Нейтрализующие антитела против вируса гриппа а и их использование

Нейтрализующие антитела против вируса гриппа а и их использование

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная заявка претендует на приоритет временных заявок США №№61/083838 и 61/181582, поданных 25 июля 2008 г., и 27 мая 2009 г., соответственно, описания которых настоящим целиком включены сюда в качестве ссылок.

Уровень техники

Считается, что иммунный ответ на вирус гриппа А с образованием нейтрализующих антител является специфическим по отношению к данному вирусному субтипу. Существует 16 субтипов гриппа А, определяемых их гемагглютининами (ГА). Эти 16 ГА, Н1-Н16, могут быть разделены на две группы. Группа 1 состоит из субтипов Н1, Н2, Н5, Н6, Н8, Н9, Н11, Н12, Н13 и Н16, и группа 2 включает субтипы Н3, Н4, Н7, Н10, Н14 и Н15. Хотя все субтипы присутствуют у птиц, болезнь у людей вызывают преимущественно субтипы Н1, Н2 и Н3. Субтипы Н5, Н7 и Н9 вызывают спорадические тяжелые инфекции у людей и могут вызвать новую пандемию. Вирусы Н1 и Н3 непрерывно эволюционируют, образуя новые варианты, в результате явления, называемого антигенным дрейфом. Вследствие этого, антитела, продуцируемые в ответ на предшествующие варианты вирусов, плохо или совсем не защищают от новых дрейфовых вариантов вирусов. Это приводит к тому, что каждый год необходимо готовить новую вакцину против вирусов Н1 и Н3, появление которых прогнозируется, что является очень дорогостоящим процессом, а также не всегда эффективным. То же самое относится к производству вакцины гриппа Н5. Действительно, точно не известно, будут ли современные вакцины Н5 на основе вьетнамских или индонезийских изолятов вируса гриппа А защищать против будущей пандемии вируса Н5.

По этим причинам было бы очень желательно создать вакцину, которая индуцирует нейтрализующие антитела широкого спектра действия, способные нейтрализовать все субтипы вируса гриппа А, а также их ежегодные варианты (обзор Gerhard et al., 2006). Кроме того нейтрализующие гетеросубтиповые антитела широкого спектра действия могут быть использованы по профилактическому или терапевтическому назначению.

Антитела, распознающие вирус гриппа А, были охарактеризованы. Антитела к М2 (инвариантный малый белок, экспрессируемый инфицированными клетками, но не вызывающими инфекцию вирусами) продемонстрировали некоторый защитный эффект in vivo, возможно, путем превращения инфицированных клеток в мишени для разрушения NK-клетками (природными клетками-киллерами) или цитотоксичными Т-клетками. Однако основной мишенью нейтрализующих антител является ГА. Он содержит большой эктодомен из ок.500 аминокислот, который расщепляется ферментами хозяина с образованием 2 полипептидов, остающихся связанными дисульфидной связью. Более крупный N-концевой фрагмент (НА1, 320-330 аминокислот) образует удаленный от мембраны глобулярный домен, который содержит рецепторсвязывающий сайт и большинство детерминант, распознаваемых нейтрализующими вирус антителами. Меньший по размеру C-концевой участок (НА2, ок.180 аминокислот) образует стеблеобразную структуру, с помощью которой глобулярный домен крепится к клеточной или вирусной мембране. Степень гомологии последовательностей между субтипами у полипептидов НА1 меньше (34-59% гомологии между субтипами), чем у полипептида НА2 (51-80% гомологии). Наиболее консервативной областью является последовательность вокруг места расщепления, особенно N-концевые 11 аминокислот НА2, называемые пептидом слияния, который является консервативным для всех субтипов вируса гриппа А. Часть этой области выходит на поверхность в виде петли в молекуле-прекурсоре ГА (НА0), но становится недоступной после расщепления НА0 на НА1/НА2. Таким образом, существуют консервативные участки в разных субтипах ГА, особенно, в соединительном участке НА1-НА2 и в области НА2. Однако такие участки могут быть малодоступными для нейтрализующих антител.

Был достигнут лишь ограниченный успех в идентификации антител, которые нейтрализуют более одного субтипа вируса гриппа А, и их спектр нейтрализации является узким, а их активность - низкой. Okuno et al. иммунизировали мышей вирусом гриппа A/Okuda/57 (H2N2) и выделяли моноклональное антитело (С179), которое связывается с консервативным конформационным эпитопом в НА2 и нейтрализует субтипы Н2, Н1 и Н5 группы 1 вирусов гриппа A in vitro и in vivo на животных моделях (Okuno et al., 1993; Smirnov et al., 1999; Smirnov et al., 2000).

