Связанные дисульфидной связью конъюгаты полиэтиленгликоля/пептида для трансфекции нуклеиновых кислот

Связанные дисульфидной связью конъюгаты полиэтиленгликоля/пептида для трансфекции нуклеиновых кислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к обладающей признаками изобретения молекуле полимерного носителя общей формулы (I) и к ее вариантам, которые позволяют эффективно осуществлять трансфекцию нуклеиновых кислот в клетки in vivo и in vitro, к комплексу полимерного носителя и груза, сформированному нуклеиновой кислотой и обладающей признаками изобретения молекулой полимерного носителя, а также к способам получения такой обладающей признаками изобретения молекулы полимерного носителя и комплекса обладающего признаками изобретения полимерного носителя с грузом. Настоящее изобретение относится к способам применения такой обладающей признаками изобретения молекулы полимерного носителя и комплекса обладающего признаками изобретения полимерного носителя с грузом в качестве лекарственного средства для лечения различных заболеваний и для получения фармацевтической композиции для лечения таких заболеваний.

В настоящее время различные заболевания требуют лечения, которое включает введение лекарственных средств на основе пептида, белка и нуклеиновой кислоты, в частности трансфекцию нуклеиновых кислот в клетки или ткани. В полной мере терапевтическая эффективность лекарственных средств на основе пептидов, белков и нуклеиновых кислот зачастую оказывается неоправданной из-за их ограниченной способности пересекать плазматическую мембрану клеток млекопитающих, приводя к плохому проникновению в клетки и недостаточной терапевтической эффективности. В настоящее время это препятствие представляет большую помеху для биомедицинского развития и коммерческого успеха многих биофармацевтических агентов (см., например, Foerg и Merkle, Journal of Pharmaceutical Sciences, , 97(1), 2008, cc. 144-162).

Для некоторых заболеваний и расстройств были разработаны подходы на основе генной терапии в качестве специфической формы подобного лечения. В таких методах лечения обычно используют трансфекцию нуклеиновых кислот или генов в клетки или ткани, и подходы на основе генной терапии дополнительно включают инсерцию одной или нескольких таких нуклеиновых кислот или генов в отдельные клетки или ткани для лечения заболевания, например, наследственных заболеваний, в которых дефектный мутантный аллель замещен на функциональный аллель.

Перенос или инсерция одной или нескольких из этих нуклеиновых кислот или генов в клетки индивидуума, однако, в настоящее время по-прежнему представляют большую проблему и абсолютно необходима для обеспечения хорошего терапевтического эффекта лекарственных средств, основанных на нуклеиновых кислотах, особенно в области генной терапии.

Для осуществления успешного транспорта нуклеиновых кислот или генов в клетки индивидуума следует преодолеть несколько препятствий. Транспорт нуклеиновых кислот обычно происходит через соединение нуклеиновой кислоты с клеточной мембраной с последующим поглощением эндосомами. Находясь в эндосомах, интродуцированные нуклеиновые кислоты обособляются от цитозоля. Поскольку экспрессия происходит в цитозоле, эти нуклеиновые кислоты должны покинуть цитозоль. Если нуклеиновые кислоты не покидают цитозоль, либо эндосома сливается с лизосомой, приводя к разрушению ее содержимого, либо эндосома сливается с мембраной, приводя к возвращению ее содержимого во внеклеточную среду. Таким образом, для эффективного переноса нуклеиновых кислот вывод с помощью эндосом представляется одной из наиболее важных стадий помимо эффективности стадии самой трансфекции. До сих пор имеются разные подходы, направленные на достижение такого результата. Однако каких-либо успешных в этом отношении подходов не было.

К агентам трансфекции, применяемым в настоящее время, обычно относятся пептиды, разные полимеры, липиды, а также нано- и микрочастицы (см., например, Gao X., К.S.Kim и др., Aaps J 9(1), 2007, сс.Е92-104). Такие агенты трансфекции обычно успешно применяют только в реакциях in vitro. При трансфекции нуклеиновых кислот в клетки животных in vivo в полной мере должны соблюдаться дополнительные условия. Например, комплекс должен быть стабильным в физиологических солевых растворах в плане агломерации. Кроме того, он не взаимодействует с частями системы комплемента хозяина. Дополнительно комплекс должен защищать нуклеиновую кислоту от раннего внеклеточного разрушения повсеместно присутствующими нуклеазами. Для применения в генной терапии кроме того крайне важно, чтобы носитель не распознавался системой приобретенного иммунитета (не обладал иммуногенностью) и не стимулировал неспецифическую атаку цитокинов (острый иммунный ответ) (см. Gao Kim и др., (2007, выше); Martin М.Е. и К.G.Rice, Aaps J, 9(1), 2007, сс.El8-29; Foerg и Merkle, (2008, выше)).

