_K и J_K, где зародышевыми линиями являются генный сегмент V_H 3-23, генный сегмент D_H 7-27, генный сегмент J_H 2, генный сегмент V_K 4-1 и генный сегмент J_K 2; или (b) генный сегмент V_H 3-7, генный сегмент D_H 2-8, генный сегмент J_H 6, генный сегмент V_K 2-28 и генный сегмент J_K 4.

В шестом аспекте настоящего изобретения приводится антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с белком PCSK9 SEQ ID №: 755, где связывание антитела или его фрагмента с вариантом белка PCSK9 составляет меньше 50% связи между антителом или его фрагментом с белком PCSK9 SEQ ID №: 755. В конкретном осуществлении антитело или его фрагмент связываются с вариантом белка PCSK9, имеющим аффинность связывания (K_D) менее 50%, менее 60%, менее 70%, менее 80%, менее 90% или менее 95%, по сравнению со связыванием с PCSK9 (SEQ ID №: 755).

В одном осуществлении вариант белка PCSK9 содержит не менее одной мутации в позиции 238 SEQ ID №: 755. В более конкретном осуществлении мутацией является D238R. В одном осуществлении аффинность связывания антитела или фрагмента антитела для варианта белка PCSK9 не менее чем на 90% меньше по сравнению с нативным белком SEQ ID №: 755, где вариант белка содержит мутацию в остатке 238. В одном осуществлении аффинность связывания антитела или фрагмента антитела для варианта белка PCSK9 не менее чем на 80% меньше по сравнению с нативным белком последовательности SEQ ID №: 755, где вариант белка содержит мутацию одного или более остатков 153, 159, 238 и 343. В более конкретном осуществлении мутацией является один из S153R, E159R, D238R и D343R.

В одном осуществлении вариант белка PCSK9 содержит не менее одной мутации в позиции 366 SEQ ID №: 755. В более конкретном осуществлении мутацией является E366K. В одном осуществлении аффинность связывания антитела или фрагмента антитела для варианта белка PCSK9 не менее чем на 95% меньше по сравнению с нативным белком последовательности SEQ ID №: 755, где вариант белка содержит мутацию в остатке 366. В одном осуществлении аффинность связывания антитела или фрагмента антитела для варианта белка PCSK9 не менее чем на 70%, 80% или 90% меньше по сравнению с нативным белком последовательности SEQ ID №: 755, где вариант белка содержит мутацию одного или более остатков 147, 366 и/или 380. В более конкретном осуществлении мутацией является один из S147F, E366K и V380M.

Настоящее изобретение включает антитела анти-PCSK9 с модифицированной структурой гликозилирования. В некоторых приложениях может оказаться полезным удалить нежелательные сайты гликозилирования, например, удалить фукозный фрагмент для усиления функции антителозависимой клеточно-обусловленной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В других приложениях может осуществляться модификация галактозилирования, с тем чтобы изменить комплементзависимую цитотоксичность (CDC).

В седьмом аспекте настоящего изобретения приводится фармацевтический состав, включающий рекомбинантное антитело человека или его фрагмент, которое специфически связывает hPCSK9 и фармацевтически приемлемый носитель. В одном осуществлении настоящего изобретения приводится состав, представляющий собой сочетание антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела настоящего изобретения, и второй терапевтический агент. Вторым терапевтическим агентом может быть любой агент, который с положительным эффектом сочетается с антителом или его фрагментом настоящего изобретения, например, агент, который в состоянии вызвать нарушение синтеза холестерина на клеточном уровне посредством ингибирования 3-гидрокси-3-метилглутарил (HMG)-коэнзим A (CoA) редуктазы, например, из числа таких, как церивастатин, аторвастатин, симвастатин, питавастатин, розувастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин и пр.; который в состоянии ингибировать захват холестерина и/или реабсорбции желчных кислот; в состоянии повышать катаболизм липопротеинов (например, ниацина); и/или активаторы фактора транскрипции LXR, который играет роль в удалении холестерина, например, 22-гидроксихолестерина.

