Сульфатированные гиалуроновые кислоты в качестве регуляторов цитокиновой активности

Сульфатированные гиалуроновые кислоты в качестве регуляторов цитокиновой активности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

На протяжении многих лет в научной/патентной литературе анализируется и описывается сульфатированная гиалуроновая кислота, которая получена изначально из гиалуроновой кислоты (HA), соответствующим образом сульфатированной, согласно описанию в предшествующем уровне техники (EP0940410B1 и EP0702699B1), которой приписывают антикоагулянтное действие. HAS также можно получить в результате деацетилирования и последующего сульфатирования глюкозамина НА (определяемая как HA-NS) (EP0971961B1), для производства хирургических инструментов и материалов и фармацевтических композиций. Также известны патенты на изобретения EP0754460B1 и EP1385492B1, в которых описано применение HAS при таких патологиях, как, например, ARDS (острый респираторный дистресс-синдром), суставной ревматизм, ревматоидный артрит и дерматит.

Настоящее изобретение относится к новому и неожиданному применению HAS в качестве регулятора цитокиновой активности, поскольку авторы обнаружили исключительную способность HAS модулировать активность определенных цитокинов (как про-, так и противовоспалительных), изучали механизм действия и выявили существенное различие между двумя типами сульфатированного продукта (HAS и HA-NS), но самое главное, авторы данного изобретения неожиданно обнаружили непредвиденно высокую активность против различных типов и штаммов вируса герпеса, ВИЧ, цитомегаловируса и вируса везикулярного стоматита.

Начиная с 1970-х, ученые поняли, что селектированные популяции лимфоидных клеток могут продуцировать и высвобождать в кровеносное русло молекулы белковой природы, не ассимилируемые антителами, определенные термином «цитокины». Они представляют собой новый тип «гормонов», способный действовать на различные клеточные мишени в различных частях организма.

Прогресс в научных познаниях, относящихся к синтезу и биологическим/биохимическим функциям этих белков, изменил «старое» представление об иммунной системе (ИС) в том же научном мире и открыл новые горизонты для понимания ее многочисленных функций, тем самым создавая новые перспективы для лечения различных патологических процессов, местного и/или системного, в том числе новые терапевтические возможности, относящиеся к иммунотерапии рака.

Главными клетками ИС являются лимфоциты, они представляют собой приблизительно 20% белых клеток крови и, с учетом их различных функций, образуют 3 группы: В-лимфоциты, Т-лимфоциты и лимфоциты-киллеры. Многие цитокины представляют собой растворимые белки, продуцируемые лимфоцитами и/или моноцитами, способные действовать против других клеток/тканей, даже расположенных очень далеко от места их выработки. Они, фактически, обладают иммунологическими функциями, а также регуляторными функциями в синтезе других цитокинов различными клетками ИС, или клеток-мишеней, вовлеченных в каскад реакций, запущенный ИС.

До настоящего времени был изучен целый ряд различных цитокинов, также имеющих целый ряд различных аббревиатур, но заявитель данного изобретения изучал, в частности, следующие: Интерлейкин 1 и 2, Интерлейкин 6, 7 и 12, далее обозначаемые как IL-1, IL-2, IL-6, IL-7 и IL-12, которые, с TNF, определяются как цитокины провоспалительной природы, в то время как Интерлейкин 10 (IL-10), наоборот, представляет собой цитокин с сильными противовоспалительными свойствами.