Foerg и Merkle (2008, выше) рассматривают терапевтическое значение лекарственных средств, основанных на пептидах, белках или нуклеиновых кислотах. В полной мере терапевтическая эффективность таких лекарственных средств зачастую оказывается неоправданной из-за их ограниченной способности пересекать плазматическую мембрану клеток млекопитающих, приводя к плохому проникновению в клетки и недостаточной терапевтической эффективности. В настоящее время это препятствие представляет большую помеху для биомедицинского развития и коммерческого успеха многих биофармацевтических агентов.

В этом контексте Gao и др. (Gao и др. The AAPS Journal, 9(1), 2007, статья 9) видят основное препятствие для применения генной терапии для разработки способа, который доставляет терапевтический ген в отдельные клетки, в которых должным образом протекающая генная экспрессия может быть достигнута. Однако доставка гена и особенно успешная трансфекция нуклеиновых кислот в клетки или ткани представляют сложную задачу и обычно зависят от многих факторов. Для успешной доставки, например, высвобождения нуклеиновых кислот или генов в клетки или ткани, следует преодолеть много барьеров. По мнению Gao и др. (2007), идеальный способ генной доставки должен соответствовать трем основным критериям: (1) он должен защищать трансген от разрушения нуклеазами во внутриклеточных матриксах, (2) он должен переносить трансген через плазматическую мембрану и (3) он не должен иметь вредных побочных эффектов.

Такие цели могут быть достигнуты применением комбинации разных соединений или векторов. В особенности имеется несколько соединений или векторов, которые преодолевают по меньшей мере некоторые из перечисленных барьеров.

В большинстве случаев трансфекцию, например, нуклеиновых кислот, проводят с помощью вирусных или невирусных векторов. Для успешной доставки такие вирусные или невирусные векторы должны быть способны к преодолению указанных выше препятствий. Имеющиеся в настоящее время наиболее успешные стратегии генной терапии основаны на применении вирусных векторов, например, аденовирусных, аденоассоциированных вирусов, ретровирусов и вирусов герпеса. Вирусные векторы способны опосредовать перенос гена с высокой эффективностью и возможностью длительной генной экспрессии, причем они соответствуют 2 из 3 критериев. Однако острый иммунный ответ, иммуногенность и инсерционный мутагенез, изученные в клинических исследованиях по генной терапии, выдвинули серьезную проблему безопасности, касающуюся некоторых обычно используемых вирусных векторов.

Решением этой проблемы может стать применение невирусных векторов. Хотя невирусные векторы не столь эффективны по сравнению с вирусными векторами, многие невирусные векторы были разработаны в качестве альтернативы генной терапии. Способы невирусной доставки генов исследовали с помощью физических (генная доставка без носителя) и химических (генная доставка на основе синтетического вектора) подходов. Физические подходы обычно включают инъекцию иглой, электропорацию, генную пушку, ультразвуковую и гидродинамическую доставку, применение физической силы, которые преодолевают клеточную мембрану и облегчают перенос гена внутрь клетки. В химических подходах обычно применяют синтетические или природные соединения (катионные липиды, катионные полимеры, гибридные системы липид-полимер) в качестве носителей для доставки трансгена в клетки. Хотя существенный прогресс был достигнут на научной основе и исходя из опыта применения различных невирусных систем генной доставки, по-прежнему большинство невирусных подходов не столь эффективно по сравнению с подходами на основе вирусных векторов, особенно для генной доставки in vivo (см., например, Gao et al. The AAPS Journal, 9(1), 2007, статья 9).