В восьмом аспекте настоящего изобретения приводятся способы ингибирования активности hPCSK9 с помощью антитела анти-PCSK9 или антиген-связывающей области антитела настоящего изобретения, где терапевтические методы предусматривают введение терапевтически эффективного количества фармацевтического состава, содержащего антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела настоящего изобретения. Подлежащим лечению нарушением является любое заболевание или состояние, которое улучшается, облегчается, подавляется или предупреждается за счет устранения, ингибирования или снижения активности PCSK9. Конкретные группы населения, которые могут проходить лечение с использованием терапевтических методов настоящего изобретения, включают пациентов, которым показан аферез ЛНП, пациентов с мутациями, активирующими PCSK9 (мутаций с усилением функций, в дальнейшем «GOF»), пациентов с гетерозиготной наследственной гиперхолестеринемией (heFH); пациентов с первичной гиперхолестеринемией, которые не переносят статины или неконтролируемы статинами; а также пациенты с риском развития гиперхолестеринемии, которые могут получать профилактическое лечение. К другим показаниям относятся дислипидемия, связанная с вторичными причинами, например, сахарный диабет II-го типа, холестатические заболевания печени (первичный билиарный цирроз), нефротический синдром, гипотироидизм, ожирение; а также профилактика и лечение атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний.

В конкретных осуществлениях способа настоящего изобретения анти-hPCSK9 антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения используются для снижения повышенного уровня общего холестерина, не-ЛВП холестерина, ЛНП холестерина и/или аполипопротеина B (аполипопротеина B100).

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент настоящего изобретения могут использоваться индивидуально или в сочетании со вторым агентом, например, ингибитором HMG-CoA редуктаз и/или другими лекарствами, снижающими уровень липидов.

Дополнительные осуществления предусматривают использование описанного выше антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела для смягчения или ингибирования заболевания или состояния, опосредованного PCSK9.

Настоящее изобретение предусматривает использование антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела в соответствии с приведенным выше описанием при производстве лекарственных препаратов, применяемых для смягчения или ингибирования заболевания или состояния, опосредованного PCSK9. В конкретных осуществлениях, при которых опосредованным PCSK9 заболеванием или состоянием является гиперхолестеринемия, гиперлипидемия, аферез ЛВП, гетерозиготная наследственная гиперхолестеринемия, непереносимость статинов, неконтролируемость статинами, риск развития гиперхолестеринемии, дислипидемия, холестатические заболевания печени, нефротический синдром, гипотироидизм, ожирение, атеросклероз и сердечно-сосудистые заболевания.

Другие осуществления станут очевидными при ознакомлении с приведенным ниже подробным описанием.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1. Таблицы сравнения последовательностей вариабельных участков тяжелой цепи (A) и легкой цепи (B) и CDR антител H1H316P и H1M300N.

Фиг.2. Концентрация антител в сыворотке во времени. 316P 5 мг/кг (□); 300N 5 мг/кг (σ); 316P 15 мг/кг (ν); 300N 15 мг/кг (●).

Фиг.3. Уровень общего сывороточного холестерина в процентах изменения по сравнению с контролем по буферу. Контроль (Т); 316P 5 мг/кг (ν); 300N 5 мг/кг (σ); 316P 15 мг/кг (□); 300N 15 мг/кг (Δ).

Фиг.4. Уровень сывороточного ЛНП холестерина в процентах изменения по сравнению с контролем по буферу. Контроль (Т); 316P 5 мг/кг (ν); 300N 5 мг/кг (σ); 316P 15 мг/кг (□); 300N 15 мг/кг (Δ).

Фиг.5. Уровень сывороточного ЛНП холестерина, нормализованный по контрольному буферу. Контроль по буферу (Т); 316P 5 мг/кг (ν); 300N 5 мг/кг (σ); 316P 15 мг/кг (□); 300N 15 мг/кг (Δ).

Фиг.6. Уровень сывороточного ЛВП холестерина в процентах изменения по сравнению с контролем по буферу. Контроль (Т); 316P 5 мг/кг (ν); 300N 5 мг/кг (σ); 316P 15 мг/кг (□); 300N 15 мг/кг (Δ).

Фиг.7. Уровень сывороточного триглицерида в процентах изменения по сравнению с контролем по буферу. Контроль по буферу (Т); 316P 5 мг/кг (ν); 300N 5 мг/кг (σ); 316P 15 мг/кг (□); 300N 15 мг/кг (Δ).

Фиг.8. Уровень сывороточного ЛНП холестерина в процентах изменения по сравнению с исходным после разового подкожного введения. 316P 5 мг/кг (ν); 300N 5 мг/кг (●).