Первым цитокином для изучения был, несомненно, IL-1, представленный двумя формами α и β, мощный индуктор воспалительного процесса, как местного, так и системного. Он, главным образом, продуцируется лимфоцитами В, Т и макрофагами в ответ на бактериальный возбудитель или стимуляцию со стороны других агентов, в том числе других цитокинов; он также секретируется альвеолярными, перитонеальными макрофагами, клетками Купфера, нейтрофилами периферической крови, эндотелиальными, эпителиальными и гладкомышечными клетками, фибробластами, клетками Лангерганса в коже, остеокластами, синовиоцитами и клетками многих других типов. Он также присутствует в цереброспинальной жидкости, где он и секретируется, и транспортируется. Обе формы связываются с одним и тем же рецептором и имеют очень похожие, если не идентичные, биологические активности. Множество из их провоспалительных функций связаны со стимулированием другими цитокинами, такими как IL-6 и IL-8, и сам их синтез может быть индуцирован цитокинами такими, как TNF, Интерферон, бактериальными эндотоксинами, вирусами и различными видами других агентов. Он вовлечен в процесс септического шока, и также следует упомянуть, что недавние исследования продемонстрировали, что IL-1 способен активировать экспрессию некоторых онкогенов и, таким образом, принимает участие в патогенезе новообразований. Более того, для этого цитокина была предложена аутокринная система контроля роста бластных клеток белого ростка, которые присутствуют в кровеносном русле пациентов с лейкемией: эти бластные клетки фактически неконтролируемо продуцируют IL-1, который, в свою очередь, стимулирует синтез тех факторов роста, которые усиливают пролиферацию тех же самых бластных клеток. В сочетании с другими цитокинами, IL-1, таким образом, представляет собой один из главных медиаторов воспалительного процесса: он, по существу, стимулирует Т-клетки к выработке IL-2, и В-клетки - к выработке иммуноглобулинов. Таким образом, он вовлечен в целый ряд патологических процессов, таких как, например, астроглиоз и демиелинация нервных волокон, он является цитотоксическим для клеток Лангерганса поджелудочной железы, которые вырабатывают инсулин, и также он вовлечен в литические процессы в костях, и активируя остеокласты, и подавляя формирование новой кости, оба процесса вовлечены в патологический процесс остеопороза. Он способен функционировать как пироген, поскольку, повышая высвобождение простагландинов в гипоталамическом центре, обуславливает повышение температуры тела. Он также вовлечен в патогенез ревматоидного артрита и артроза: в действительности, большие количества IL-1 были обнаружены в синовиальной жидкости пациентов, страдающих ревматоидным артритом и/или остеоартрозом. И наконец, он принимает участие в образовании сосудистого повреждения, например венозного тромбоза, и присутствует во всех сосудах при патологии артерио/артериосклеротического типа. В настоящее время проводятся испытания антагонистов рецептора для этого цитокина, поскольку доказано, что блокада рецептора представляет собой эффективный способ лечения этих патологических процессов, где IL-1 принадлежит к числу протагонистов.

TNF : Фактор некроза входит в состав группы цитокинов, которая провоцирует реакцию фазы острого системного воспаления. Таким образом, TNF вовлечен в чрезвычайно большое число процессов, таких как клеточная пролиферация, дифференциация и апоптоз, канцерогенез и вирусная репликация.

Он преимущественно вырабатывается макрофагами и рядом других клеточных типов, в том числе мастоцитами, лимфоидными клетками, мышечными и эпителиальными клетками, фибробластами и нейронами. Его синтез может быть простимулирован бактериальными эндотоксинами, другими цитокинами, такими как IL-2, Интерферон и IL-1, и его можно ингибировать стероидами.

Воздействуя на многочисленные органы и системы, как правило, совместно с другими цитокинами, он принимает участие в развитии и регуляции многих патогенетических процессов:

- модулирует экспрессию многих белков и важных цитокинов, таких как IL-1 и IL-6, в результате чего вовлечен во многие кожные патологии, такие как дерматит, витилиго и экзема;

- стимулирует гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему, повышая высвобождение гормонов некоторых типов;

- подавляет аппетит;

- стимулирует повышение температуры (действует в качестве пирогена, стимулируя гипоталамус к выработке простагландинов);

- стимулирует синтез коллагеназ в синовиоцитах, и по этой причине большое количество TNF обнаружено в синовиальной жидкости пациентов, страдающих артрозом и ревматоидным артритом;

- активирует остеокласты и, таким образом, индуцирует реабсорбцию костной ткани, процесс, свойственный остеопорозу;

- также вовлечен в патологические процессы, затрагивающие нервную систему, такие как астроцитоз и демиелинизация;

- сильно притягивает нейтрофилы и помогает им прикрепляться к эндотелиальным клеткам для транссудации;

- стимулирует выработку макрофагами молекул с окислительным действием;

- вовлечен в отдельные патологические процессы сердечно-сосудистой системы, принимая участие в формировании венозного тромбоза, в патогенез артериосклероза и васкулита;

- повышает резистентность к инсулину, повышает катаболизм белка в мышечной ткани, тем самым подавляя липогенный метаболизм в жировой ткани.