За последнее десятилетие были объявлены привлекательные результаты по существенному улучшению, касающемуся доставки в клетку нуклеиновых кислот, на основе результатов физической сборки нуклеиновых кислот или их химического лигирования с так называемыми проникающими в клетку пептидами (ПКП), которые также называют доменами белковой трансдукции (protein-transduction domain - PTD) (см. Foerg и Merkle, (2008, выше)). ПКП - это короткие пептидные последовательности примерно из 10-30 аминокислот, которые могут пересекать плазматическую мембрану клеток млекопитающих и таким образом могут предоставить беспрецедентные возможности для доставки лекарственного средства в клетку. Почти все эти пептиды включают серии катионных аминокислот в комбинации с последовательностью, которая формирует α-спираль при низком значении рН. Поскольку рН in vivo постоянно снижается за счет протонных насосов, конформационное изменение пептида обычно быстро инициируется. Такой отрезок спирали опосредует инсерцию в мембрану эндосомы, что приводит к высвобождению ее содержимого в цитоплазму (см. Foerg и Merkle, (2008, выше); E.Vives, P.Brodin и др., J Biol Chem, 272(25), 1997, сс.16010-7). Несмотря на такие преимущества, предполагают, что серьезное препятствие к опосредованной ПКП доставке лекарственного средства заключается зачастую в быстром метаболическом клиренсе пептидов при контакте с ферментными барьерами эпителия и эндотелия или при их прохождении. Таким образом, метаболическая стабильность ПКП представляет важный биофармацевтический фактор для их клеточной биодоступности. Однако в данной области нет доступных ПКП, которые с одной стороны достаточно стабильны, чтобы нести свой груз к мишени до своего метаболического расщепления, и с другой стороны, чтобы удаляться и не накапливаться в ткани, достигая токсичных уровней.

Еще один подход в данной области, касающийся доставки в клетки молекул с грузом, например, для генной терапии, включает пептидные лиганды (см. Martin и Rice (см. Martin и Rice, The AAPS Journal, 9 (1), 2007, статья 3)). Пептидные лиганды могут быть короткими последовательностями, взятыми от более крупных белков, которые предоставляют важные аминокислоты, требуемые для распознавания рецептора, например, пептид EGF применяют для раковых клеток-мишеней. Были выявлены другие пептидные лиганды, включая лиганды, применяемые для нацеливания на лектиноподобный рецептор-1 окисленных липопротеинов низкой плотности (lectin-like oxidized LDL receptor -LOX-1). Повышенная регуляция LOX-1 в клетках эндотелия ассоциирована с дисфункциональными состояниями, например, гипертонией и атеросклерозом. Однако такие пептидные лиганды непригодны для многих геннотерапевтических подходов, поскольку они не могут связываться с нагрузочными молекулами за счет комплексообразования или адгезии, но требуются ковалентные связи, например, перекрестные сшивки, которые обычно оказывают цитотоксическое воздействие на клетку.

Синтетические векторы также могут применяться в данной области для доставки нагрузочных молекул в клетки, например, для генной терапии. Однако главным недостатком многих синтетических векторов является их плохая эффективность, связанная с трансфекцией, по сравнению с вирусными векторами, и требуются существенные улучшения для возможности дальнейшего клинического исследования. Несколько препятствий, ограничивающих перенос нуклеиновых кислот и in vitro, и in vivo, было установлено - к ним относятся плохая доставка внутрь клеток, токсичность и нестабильность векторов в физиологических условиях (см., например, М.L.Read, К.Н.Bremner и др., J Gene Med 2003, 5(3), cc. 232-245).

Один из подходов в генной терапии заключается в применении катионных липидов. Однако хотя многие катионные липиды чрезвычайно эффективны в плане осуществления трансфекции в культуре клеток, их эффективность не наблюдается в присутствии сыворотки и лишь незначительно проявляется in vivo. Резкое изменение размера, заряда на поверхности и липидного состава происходит при воздействии на липоплексы огромного количества отрицательно заряженных и часто амфотерных белков и полисахаридов, имеющихся в крови, слизистой эпителиальной выстилке или в тканевом матриксе. При введении in vivo липоплексы проявляют тенденцию к взаимодействию с отрицательно заряженными компонентами крови и формируют крупные агрегаты, которые могут адсорбироваться на поверхности циркулирующих красных кровяных клеток, замкнутых в толстом слизистом слое или эмболизированных в микроциркуляторных частях сосудистого русла, предупреждая их от достижения требуемых клеток-мишеней отдаленной локализации. Кроме того, может наблюдаться токсичность, связанная с переносом генов липоплексами. К симптомам inter alia относится индукция воспалительных цитокинов. У людей в разной степени проявляются побочные воспалительные реакции, включая симптомы, напоминающие грипп, которые были отмечены у субъектов, получавших липоплексы. Поэтому возникает вопрос, насколько вообще безопасно липоплексы могут применяться людьми.

