Питательная среда для микроразмножения кальцефильных растений в культуре in vitro

Питательная среда для микроразмножения кальцефильных растений в культуре in vitro

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии растений и может быть использовано для воспроизводства редких и исчезающих видов растений в целях сохранения биологического разнообразия, в частности, при клональном микроразмножении некоторых кальцефильных видов растений: Centaurea ruthenica Lam., Globularia punctata Lapeyr., Hyssopus cretaceous Dubjan., Potentilla volgarica Juz., Scrophularia sareptana Kleop.Ex Ivanina, Silene cretacea Fisch. ex Spreng., Silene hellmannii Claus.

Известно, что основой клонального микроразмножения растений является подбор питательных сред и оптимальных условий культивирования in vitro для получения достаточного количества жизнеспособных регенерантов. Наиболее предпочтительными объектами для клонального размножения редких и исчезающих видов растений являются апексы и пазушные почки стебля, так как они более устойчивы к генетическим изменениям, чем дифференцированные ткани, способные образовывать адвентивные почки (Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. - М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с). Для снятия апикального доминирования и активации пазушных меристем в питательную среду, как правило, вносят регуляторы роста. Из цитокининов наиболее часто используют 6-бензиламинопурин (БАП), кинетин, зеатин и тидиазурон, из ауксинов - 3-индолил уксусную (ИУК), 3-индолил масляную (ИМК) и α-нафтил уксусную (НУК) кислоты (CN 101869064, RU 2169769, CN 102860258, CN 102577944, RU2457669, CN 101530063, CN 1631105 и др.). Для каждого нового объекта соотношение регуляторов роста подбирают индивидуально в зависимости от его биологических особенностей, однако данных по клональному микроразмножению Centaurea ruthenica, Globularia punctata, Hyssopus cretaceous,Scrophularia sareptana, Silene hellmannii в литературе не представлено. Известно, что совместное присутствие цитокининов и ауксинов в питательной среде в ряде случаев оказывает положительный эффект на регенерацию микропобегов (CN 101869064, RU 2169769, CN 102860258, CN 102577944, CN 101530063, CN 1631105). В качестве дополнительного регулятора роста иногда вводят гибберелловую кислоту (ГК) (CN 101530063, SU 1720595A1). Известно, что внесение в питательную среду нескольких цитокининов одновременно способствует повышению качества и количества регенерировавших побегов для некоторых культур (CN 101530063, Gabryszewska Е. The influence of cytokinins, thidiazuron, paclobutrazol and red light on shoot proliferation of herbaceous peony cv. Jadwiga in vitro. // J. Fruit Ornam. Plant Res., 1998. - Vol. 6. - P.157-169; Yu X.N., Wu H.J., Teixeira da Silva J.A., Shen M.M.Multiple shoot induction and rooting of Paeonia lactiflora'Da Fu Gui' //African Journal of Biotechnology, 2012. - Vol.11(41). - Р. 9776-9781). Однако совместное использование БАП и кинетина не дает существенного эффекта при клональном микроразмножении исследуемых объектов, БАП+зеатин - приводит к появлению генеративных структур у некоторых объектов через 3-4 пассажа (P. volgarica). Повышение концентрации БАП в питательной среде приводит к оводнению микропобегов, увеличение концентрации кинетина и зеатина - к вытягиванию междоузлий и хрупкости материала. Известна питательная среда для активации пазушных меристем Silene cretacea, имеющая в основе минеральный состав по прописи Мурасиге и Скуга (МС) (Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures //Physiol. Plant, 1962. Vol.15. №13. P. 473-497) и включающая 0.5 мг/л БАП (Жолобова О.О. Сохранение редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro и оценка уровня их внутривидового полиморфизма: Автореф. дис. канд. биол. наук. Белгород: Изд-во БелГУ, 2012. 23 с.). Недостатком данной питательной среды является то, что коэффициент размножения при культивировании на ней резко снижается уже на втором пассаже (с 13.50±1.85 до 3.45±1.30 микропобегов на эксплант), а после шестого - культура полностью выпадает.