Высокие концентрации TNF могут индуцировать шокоподобные симптомы, в то время как длительное воздействие низких концентраций может вызвать кахексию, синдром, который является причиной истощения белковых и жировых запасов тканей (в частности, мышечной и жировой). TNF способен связываться с двумя рецепторами, TNF-R1 (рецептор для TNF типа 1) и TNF-R2 (рецептор для TNF типа 2), которые экспрессируются во всех соматических клетках, за исключением эритроцитов. Вкратце, TNF вызывает воспалительную реакцию, что в свою очередь запускает множество патологических процессов также аутоиммунной природы, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона, псориаз и астма. Вплоть до настоящего времени в научных исследованиях стараются усовершенствовать «биологические» лекарства (такие как, например, моноклональные антитела), которые ингибируют синтез TNF и/или блокируют его рецептор.

IL-2 : это чрезвычайно провоспалительный, атерогенный цитокин, главным образом продуцируемый Т-лимфоцитами, чей синтез ингибируется стероидами и циклоспоринами. Лейкемические клетки синтезируют вышеупомянутый цитокин и одновременно экспрессируют его рецептор, таким образом создавая аутокринную систему в стимуляции их роста, что приводит к ухудшению патологического процесса лейкемии. IL-2 играет главную роль в регуляции иммунного ответа: фактически, он стимулирует синтез TNF в лейкоцитах периферической крови и индуцирует продукцию IL-1 и TNF. IL-2 также повреждает гематоэнцефалический барьер и целостность эпителия сосудов головного мозга, обуславливая психоневрологические нарушения, такие как дезориентация и депрессивный синдром.

Таким образом, существует целый ряд патологических процессов, связанных с нарушенным производством IL-2, такие как лимфома Ходжкина, отторжение пересаженного органа, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, красная волчанка, сахарный диабет и СПИД.

IL-6 : продуцируется многими типами клеток, прежде всего ИС, вместе с TNF он является одним из самых важных членов группы химических медиаторов острой фазы воспалительного процесса и, таким образом, вовлечен в патологические процессы с сильным воспалительным компонентом, такие как астма (при которой он участвует в возникновении и поддержании воспалительного процесса), хроническая флегмона кишечника (болезнь Крона), ревматоидный артрит и артроз. Как подтверждено ранее, фактически, цитокины, такие как TNF, IL-1 и IL-6, в значительной степени вовлечены в процесс дегенеративного суставного остеоартроза, поскольку они имеют первостепенную роль в регуляции экспрессии металлопротеиназ (отвечающих за деградацию хряща), продукции простагландинов и остеокластной активации, и по этой причине высокие уровни цитокинов были зарегистрированы в синовиальной жидкости пациентов, страдающих артрозом и ревматоидным артритом (РА). Эти находки стимулировали применение ингибиторов вышеуказанных интерлейкинов и/или антагонистов рецепторов в качестве нового принципа лечения артрозов.

Высокие концентрации IL-6 также были обнаружены в моче пациентов, перенесших трансплантацию органа, и их присутствие представляет собой ранний признак реакции отторжения данного органа. Уровень этого цитокина в сыворотке также существенно повышен у многих пациентов, страдающих опухолевыми заболеваниями (такими как, например, миелома, лейкемия, миксомы сердца, или при таких патологических процессах, как лимфаденопатии и цирроз печени), и он также может быть использован в качестве индикатора при мониторинге размера опухолевого образования. Наконец, недавние исследования связали рак с продолжительностью жизни и показали, как некоторые опухоли находятся под влиянием качественного/количественного окружения цитокиновых белков у пациента: вкратце, современные данные связывают низкую продукцию IL-10 и высокую продукцию IL-6 с ухудшением клинической выживаемости пациентов, пораженных опухолевыми патологиями, в то время как генотип, способный к производству и поддержанию высоких уровней IL-10 может способствовать выживаемости. Следовательно, лица с высокими уровнями противовоспалительных цитокинов и низкими концентрациями провоспалительных цитокинов обладают генетической предрасположенностью к более продолжительной жизни (Caruso C. et al., Ann N.Y. Acad. SCI., 2004, 1028: 1-13).

IL-7 : цитокин, главным образом, продуцируемый стромальными клетками костного мозга, он также секретируется в тимусе и кератиноцитами. IL-7 индуцирует синтез воспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6 и TNF, таким образом участвуя в патогенезе некоторых заболеваний кожи (таких как псориаз и кожная лимфома) и костно-суставной системы. В действительности, высокие уровни IL-7 были обнаружены у пациентов, страдающих РА, поскольку IL-1 и TNF (цитокины, прочно вовлеченные в вышеуказанные патологические процессы) могут повышать стромальную выработку IL-7, что в свою очередь стимулирует синтез TNF макрофагами. Наконец, IL-7 может индуцировать созревание остаокластов и, следовательно, усиливать резорбцию кости, способствуя дегенерации суставов.