Еще одним, более обещающим, подходом в генной терапии является применение катионных полимеров. Катионные полимеры оказываются эффективными в трансфекции нуклеиновых кислот, поскольку они образуют плотный комплекс и конденсируют отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты. Поэтому ряд катионных полимеров был исследован в качестве носителей для доставки генов in vitro и in vivo. К ним относятся полиэтилениминные (ПЭИ), полиамидоаминные и полипропиламинные дендримеры, полиаллиламин, катионный декстран, хитозан, катионные белки и катионные пептиды. Хотя большинство катионных полимеров разделяют функцию конденсирования ДНК в мелкие частицы и облегчения поступления в клетку через эндоцитоз за счет взаимодействия зарядов с анионными сайтами на поверхности клетки, они резко различаются по действию, обеспечивающему трансфекцию, и по токсичности. Интересно отметить, что катионные полимеры лучше проявляют действие, обеспечивающее трансфекцию, по мере увеличения молекулярной массы из-за более прочного комплексообразования с нагруженной отрицательно заряженной нуклеиновой кислотой. Однако возрастающая молекулярная масса также приводит к возрастанию токсичности катионного полимера. Возможно ПЭИ является наиболее действенным и наиболее изученным полимером для генной доставки, но основное препятствие для его применения в качестве реагента для трансфекции связано с отсутствием биоразрушения и токсичностью. Кроме того, даже полиплексы, сформированные высокомолекулярными полимерами, проявляют повышенную стабильность в физиологических условиях, и результаты показывают, что такие полимеры могут затруднять распаковку вектора. Например, показано, что поли(L-лизин) (PLL) из 19 и 36 остатков диссоциирует от ДНК быстрее, чем PLL из 180 остатков, приводя к существенному повышению краткосрочной генной экспрессии. Требуется минимальная длина из 6 или 8 катионных аминокислот для компановки ДНК в структуры, действующие при рецептор-опосредованной доставки гена. Однако полиплексы, сформированные короткими поликатионами, нестабильны в физиологических условиях и обычно быстро агрегируют в физиологических солевых растворах. Для преодоления такого отрицательного воздействия Read и др. (М.L.Read, К.Н.Bremner и др., J Gene Med 5(3), 2003, cc. 232-245; M.L.Read, S.Singh и др., Nucleic Acids Res 33(9), 2005, c. e86) разработали новый тип синтетического вектора, основанного на линейном уменьшаемом поликатионе (УПК), полученном окислительным поликонденсированием пептида Cys-Lys₁₀-Cys, который может быть расщеплен под действием внутриклеточной среды для облегчения высвобождения нуклеиновых кислот. Они могут показать, что полиплексы, сформированные УПК, дестабилизируются за счет восстановительных условий, допускающих эффективное высвобождение ДНК и иРНК. Расщепление УПК также снижает токсичность поликатиона до уровней, сопоставимых с уровнями низкомолекулярных пептидов. Недостаток такого подхода Read и др. (2003, выше) находят в том, что эндосомолитический агент хлорохин или катионный липид DOTAP дополнительно требуются для повышения эффективности трансфекции до приемлемых уровней. Поэтому Read и др. (2005, выше) включили остатки гистидина в УПК, поскольку они обладают известной эндосомальной буферной емкостью. Они смогли показать, что обогащенные гистидином УПК могут расщепляться в условиях внутриклеточной восстанавливающей среды, допускающей эффективную цитоплазматическую доставку разнообразных нуклеиновых кислот, включая плазмидную ДНК, молекулы иРНК и миРНК, без потребности в эндосомолитическом агенте хлорохине.

К сожалению, Read и др. (2005, выше) не сообщают, можно ли обогащенные гистидином УПК использовать непосредственно in vivo. В их исследовании трансфекцию проводят в отсутствии сыворотки, чтобы избежать маскирования способности остатков гистидина повышать перенос гена, которое может возникнуть от связывания сывороточных белков с полиплексами, ограничивая поступление в клетку. Предварительные эксперименты показывают, что на способность к трансфекции обогащенных гистидином УПК полиплексов может повлиять наличие сывороточных белков с 50% снижением в GFP-положительных клетках, наблюдаемое при 10% ФСТ (ФСТ - фетальная сыворотка теленка). Для применения in vivo были предложены модификации с гидрофильным полимером поли-[N-(2гидроксипропил)метакриламидом]. К сожалению Read и др. (2005, выше) не предотвратили агрегирования полиплексов поликатионных белков с сывороточными белками. Кроме того, из-за большого избытка полимера, отличающегося высоким соотношением N/P, формируются прочные катионные комплексы при комплексообразовании с нуклеиновой кислотой, которая лишь ограниченно применяется in vivo из-за выраженной тенденции соли к агломерации и взаимодействиям с содержимым сыворотки (опсонизация). Дополнительно комплексы могут стимулировать острый иммунный ответ при применении для целей генной терапии. Read и др. (2003, выше) также не предоставили данных in vivo по комплексам на основе УПК, указанным в публикации. Также было установлено, что эти сильные катионные на основе УПК комплексы полностью неактивны после местного применения на коже. Кроме того, Read и др. (2005, выше) применяют жесткие окислительные условия (30% ДМСО) для индукции выработки высокомолекулярных полимеров с максимально возможной длиной цепей («поэтапно возрастающей полимеризацией») чтобы убедиться, что полностью произошло комплексообразование с грузом нуклеиновой кислоты.