Известна питательная среда Woody Plant Medium (WPM) (LloudG., McCown B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture //Proc. Int. Plant Prop. Soc., 1980. Vol.30. P. 420-427). Известная среда, дополненная БАП 0.5 мг/л, характеризовалась увеличенным коэффициентом размножения до 7.25±3.05 микропобегов на эксплант для Silene cretacea. Однако недостатками использования БАП в качестве единственного источника цитокининов являлись образование большого количества каллуса и появление стрессовой антоциановой окраски.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является питательная среда для микроразмножения растений в культуре in vitro, содержащая минеральный состав, витамины и аминокислоты по прописи Мурасиге и Скуга (МС) в качестве основы, а также регуляторы роста - сочетание фитогормонов БАП 1 мг/л, ГК 0.5 мг/л и ИУК 0.1 мг/л (Wu H.J., Yu X.N., Teixeira da Silva J.A., Lu G.P. Direct shoot induction of Paeonia lactiflora «Zhong Sheng Fen» and rejuvenation of hyperhydric shoots //N. Zealand J. Crop. Hort. Sci., 2011. - Vol.1. - Р. 1-8). Однако использование этого сочетания и минерального состава применительно к клональному микроразмножению некоторых кальцефильных видов растений приводит к оводнению растительного материала и невозможности дальнейшей работы с ним из-за высокой концентрации БАП и неподходящего состава солей.

Технический результат заключается в увеличении коэффициента размножения Centaurea ruthenica, Globularia punctata, Hyssopus cretaceous, Potentilla volgarica, Scrophularia sareptana, Silene cretacea, Silene hellmannii посредством активации пазушных меристем без ущерба качеству регенерантов.

Указанный технический результат достигается тем, что питательная среда для микроразмножения растений в культуре in vitro, включающая витамины и аминокислоты по прописи МС, сахарозу, агар-агар, дистиллированную воду, а также регуляторы роста БАП, ГК и ИУК в качестве добавок, согласно заявляемому решению содержит минеральный состав WPM, кинетин, при этом регуляторы роста взяты в следующей концентрации, мг/л: БАП - 0.1-0.3, кинетин - 0.9-1.1, ГК - 0.9-1.1, ИУК - 0.4-0.6.

Заявляемая питательная среда содержит известный минеральный состав WPM, включающий в себя следующие компоненты (мг/л): NH₄NO₃ - 400, KH₂PO₄ - 170, MgSO₄×7H₂O - 370, CaCl₂×2H₂O - 96, Ca(NO₃)₂×4H₂O - 799.5, K₂SO₄ - 990, H₃BO₃ - 6.2, MnSO₄×4H₂O - 22.3, KJ - 0.75, CuSO₄×5H₂O - 0.25, Na₂MoO₄×2H₂O - 0.25, ZnSO₄×4H₂O - 8.6, FeSO₄×7H₂O - 27.8, Na₂EDTA×2H₂O - 37.3. Состав содержит витамины и аминокислоты по прописи МС (мг/л): мезоинозит - 100, глицин - 2.0, тиамин-HCl - 0.5, пиридоксин-HCl - 0.5, никотиновую кислоту - 0.5. Питательная среда содержит также сахарозу - 20 000, агар-агар - 8 000. Указанные компоненты растворены в дистиллированной воде. Указанный технический результат достигается внесением в заявляемую питательную среду следующего сочетания регуляторов роста: БАП - 0.1-0.3 мг/л, кинетин - 0.9-1.1 мг/л, ГК - 0.9-1.1 мг/л, ИУК - 0.4-0.6 мг/л. Полученная питательная среда условно обозначена авторами «SCS» («Silene cretacea Saratov»).

Апробирование питательных сред с различными комбинациями регуляторов роста на редких и исчезающих видах растений, в частности, некоторых кальцефильных видах растений (Centaurea ruthenica Lam., Globularia punctata Lapeyr., Hyssopus cretaceous Dubjan., Potentilla volgarica Juz., Scrophularia sareptana Kleop.Ex Ivanina, Silene cretacea Fisch.ex Spreng., Silene hellmannii Claus), привело к следующим результатам (табл.1).