IL-12 : этот белок также играет центральную роль в регуляции функций ИС. В действительности, он оказывает влияние на дифференциацию лимфоцитов, индуцирует синтез Интерферона и TNF, и его выработка может быть ингибирована посредством IL-10. Сверхпродукция этого белка входит в патогенез заболеваний аутоиммунной природы, таких как колит, артрит, инсулинозависимый сахарный диабет, энцефаломиелит, псориаз и рассеянный склероз (Brahmachari S. et al., Minerva Med., 2008, 99(2): 105-118).

IL-10 : главным образом, продуцируется лимфоцитами, представляет собой цитокин противовоспалительной природы, способный ингибировать синтез IL-2 и Интерферона, вырабатываемого Т-лимфоцитами. Противовоспалительное действие IL-10 также проявляется способностью ингибировать синтез IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 и TNF в макрофагах, стимулированных бактериальными эндотоксинами. Недостаток IL-10 связан с такими патологическими процессами, как сахарный диабет и хронические воспаления кишечника, например, болезнь Крона. Недавние результаты привели к тому, что IL-10 также будут испытывать в качестве нового терапевтического подхода к лечению красной волчанки. Низкие уровни IL-10 наблюдали в кожной ткани пациентов, страдающих такими патологическими процессами, как витилиго, псориаз, экзема и дерматит в общем плане. Следует отметить, что и кортикостероиды, и циклоспорин повышают продукцию и/или высвобождение этого интерлейкина из соответствующих компетентных клеток в процессе стандартной иммуносупрессорной терапии при лечении воспалений и отторжения органов (Zhou X. Et al., Current Drug Targets-Immune, Endocrine & Metabolic Disorders, 2005, 5(465475). Экспериментальные данные также продемонстрировали его эффективность в уменьшении высвобождения простагландинов и циклооксигеназ, индуцированного in vitro посредством TNF в синовиоцитах человека, таким образом свидетельствуя о способности IL-10 уменьшать воспалительные процессы, в которые вовлечены суставы, пораженные остеоартрозной дегенерацией (Alaaeddine N. et al., Arthritis & Rheumatism, 1999, 42:710-718). Недавние исследования подтвердили его терапевтическую эффективность в отношении астмы на экспериментальной модели бронхиальной гиперактивности на животных, демонстрируя, что этот цитокин имеет высокий терапевтический потенциал в уменьшении воспаления, которое характерно для дыхательных путей астматических больных, у которых высокие концентрации TNF, IL-1, IL-5, IL-6 и IL-8 были обнаружены в бронхиальном смыве и/или на сывороточном уровне, и/или на тканевом уровне (Stankiewicz W. et al., Mediators of Inflammation, 2002, 11: 307-312). Таким образом, для этого интерлейкина была предположена важная роль регулятора цитокинов поддержания иммунологического гомеостаза.

Астма может быть чрезвычайно инвалидизирующим заболеванием, которым страдают приблизительно 200 миллионов человек во всем мире, и является причиной более 5000 смертей в год. Это патологический процесс, в основе которого лежит деформированная реакция ИС на факторы окружающей среды, в связи с чем связан с повышенной продукцией провоспалительных цитокинов для роста и дифференциации мастоцитов и эозинофилов с другими типами клеток ИС. Причины этой несбалансированной активности иммунной системы до сих пор не совсем понятны, тем не менее, существуют генетические, экологические, вирусные, а также алиментарные факторы, которые вносят свой вклад различными путями в развитие этой патологии. Следовательно, обнаружение эффективной терапии для профилактики/лечения этой патологии делает возможным прекращение и/или снижение использования стероидов (традиционный способ лечения), может представлять собой эффективное решение как для более серьезных форм (поскольку в любом случае это позволит уменьшить использование стероидов), так и в менее серьезных случаях, поскольку прекращение стероидной терапии может быть полным.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому и неожиданному применению HAS в качестве регулятора цитокиновой активности, поскольку заявитель изобретения обнаружил ее исключительную способность модулировать активность определенных цитокинов, изучал механизм действия и выявил существенное различие между двумя типами сульфатированного продукта, известных в уровне техники, но самое главное, заявитель данного изобретения обнаружил непредвиденно высокую активность против различных типов и штаммов вируса герпеса, ВИЧ, цитомегаловируса и вируса везикулярного стоматита. Сульфатированная гиалуроновая кислота, подходящая для целей настоящего изобретения, была получена в соответствии с процессом, описанным в EP 702699 B1: сульфатирование осуществляется с помощью комплекса SO₃-пиридин и включает в себя спиртовые гидроксильные группы, представленные в полисахаридной цепи, происходящей из НА, полученной из любого источника, например в результате экстракции из петушиного гребня, либо ферментативно, либо технологически, и имеющий молекулярный вес в диапазоне от 400 до 3×10⁶ Да, в частности от 1×10⁴ Да до 1×10⁶ Да, даже более конкретно от 10000 до 50000 Да, 150000 до 250000 Да и 500000 до 750000 Да.