В подходе, близком к подходу Read и др., McKenzie и др. (McKenzie D.L., К.Y.Kwok и др., J Biol Chem 275(14), 2000, cc. 9970-9977; McKenzie D. L., E.Smiley и др., Bioconjug Chem 11(6), 2000, cc. 901-909, US 6770740 B1) разработали пептиды с собственными перекрестными сшивками в качестве агентов доставки генов путем инсерции большого количества цистеинов в короткие синтетические пептиды для снижения токсичности, что наблюдается у высокомолекулярных поликатионов. Для комплексообразования с ДНК смешивали пептиды с собственными перекрестными сшивками с ДНК для индукции межпептидных дисульфидных связей одновременно с комплексообразованием с нагружаемой ДНК. В качестве подходов по доставке гена in vivo они предлагают дериватизацию пептидов с собственными перекрестными сшивками с обманывающим (например, полиэтиленгликолем) или нацеливающим агентом, оперативно связанным с пептидом по месту, отдаленному от каждого из концов. В другом подходе те же авторы разработали с целью маскирования ДНК пептидные конденсаты, за счет которых понижается взаимодействие с компонентами крови, дериватизацию катионного пептида CWK₁₈ без поперечных сшивок с полиэтиленгликолем путем восстанавливаемых или невосстанавливаемых связей (Kwok К.Y., D.L.McKenzie и др., J Pharm Sci 88(10), 1999, cc. 996-1003).

Из вышесказанного следует, что в предшествующем уровне техники сложилось неблагоприятное положение. В частности недостаток пептидов с поперечными сшивками, согласно описанному Read и др. (2003, выше) или McKenzie и др., (2000 I и II, выше, и US 6770740 B1), касается высокого положительного заряда на поверхности сформированных частиц. Из-за высокого положительного заряда частицы проявляют высокую нестабильность в плане агломерации при воздействии на эти частицы in vivo повышенных концентраций солей. Однако такие концентрации солей обычно имеются в клетках in vivo или во внеклеточных средах. Кроме того, комплексы с высоким положительным зарядом показывают выраженную тенденцию к опсонизации. Это приводит к повышенному поглощению макрофагами и, кроме того, к быстрой инактивации комплекса из-за разрушения. Особенно поглощение этих комплексов клетками иммунной системы в общем приводит к последующей стимуляции разных цитокинов. Однако эта неспецифическая активация врожденной иммунной системы представляет тяжелый вред для этих систем и ее следует избегать, особенно для некоторых объектов генной терапии, когда острого иммунного ответа (цитокинового шторма) с очевидностью следует избегать. Дополнительно в биологических системах положительно заряженные комплексы могут быть легко связаны или иммобилизованы отрицательно заряженными компонентами внеклеточного матрикса или сыворотки. Нуклеиновые кислоты из комплекса также могут высвободиться слишком рано, приводя к пониженной эффективности переноса и периоду полураспада этих комплексов in vivo. Кроме того, обратимая дериватизация носителей с маскирующим агентом благоприятствует доставке гена in vivo, например, с полиэтиленгликолем (ПЭГ), возможна только для пептидных мономеров, но не для пептидов с собственными перекрестными сшивками, или предпочтительнее для полимерного носителя с определенной длиной полимерной цепи. В частности, такая обратимая дериватизация была невозможна по концам катионного пептидного носителя с поперечными сшивками. Дополнительно в предшествующем уровне техники были описаны только высокомолекулярные полимеры с длинными полимерными цепями или с неопределенной длиной полимерной цепи, состоящие из пептидов с поперечными сшивками, которые к сожалению так упаковывают свой груз, что высвобождение груза в клетке становится ограниченным. Крайне неопределенная длина цепи полимера дополнительно усложняет применение лекарственного средства, основанного на УПК. Одно из предварительных условий для одобрения лекарственного средства заключается в том, что каждый препарат лекарственного средства всегда имеет один и тот же состав, структуру и свойства. Этого нельзя добиться для комплексов, основанных на УПК из предшествующего уровня техники. Кроме того, полимеры на основе УПК или комплексы, предусмотренные в предшествующем уровне техники, сложно описать из-за их неопределенной структуры или длины цепи полимера. Но описание получаемого комплекса или полимерного носителя абсолютно необходимы для улучшения лекарственного средства.