Таблица 1 - Влияние различных регуляторов роста и их сочетаний на коэффициент размножения Silene cretacea (длительность одного пассажа - 21 сутки)

Регулятор роста, мг/л	Кол-во регенери-ровавших микропобегов/эксплант, шт.	Общее состояние эксплантов
Контроль (б/г)	2.50±0.64	Все экспланты нормальные, зеленого цвета, каллус отсутствует, есть корни
БАП 0.5	7.25±3.05	Разрастание каллусной ткани, на ней - побеги с антоциановой окраской или фрагменты корней с корневыми волосками
Кинетин 0.5	-	Гибель (выпад) всех эксплантов
Зеатин 0.5	2.67±1.80	Разрастание каллусной ткани, на ней - единичные побеги зеленого цвета с недоразвитыми (сильно укороченными) листьями
2-ip 0.5	0.86±0.56	Разрастание каллусной ткани, на ней - единичные побеги зеленого цвета с недоразвитыми (сильно укороченными) листьями
БАП 0.2+Кин. 1.0	4.28±2.08	Все экспланты нормальные, прочные, зеленого цвета, каллус практически отсутствует
БАП 0.2+ГК 1.0	9.00±2.07	Все экспланты вытянутые, тонкие, зеленого цвета, междоузлия удлинены, каллус практически отсутствует
БАП 0.2+ИУК 0.5	4.25±1.15	Разрастание каллусной ткани, на ней - укороченные побеги зеленого цвета или фрагменты корней с корневыми волосками
Кин. 1.0+ГК 1.0	5.00±1.05	Все экспланты вытянутые, тонкие и хрупкие, зеленого цвета, каллус практически отсутствует
Кин. 1.0+ИУК 0.5	3.57±1.34	Разрастание каллусной ткани, на ней - укороченные побеги зеленого цвета или фрагменты корней с корневыми волосками
БАП 0.2+Кин. 1.0+ГК 1.0	8.14±2.47	Все экспланты вытянутые, тонкие и хрупкие, зеленого цвета, каллус практически отсутствует
Кин. 1.0+ГК 1.0+ИУК 0.5	4.62±1.57	Разрастание каллусной ткани, на ней - тонкие и хрупкие побеги зеленого цвета
БАП 0.2+ГК 1.0+ИУК 0.5	7.00±2.22	Все экспланты вытянутые, тонкие и хрупкие, зеленого цвета, много каллуса
БАП 0.2+Кин. 1.0+ГК 1.0+ИУК 0.5(SCS)	9.37±1.22	Все экспланты нормальные, прочные, зеленого цвета, каллус присутствует только в основании побегов

Внесение данного сочетания способствует интенсивному формированию микропобегов (табл.2), легко отделяющихся друг от друга и способных сразу переходить к этапу укоренения без дополнительной стадии элонгации.

Таблица 2 - Коэффициенты размножения исследуемых объектов, полученные на питательной среде SCS (подсчет микропобегов осуществляли на 21-40 сутки культивирования в зависимости от скорости морфогенеза объекта).

Культура	Кол-во регенерировавших микропобегов/эксплант, шт.
Centaurea ruthenica	9.75±1.87
Globularia punctata	4.20±1.48
Hyssopus cretaceous	7.60±0.89
Potentilla volgarica	9.42±3.19
Scrophularia sareptana	19.50±2.71
Silene cretacea	9.37±1.22
Silene hellmannii	13.85±0.17

Заявляемое изобретение «Silene cretacea Saratov» («SCS») позволяет улучшить качество и количество микропобегов.

Питательная среда для микроразмножения кальцефильных растений в культуре in vitro, включающая растворенные в дистиллированной воде витамины и аминокислоты по прописи Мурасиге и Скугу, сахарозу в количестве 20000 мг/л, агар-агар в количестве 8000 мг/л, а также регуляторы роста 6-бензиламинопурин, гибберелловую кислоту и 3-индолил уксусную кислоту, отличающаяся тем, что содержит минеральный состав Woody Plant Medium, кинетин, при этом регуляторы роста взяты в следующей концентрации, мг/л:

6-бензиламинопурин	0.1-0.3
кинетин	0.9-1.1
гибберелловая кислота	0.9-1.1
3-индолил уксусная кислота	0.4-0.6