Полученное производное вещество сохраняет все физические характеристики исходного полимера неизмененными, в частности молекулярный вес исходной НА не изменяется в процессе сульфатирования, тем самым обеспечивается возможность сохранения всех физико-химических характеристик исходного полисахарида. В процесс сульфатирования вовлечены различные гидроксильные группы дисахаридной единицы, и таким образом можно достичь различных степеней сульфатации, от 0,5 до 3,5 (предназначены для обозначения числа сульфатных групп на дисахаридную единицу), посредством изменения количества введенного SO₃-пиридина, как известно в уровне техники.

Производное соединение, используемое во всех осуществленных экспериментах, как правило, имеет степень сульфатации 1 или степень 3, и обозначено далее как HAS1 и HAS3. Все свободные карбоксильные группы в HA могут быть в виде соли, образованной с катионами органического и/или неорганического происхождения.

Обе степени HAS являются водорастворимыми, и они также могут быть простерилизованы с использованием стандартных технологических приемов, известных специалистам в данной области, даже если стерилизация в автоклаве предпочтительнее.

В проведенных экспериментальных работах, описанных здесь, заявитель изобретения демонстрирует, что:

- HAS обладает способностью стимулировать как продукцию новой мРНК, так и белковый синтез противовоспалительных цитокинов (такого как, например, IL-10), таким образом повышая способность клеток к иммунной защите и, следовательно, всего организма. Противовоспалительное действие вышеуказанных цитокинов проявляется способностью ингибировать синтез IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 и TNF, все белки провоспалительной природы.

- HAS является эффективной и в уменьшении синтеза новой мРНК, и в плане значительного снижения белкового синтеза IL-2, IL-7 и IL-12 со стороны синовиоцитов (для IL-12) и клеточных компонентов ИС, и то, и другое в ситуациях, когда иммунная реакция не требуется, а также при определенных событиях воспалительной реакции, при которых иммунная клетка отвечает выработкой цитокинового каскада, и, главным образом в этом случае, представленные данные выявляют более значительное ингибиторное действие HAS.

- HAS эффективна в отношении ингибирования связывания TNF, IL-1 и IL-6 с их рецепторами. Эти результаты имеют фундаментальное значение, поскольку они подтверждают, что данное действие сульфата совершенно аналогично таковому специфических моноклональных антител для рецепторов вышеуказанных провоспалительных белков, следовательно, он способен блокировать их функцию, даже если они не обладают этой специфичностью. Эта блокада рецептора является наиболее эффективным способом противодействия провоспалительному и опухолевому эффектам TNF, IL-1 и IL-6 фактора, тем самым открывая новые горизонты в проведении клинических экспериментов, делая возможным усовершенствование новых терапевтических подходов в лечении и/или профилактике чрезвычайно большого количества патологических процессов, учитывая роль, которую TNF, IL-1 и IL- 6 играют в возникновении и прогрессировании целого ряда заболеваний.

В силу вышеизложенного автор изобретения описывает и заявляет новое применение HAS для изготовления лекарственного средства:

- для профилактики и/или лечения патологических процессов, связанных с иммунным дефицитом и, в частности, с дефицитом IL-10, стимулируя синтез противовоспалительных цитокинов в качестве новой местной или системной терапии таких патологий, как витилиго, экзема, псориаз и дерматит;

- для профилактики и/или лечения патологических процессов, связанных с повышением/активацией IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 и TNF;

- для профилактики и/или лечения астмы, ревматоидного артрита и артроза, связанных с активацией IL-1, IL-6 и TNF;

- для профилактики и/или лечения патологических процессов, связанных с повреждением эндотелия кровеносных сосудов;

- для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, таких как, например, дерматит и кожная лимфома;

- для профилактики и/или лечения заболеваний аутоиммунной природы, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона (и все хронические воспаления кишечника), псориаз и астма, сахарный диабет, энцефаломиелит, рассеянный склероз, красная волчанка и для лечения отторжения трансплантатов органов;

- для профилактики и/или лечения новообразований, таких как, например, лейкемия и лимфома Ходжкина;

- для профилактики и/или лечения астроглиоза, астроцитоза и демиелинизации нервных волокон;

- для профилактики и/или лечения патологических состояний, связанных с активацией остеокластов, таких как остеопороз;

- для профилактики и/или лечения сосудистых патологий артерио/артериосклеротического типа, венозного тромбоза и васкулитов, связанных с активацией TNF, IL-1 и IL-6;

- для профилактики и/или лечения лихорадочных патологических состояний.