Таким образом, до настоящего времени нет реального способа или носителя, которые позволили бы и уплотнить, и стабилизировать нуклеиновую кислоту для целей генной терапии и для других терапевтических назначений, демонстрируя в результате хорошую трансфекцию в комбинации с хорошим высвобождением груза нуклеиновой кислоты, особенно in vivo, и низкую токсичность или даже отсутствие токсичности, например, из-за комбинации восстанавливаемого маскирования и восстанавливаемого комплексообразования нуклеиновой кислоты с полимерами с собственными перекрестными сшивками. Таким образом, в данной области остается острая потребность в носителях для переноса гена, которые с одной стоны достаточно стабильны, чтобы донести груз к мишени до их метаболического расщепления, и с другой стороны могут быть удалены из ткани до их накопления и достижения высоких токсических уровней.

Таким образом, задача, решаемая в настоящем изобретении, заключается в обеспечении носителя или агента для комплексообразования, особенно для трансфекции нуклеиновых кислот для целей генной терапии или для других терапевтических применений, которые позволяют компоновать нуклеиновые кислоты, предпочтительно кодирующую ДНК или кодирующую РНК, например, иРНК, и позволяют осуществлять эффективную трансфекцию нуклеиновой кислоты в разные линии клеток in vitro, а также трансфекцию in vivo. Поскольку поглощение клетками происходит через эндосомы, такой носитель или агент для комплексообразования также может допустить или обеспечить эффективное освобождение нуклеиновой кислоты. Дополнительно является предпочтительным, чтобы комплекс обладающего признаками изобретения полимерного носителя с грузом, сформированный грузом нуклеиновой кислоты и такого носителя или агента для комплексообразования, проявлял повышенную устойчивость к агломерации. Такой комплекс также предпочтительно должен обеспечить повышенную стабильность к грузу нуклеиновой кислоты относительно сред, содержащих сыворотку. Наиболее важно получить действие in vivo, тем самым подавляя по меньшей мере частично острую иммунную реакцию. Кроме того, следует подтвердить воспроизводимую выработку и свойства носителя.

Указанная задача решается в настоящем изобретении, сущность которого представлена в формуле изобретения. В частности в первом варианте осуществления настоящего изобретения указанная выше задача решается с помощью молекулы полимерного носителя общей формулы (I):

L-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-L

где

Р¹ и Р³ отличны или идентичны по отношению друг к другу и представляют линейную или разветвленную цепь гидрофильного полимера, каждый компонент Р¹ и Р³, предоставляющий по меньшей мере одну -SH-часть молекулы, способен к формированию дисульфидной связи при конденсации с компонентом Р² или в другом варианте с (АА)_x, или [(AA)_x]_z, если такие компоненты применяют в качестве линкера между Р и Р или Р и Р, и/или с другими компонентами (например, (АА)_x, [(AA)_x]_z или L), линейная или разветвленная цепь гидрофильного полимера выбрана независимо друг от друга из полиэтиленгликоля (ПЭГ), поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида, поли-2-(метакрилоилокси)этилфосфорилхолинов, поли(гидроксиалкил-L-аспарагина), поли(2-(метакрилоилокси)этилфосфорилхолина), гидроксиэтилкрахмала или поли(гидроксиалкил-L-глутамина), где гидрофильная полимерная цепь имеет молекулярную массу примерно от 1 кДа до примерно 100 кДа, предпочтительно примерно от 2 кДа до примерно 25 кДа, или более предпочтительно примерно от 2 кДа до примерно 10 кДа, например, от 5 кДа до примерно 25 кДа или от 5 кДа до примерно 10 кДа;

Р² является катионным или поликатионным пептидом или белком и предпочтительно его длина составляет примерно от 3 до примерно 50 аминокислот, еще более предпочтительно примерно от 3 до примерно 25 аминокислот, например, примерно от 3 до 10, от 5 до 15, от 10 до 20 или от 15 до 25 аминокислот, более предпочтительно длина составляет примерно от 5 до примерно 20, еще более предпочтительно примерно от 10 до примерно 20;