Фиг.9. Концентрация антител в сыворотке во времени после разового подкожного введения. 316P 5 мг/кг (●); 300N 5 мг/кг (σ).

Фиг.10. Вестерн-блот для рецептора ЛНП мышей в суммарных гомогенатах печени. Образцы были взяты через 24 часа после введения ФСБ (полоски 1-3), 5 мг/кг 316P (полоски 4-6) или 5 мг/кг неспецифических hPCSK9 mAb (полоски 7-8) и 4 часа после введения 1,2 мг/кг hPCSK9-mmh (все полоски).

Фиг.11. Воздействие 316P на уровень сывороточного ЛНП холестерина у мышей PCSK9 ^hu/hu. Контроль по буферу ( ( ); 316P 1 мг/кг (); 316P 5 мг/кг (); 316P 10 мг/кг ().

Фиг.12. Сывороточный фармакокинетический профиль анти-hPCSK9 mAb у мышей C57BL/6. Разовая доза контроля I mAb (λ) при 10 мг/кг; 316P (σ) при 10 мг/кг и 300N (ν) при 10 мг/кг.

Фиг.13. Сывороточный фармакокинетический профиль анти-hPCSK9 mAb у гетерозиготных мышей hPCSK9. Разовая доза 10 мг/кг: Контроль I mAb (λ); 316P (σ) и 300N (ν).

Фиг.14. Воздействие 316P на уровень сывороточного ЛНП холестерина у сирийских хомяков, получавших нормальное питание. Контроль по буферу (●); 316P 1 мг/кг (ν); 316P 3 мг/кг (σ); 316P 5 мг/кг (τ).

ПОЛНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Прежде чем приступить к описанию представляемого способа, необходимо отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами и изложенными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут меняться. Следует также понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена исключительно для описания конкретных осуществлений и не носит ограничительного характера, поскольку охват настоящего изобретения ограничивается только прилагаемой формулой изобретения.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, которое общеизвестно рядовым специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя на практике или при проверке настоящего изобретения могут использоваться любые способы и материалы, аналогичные или идентичные описанным в настоящем документе способам и материалам, ниже приводится описание предпочтительных способов и материалов.

Определения

Термин «человеческая пропротеинконвертаза субтилизин/кексин тип 9», или «hPCSK9», используемый в настоящем документе, означает hPCSK9 с последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 754, и аминокислотную последовательность SEQ ID №: 755, или его биологически активный фрагмент.

Используемый в настоящем документе термин «антитело» предназначен для обозначения молекул иммуноглобулина, составленных из четырех полипептидных цепей, при этом две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи связываются друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи («HCVR», или «VH») и константную область тяжелой цепи (содержащую домены CH1, CH2 and CH3). Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи («LCVR», или «VL») и константную область легкой цепи. Области VH и VL могут подразделяться на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающимися с областями с более высоким уровнем консервативности, называемые остовными областями (FR). Каждая область VH и VL образована тремя CDR и четырьмя FR, расположенными от амино-терминального конца к карбокси-терминальному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Также возможно замещение одного или нескольких остатков CDR или пропуск одной или нескольких CDR. В научной литературе описаны антитела, в которых для связывания можно обойтись без одной или двух CDR. В работе Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) анализировались контактные области между антителами и их антигенами на основании опубликованных кристаллических структур, и был сделан вывод о том, что только примерно треть остатков CDR на самом деле вступает в контакт с антигеном. В этой работе также обнаружено множество антител, в которых одна или две CDR не содержат аминокислот, контактирующих с антигеном (см. также, Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).

Остатки CDR, не контактирующие с антигеном, можно определить на основании предыдущих исследований (например, остатки H60-H65 в CDRH2 часто не требуются), по областям CDR Кабата, лежащих вне CDR Чотиа, с помощью молекулярного моделирования и/или эмпирическим путем. Если CDR или его остатки пропущены, они обычно замещаются аминокислотами, занимающими аналогичное положение в другой последовательности человеческого антитела, или консенсусе таких последовательностей. Положения для замещения CDR и аминокислотами могут также выбираться эмпирически. Эмпирические замещения могут быть консервативными или неконсервативными.

Используемый в настоящем документе термин «антитело человека» предназначен для обозначения антител с вариабельной и константной областями, полученных из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевых линий человека. Описыв