Заявитель изобретения также продемонстрировал, в описанных здесь экспериментальных работах, силу противовирусного действия HAS в отношении вирусов различных типов:

- полученные результаты демонстрируют эффективность HAS (как степени 1, так и степени 3) при ингибировании вирусной репликации вируса ВИЧ 1 и 2. Данный эксперимент также продемонстрировал, что не все сульфатированные гиалуроновые кислоты, известные в уровне техники, действуют эффективно в отношении вирусной репликации, поскольку только для HAS, у которой сульфатирование произошло в отношении гидроксильных групп исключительно, была доказана активность, причем HA-NS не является эффективной при блокировании вирусной цитопатогенности.

- Экспериментальные данные подтверждают противовирусное действие HAS1 и HAS3 против вируса простого герпеса 1 и 2, и против вируса везикулярного стоматита (VSV). Первая форма, чрезвычайно распространенная, отвечает за появление характерных лихорадочных пузырьков, обычно поражающих кожу лица (губы, ноздри); эту форму также называют herpes simplex labialis. Инфекция, обусловленная герпесом губ, может легко появляться снова, поскольку данный вирус выживает внутри клеток и не уничтожается даже с помощью эффективных лекарственных препаратов. Вторая форма представляет собой инфекцию половых органов, также известна как herpes genitalis. Заражение обеими формами происходит в результате физического и полового контакта. Вследствие локализации вирионов в нервных ганглиях, где они могут сохраняться в состоянии покоя в течение длительного периода времени, для герпетической инфекции характерны рецидивы, совпадающие с событиями, вызывающими стресс иммунной системы, и обычно появляются вновь в первичном очаге. Вирус везикулярного стоматита представляет собой РНК-вирус, он поражает млекопитающих (главным образом животных), и его используют в лабораториях для изучения развития жизненного цикла данного РНК-вируса. Сравнение между HA-NS1 и HAS1 еще раз показало, что не все сульфатированные гиалуроновые кислоты являются аналогичными, так как доказано, что HA-NS1 является вообще не активной, в то время как HAS 1 и 3 демонстрируют очень сильную противовирусную активность против вируса простого герпеса, а также против VSV. Ни один из протестированных образцов не оказался цитотоксичным для клетки-хозяина, минимальная полученная цитотоксическая концентрация, по существу, является эквивалентной таковой стандартных лекарственных средств, используемых обычно в клинической практике для лечения герпеса, и в среднем оказалась в 100 раз сильнее, чем показанные активными при ингибировании вирусной репликации.

- Экспериментальные данные, полученные и для HAS1, и для HAS3, показали явный и значимый противовирусный результат в отношении Cytomegalovirus: это особый тип вируса, который внедряется в некоторые типы клеток нашего организма, в которых он воспроизводит сам себя паразитически, что является причиной их гибели. Он принадлежит тому же семейству, что и herpes labialis и herpes genitalis, ветряная оспа и инфекционный мононуклеоз. Эпителиальные клетки, мембраны слизистых оболочек, лимфоузлы представляют собой очаги множественной первичной инфекции. Он сохраняется в латентной форме пожизненно в периферической крови, в эпителии почечных канальцев и в эпителии слюнных желез. У больных с ослабленным иммунитетом (такие как страдающие СПИДом, и пациенты после трансплантации органов, находящиеся под иммуносупрессивной терапией) встречаются тяжелые формы, затрагивающие различные органы: пневмония, гепатит, колит, эзофагит, нефрит. Лечение заключается в приеме лекарственных средств, таких как ганцикловир, валганцикловир и фоскарнет (ингибиторы синтеза вирусной ДНК). Также и в этом случае, было доказано, что HA-NS1 является неэффективным при ингибировании пролиферации данного вируса, подтверждая абсолютное различие, относительно противовирусного потенциала, между двумя типами сульфатированных продуктов.