является катионным или поликатионным полимером с молекулярной массой примерно от 0,5 кДа до примерно 30 кДа, в том числе с молекулярной массой примерно от 1 кДа до примерно 20 кДа, еще более предпочтительно примерно от 1,5 кДа до примерно 10 кДа, или молекулярная масса составляет примерно от 0,5 кДа до примерно 100 кДа, включая молекулярную массу примерно от 10 кДа до примерно 50 кДа, еще более предпочтительно примерно от 10 кДа до примерно 30 кДа;

каждый компонент Р², обладающий по меньшей мере двумя частями молекулы SH-, способен сформировать дисульфидную связь при конденсации с другими компонентами Р² или компонентом (компонентами) Р¹ и/или Р³, или в другом варианте с другими компонентами (например, (АА)_x, или [(AA)_x]_z)

«-S-S-» означает (обратимую) дисульфидную связь (квадратные скобки опускают, чтобы было понятнее), где S предпочтительно означает серу или -SH-несущую часть молекулы, которая сформировала (обратимую) дисульфидную связь. (Обратимая) дисульфидная связь предпочтительно формируется путем конденсации -SH-частей молекулы или компонентов Р¹ и Р², Р² и Р² или Р² и Р³, или необязательно дополнительных компонентов, описанных в настоящем изобретении (например, L, (АА)_x, [(AA)_x]_z, и т.д.); -SH-часть молекулы может быть частью структуры этих компонентов или ее добавляют путем модификации согласно описанному ниже;

«L» означает дополнительный лиганд, который может иметься или отсутствовать и может быть выбран независимо от других компонентов из RGD, трансферрина, фолата, сигнального пептида или сигнальной последовательности, сигнала или последовательности локализации, сигнала или последовательности ядерной локализации (nuclear localization signal sequence -NLS), антитела, проникающего в клетку пептида (например, ТАТ или KALA), лиганда рецептора (например, цитокина, гормонов, факторов роста и т.д.), низкомолекулярных соединений (например, углеводов, маннозы, или галактозы, или синтетических лигандов), низкомолекулярных агонистов, ингибиторов или антагонистов рецепторов (например, аналогов пептидомиметиков RGD) и т.д.;

«n» означает целое число, обычно выбранное из диапазона примерно от 1 до 50, предпочтительно из диапазона примерно от 1, 2 или 3 до 30, более предпочтительно из диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 25, или из диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 20, или из диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 15, или из диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 10, включая, например, диапазон примерно от 4 до 9, от 4 до 10, от 3 до 20, от 4 до 20, от 5 до 20, или от 10 до 20, или диапазон примерно от 3 до 15, от 4 до 15, от 5 до 15, или от 10 до 15, или диапазон примерно от 6 до 11 или от 7 до 10. Наиболее предпочтительно n находится в диапазоне примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 10, более предпочтительно в диапазоне примерно от 1, 2, 3 или 4 до 9, в диапазоне примерно от 1, 2, 3 или 4 до 8, или в диапазоне примерно от 1, 2 или 3 до 7.

Молекулу обладающего признаками изобретения полимерного носителя общей формулы (I) получают с помощью новой стратегии синтеза и преимущественно позволяет устанавливать длину полимерной цепи и для комбинирования требуемых свойств разных (коротких) полимеров в одном полимере, например, для эффективной компановки нуклеиновые кислоты с целью эффективной трансфекции нуклеиновых кислот для генной терапии или других терапевтических применений без потери активности, особенно эффективной трансфекции нуклеиновой кислоты в разные линии клеток in vitro, а также трансфекции in vivo. Молекула обладающего признаками изобретения полимерного носителя, кроме того, является нетоксичной для клеток и обеспечивает эффективное высвобождение своего груза нуклеиновой кислоты. В итоге, она показывает улучшенную устойчивость к агломерации из-за обратимого добавления гидрофильных полимерных цепей (например, ПЭГ-мономеров) особенно по концам молекулы обладающего признаками изобретения полимерного носителя общей формулы (I), которые дополнительно обусловливают повышенную стабильность груза нуклеиновой кислоты в отношении сред, содержащих сыворотку, и предупреждает распознавание иммунной системой комплекса полимерного носителя с грузом.