В силу вышеизложенного автор изобретения описывает и заявляет новое применение HAS для изготовления лекарственного средства:

- для профилактики и/или лечения ВИЧ;

- для профилактики и/или лечения herpes simplex labialis и herpes genitalis;

- для профилактики и/или лечения инфекции, вызванной вирусом пузырькового стоматита;

- для профилактики и/или лечения инфекции, вызванной цитомегаловирусом.

Наконец, заявитель изобретения описывает приготовление различных фармацевтических составов/композиций, включающих в себя HAS в качестве единственного активного компонента, или в сочетании с другими фармацевтически и/или биологически активными агентами, такими как, например, стероиды, гормоны, белки, трофические факторы, витамины, нестероидные противовоспалительные средства (FANS), химиотерапевтические средства, блокаторы кальциевых каналов, антибиотики, противовирусные средства, противосвертывающие средства и/или фибринолитические средства, анестезирующие средства местного действия, ферменты, такие как, например, коллагеназы и/или гиалуронидазы, и/или другие протеазы; также могут быть составлены композиции с полимерами, такими как гиалуроновая кислота и ее производные, карбоксиметилцеллюлоза и/или другие полимеры природного (например, коллаген) или синтетического происхождения.

Обсуждаемую фармацевтическую композицию можно применять системно (внутривенно или артериально, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно или перорально), ее можно использовать для местного применения посредством кожного и/или чрескожного всасывания, ее можно вводить в организм ингаляционно/аэрозольно (в особенности для лечения астматической патологии), внутрисуставно, или ее можно ввести непосредственно в область, подвергающуюся лечению, посредством прямой инъекции.

Обсуждаемая фармацевтическая композиция может быть сформулирована в виде мази, липогеля, гидрогеля, губной помады, крема, вагинальных овулей и бужей, пены, геля для слизистых оболочек, офтальмологических препаратов, средств для промывания/спринцевания, жидкостей для полоскания ротовой полости, пластырей для кожного и/или чрескожного всасывания, особенно FANS и гормонов, раствора для ингаляционного использования.

Некоторые примеры композиций HAS степени 1 и 3, фармацевтических составов, содержащих их, представлены исключительно для наглядных и неограничивающих целей, вместе с результатами, полученными в экспериментальных работах in vitro.

Пример 1

Получение тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (НА), имеющей средний молекулярный вес, эквивалентный 200 кД (в диапазоне от 150000 до 250000 Да)

5,00 г гиалуроновой кислоты ферментативного происхождения из натриевой соли (200 кД) растворяли в 250 мл воды и полученный раствор профильтровывали через стеклянную колонку, предварительно заполненную 100 см³ смолы Dowex в форме тетрабутиламмония (TBA). Элюированный раствор соли HA-TBA собирали и лиофилизировали. Получено 7,50 г продукта.

Пример 2

Синтез сульфатированной НА, исходя из НА, имеющей средний молекулярный вес 200 кД и степень сульфатации, эквивалентную 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу

Способ A

10,0 г ТВА-соли гиалуроновой кислоты, имеющей средний молекулярный вес 200 кД, полученной в соответствии с Примером 1, растворяли в 300 мл диметилсульфоксида (DMSO); 26,0 г комплекса SO₃-пиридин (серный ангидрид и пиридин, далее сокращено как PySO₃) диспергировали в 150 мл DMSO, и затем добавляли в раствор НА. После 20 часов механического перемешивания при температуре 21°C реакцию останавливали, добавляя 0,1 объема воды; сырой продукт реакции выделяли посредством осаждения после добавления 2 объемов этилового спирта. Полученное твердое вещество диспергировали в 150 мл воды и доводили значение рН до нейтрального с помощью 1М NaOH. Проводили тщательный диализ данной смеси против воды через мембрану с границей отсекания 12-14000 Да. Данный диализированный продукт подвергают лиофилизации. Получено 9,7 г продукта со степенью сульфатирования, эквивалентной 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу (выход = 88%).