Еще более предпочтительно, если молекула обладающего признаками изобретения полимерного носителя общей формулы (I) позволяет существенно варьировать его пептидное или полимерное содержимое и таким образом модулировать его биофизические/биохимические свойства, особенно катионные свойства компонента [S-P²-S]_n, очень легко и быстро, например, путем включения в качестве компонентов Р² тот же или другой катионный пептид (пептиды), белок (белки) или полимер (полимеры) и необязательно добавление других компонентов, например, аминокислотного компонента (компонентов) (АА)_x, в повторяющемся компоненте [S-P²-S] для формирования модифицированного повторяющегося компонента, например, {[S-P²-S]_a/[S-(AA)_\x-S]_b}, в качестве сердцевинного мотива полимерного носителя, обладающего признаками изобретения, (где a+b=n, см. ниже). Даже несмотря на включение чрезвычайно малотоксичных мономерных единиц, молекула обладающего признаками изобретения полимерного носителя формирует катионную связывающую последовательность с установленной длиной цепи, обеспечивая сильную конденсацию груза нуклеиновой кислоты и общую стабильность. В восстанавливающих условиях цитозоля (например, цитозольный глютатион (GSH)) комплекс быстро разрушается на составляющие его мономеры, которые дополнительно разрушаются (например, олигопептиды) или секретируются (например, ПЭГ). Это способствует высвобождению груза нуклеиновой кислоты в цитозоле. Из-за разрушения на малые олигопептиды в цитозоле не наблюдают токсичности, свойственной высокомолекулярным олигопептидам, например, вызванной высокомолекулярным олигоаргинином. ПЭГ-«покрытие» также позволяет каким-либо образом «покрыть» полимерный носитель гидрофильным покрытием по концам, которое предупреждает опосредуемую солями агломерацию и нежелательные взаимодействия с содержимым сыворотки. В цитозоле такое «покрытие» легко удаляется в восстанавливающих условиях клетки. Кроме того, этот эффект индуцирует высвобождение груза нуклеиновой кислоты в цитозоль.

Выше было указано, что лиганды (L) могут необязательно применяться в молекуле полимерного носителя общей формулы (I), обладающей признаками изобретения, например, для направления обладающего признаками изобретения полимерного носителя и его присоединенной нуклеиновой кислоты в определенные клетки. Они могут быть выбраны независимо друг от друга из RGD, трансферрина, фолата, сигнального пептида или сигнальной последовательности, сигнала или последовательности локализации, сигнала или последовательности ядерной локализации (nuclear localization signal sequence -NLS), антитела, проникающего в клетку пептида (например, ТАТ), лиганда рецептора (например, цитокинов, гормонов, факторов роста и т.д.), низкомолекулярных соединений (например, углеводов, например, маннозы, или галактозы, или синтетических лигандов), низкомолекулярных агонистов, ингибиторов или антагонистов рецепторов (например, аналогов пептидомиметиков RGD) и т.д. Особенно предпочтительной в этом контексте является манноза в качестве лиганда для нацеливания на антиген-презентирующие клетки, которые несут на своей клеточной мембране рецепторы маннозы. В другом предпочтительном объекте первого варианта осуществления настоящего изобретения может применяться галактоза в качестве необязательного лиганда для гепатоцитов-мишеней. Такие лиганды могут быть присоединены к компоненту Р¹ и/или Р³ с помощью обратимых дисульфидных связей, согласно указанному ниже, или путем другого возможного химического присоединения, например, за счет формирования амида (например, карбоновых кислот, сульфоновых кислот, аминов и т.д.), реакцией Михаэля (например, малеинимидных частей молекулы, αβ-ненасыщенных карбонилов и т.д.), методом click-химии (например, азидов или алкинов), перемещением алкенов/алкинов (например, алкенов или алкинов), формированием имина или гидрозона (альдегидов или кетонов, гидразинов, гидроксиламинов, аминов), реакциями комплексообразования (с авидином, биотином, белком G) или компонентами, которые допускают реакции замещения S_n-THna (например, галогеналканами, тиолами, спиртами, аминами, гидразинами, гидразидами, эфирами сульфоновых кислот, солями оксифосфония) или другими химическими частями молекулы, которые могут применяться для присоединения дополнительных компонентов.

В составе формулы (I) настоящего изобретения компоненты Р¹ и Р³ представляют линейную и разветвленную гидрофильную полимерную цепь, содержащую по меньшей мере одну -SH-часть молекулы, каждый из компонентов Р¹ и Р³ выбран независимо друг от друга, например, из полиэтиленгликоля (ПЭГ), поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида, поли-2-(метакрилоилокси)этилфосфорилхолинов, поли(гидроксиалкил L-аспарагина) или поли(гидроксиалкил L-глутамина). Компоненты Р¹ и Р³ могут быть одинаковыми или раз