Способ B

32,0 г ТВА-соли гиалуроновой кислоты, имеющей средний молекулярный вес 200 кД, полученной в соответствии с Примером 1, растворяли в 900 мл N-метил-пирролидона (NMP); 100 г PySO₃ диспергировали в 600 мл NMP, и затем добавляли в раствор НА. После 20 часов механического перемешивания при температуре 21±1°C, реакцию останавливали, добавляя 0,5 объема воды; значение рН, изначально менее 2,5, доводили до нейтрального с помощью NaOH (в растворе). Сырой продукт реакции выделяли посредством осаждения, добавляя 2,5 объема метилового спирта и отмывая 2 объемами смеси метиловый спирт/вода 8/2. Данное твердое вещество повторно растворяли и проводили тщательный диализ против воды через мембрану с границей отсекания 12-14000 Да. Получено 30,4 г продукта со степенью сульфатирования, эквивалентной 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу (выход = 86%).

Пример 3

Синтез сульфатированной НА, исходя из НА, имеющей средний молекулярный вес 200 кД и степень сульфатирования, эквивалентную 1 сульфатной группе на повторяющуюся единицу

Применяя процедуру, описанную в Примере 1, готовили 10 г ТВА-соли НА, которые растворяли в 350 мл DMSO. 10,0 г комплекса PySO₃ диспергировали в 100 мл DMSO и затем добавляли в раствор HA. После 20 часов механического перемешивания при температуре 21°C данную реакцию останавливали, добавляя 0,1 объема воды; сырой продукт реакции изолировали посредством осаждения после добавления 2,5 объемов этилового спирта. Полученное твердое вещество диспергировали в 150 мл воды и доводили значение рН до нейтрального с помощью NaOH 1 моль/л. Проводили тщательный диализ данной смеси против воды через мембрану с границей отсекания 12-14000 Да. Данный диализированный продукт подвергают лиофилизации. Получено 7,54 г продукта со степенью сульфатирования, эквивалентной 1,0 сульфатной группе на повторяющуюся единицу (выход = 93%).

Пример 4

Синтез сульфатированной НА, исходя из НА, имеющей низкий средний молекулярный вес (средний МВ 10 кД, в диапазоне от 10000 до 50000 Да), и степень сульфатирования, эквивалентную 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу

Применяя процедуру, описанную в Примере 1, готовили 12,4 г ТВА-соли низкомолекулярной гиалуроновой кислоты, которые растворяли в 300 мл NMP. 40 г PySO₃ диспергировали в 100 мл NMP, и затем добавляли в раствор HA. После 20 часов механического перемешивания при температуре 21°C данную реакцию останавливали, добавляя 0,5 объема воды. Значение pH, изначально менее 2,5, доводили до нейтрального с помощью 4М NaOH. Сырой продукт реакции выделяли посредством осаждения, добавляя 2,5 объема метилового спирта и отмывая 2 объемами смеси метиловый спирт/вода 8/2. Данное твердое вещество повторно растворяли и проводили тщательный диализ против воды через мембрану с границей отсекания 3500 Да. Получено 12,0 г продукта со степенью сульфатирования, эквивалентной 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу (выход = 85%).

Пример 5

Синтез сульфатированной НА, исходя из НА, имеющей низкий средний молекулярный вес и степень сульфатирования, эквивалентную 1 сульфатной группе на повторяющуюся единицу

Применяя процедуру, описанную в Примере 1, готовили 12,4 г ТВА-соли НА, которые растворяли в 300 мл DMSO. 16,0 г PySO₃ диспергировали в 100 мл DMSO, и затем добавляли в раствор HA. После 20 часов механического перемешивания при температуре 21°C данную реакцию останавливали, добавляя 0,1 объема воды; сырой продукт реакции изолировали посредством осаждения, добавляя 2,5 объема этилового спирта. Полученное твердое вещество диспергировали в 150 мл воды и доводили значение рН до нейтрального с помощью NaOH 1 моль/л. Проводили тщательный диализ данной смеси против воды через мембрану с границей отсекания 3500 Да. Данный диализированный продукт подвергают лиофилизации. Получено 9,04 г продукта со степенью сульфатирования, эквивалентной 1,0 сульфатной группе на повторяющуюся единицу (выход = 90%).

Пример 6

Синтез сульфатированной НА, исходя из НА, имеющей молекулярный вес в диапазоне 500-730 кД и степень сульфатирования, эквивалентную 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу

21,0 г натриевой соли гиалуроновой кислоты экстрагированного происхождения (500-730 кД) растворяли в 1,5 л воды и полученный раствор фильтровали через стеклянную колонку, предварительно наполненную 450 см³ смолы Dowex в форме ТВА. Элюированный раствор соли HA-TBA собирали и лиофилизировали. Получили 32,0 г продукта, которые растворили в 1,35 л NMP; 100 г PySO₃ диспергировали в 650 мл NMP, и затем добавляли в раствор HA. После