Недавно, Gioia et al. описали присутствие антител, нейтрализующих вирус H5N1, в сыворотке некоторых особ, которым была введена обычная сезонная вакцина против гриппа. (Gioia et al., 2008). Авторы выдвинули предположение, что нейтрализующая активность может быть вызвана антителами к нейраминидазе (N1). Однако, моноклональные антитела не были выделены и эпитопы-мишени не были охарактеризованы. Неясно, нейтрализуют ли антитела сыворотки другие субтипы вируса гриппа А.

Несмотря на десятилетия исследований, на рынке нет антител, которые бы нейтрализовали или ингибировали инфекцию вируса гриппа А с широким спектром действия или ослабляли болезнь, вызванную вирусом гриппа А. Таким образом, существует необходимость в идентификации новых антител, которые защищали бы против множественных субтипов вируса гриппа А.

Сущность изобретения

Данное изобретение основано, частично, на выделении у особ, вакцинированных сезонной вакциной против гриппа, природных моноклональных антител человека, которые связываются с НА и нейтрализуют инфекцию нескольких субтипов вируса гриппа А, а также новых эпитопов, с которыми связываются антитела по изобретению. Соответственно, в одном аспекте изобретения, изобретение предусматривает антитело и его антигенсвязывающие фрагменты, которые нейтрализуют инфекцию нескольких субтипов вируса гриппа А, выбранных из субтипов группы 1 и группы 2.

В одном варианте исполнения изобретения, изобретение предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые нейтрализуют инфекцию субтипа группы 1 и субтипа группы 2 вируса гриппа А. В другом варианте исполнения изобретения, изобретение предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие по меньшей мере одну последовательность участка, определяющего комплементарность (CDR), имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с любым одним из SEQ ID NO:1-6 или 17-22, причем антитело нейтрализует вирус гриппа А.

В еще одном варианте исполнения изобретения, изобретение предусматривает CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:17; CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:18; и CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:19, причем антитело нейтрализует вирус гриппа А. В еще одном варианте исполнения изобретения, изобретение предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:20; CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:21; и CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:22, причем антитело нейтрализует вирус гриппа А.

В еще одном варианте исполнения изобретения, изобретение предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14; или вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14; или вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30; или вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:35, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30, причем антитело нейтрализует вирус гриппа А. Изобретение далее предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело представляет собой вариант 1 FI6 или вариант 2 FI6.

В еще одном варианте исполнения изобретения, изобретение предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые нейтрализуют инфекцию субтипа группы 1 и субтипа группы 2 вируса гриппа А, где антитело или его фрагмент экспрессируются иммортализованным клоном В-клеток.

В другом аспекте, изобретение предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую полинуклеотид, кодирующий антитело или фрагмент антитела по изобретению. В еще одном аспекте, изобретение предусматривает вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению или клетку, экспрессирующую антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент. В еще одном аспекте, изобретение предусматривает выделенный или очищенный иммуногенный полипептид, содержащий эпитоп, который связывается с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по изобретению.

Изобретение далее предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент, молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, клетку, экспрессирующую антитело или фрагмент антитела по изобретению, или иммуногенный полипептид по изобретению, и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель. Изобретение также предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где первое антитело представляет собой антитело по изобретению и второе антитело представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые нейтрализуют инфекцию вируса гриппа А.

Также предусматривается, что использование антитела по изобретению, или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты по изобретению, вектора, содержащего нуклеиновую кислоту по изобретению, клетки, экспрессирующей вектор по изобретению, выделенного или очищенного иммуногенного полипептида, содержащего эпитоп, который связывается с антителом или фрагментом антитела по изобретению, или фармацевтической композиции по изобретению (i) в производстве лекарственного средства для лечения инфекции вируса гриппа A, (ii) в вакцине, или (iii) в диагностике инфекции вируса гриппа А, входит в объем изобретения. Кроме того, предусматривается также, что использование антитела по изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента для контроля качества вакцин против вируса гриппа А путем проверки того, чтобы антиген указанной вакцины содержал специфический эпитоп в правильной конформации, входит в объем изобретения.

В другом аспекте, изобретение предусматривает способ ослабления инфекции вируса гриппа А или снижения риска инфекции вируса гриппа А, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по изобретению.

В другом аспекте, изобретение предусматривает эпитоп, который специфически связывается с антителом по изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом, предназначенный для использования (i) в терапии, (ii) в производстве лекарственного средства для лечения инфекции вируса гриппа A, (iii) в качестве вакцины, или (iv) при скрининге лигандов, способных нейтрализовать инфекцию вируса гриппа А.

Детальное описание изобретения

Изобретение основано, частично, на открытии и выделении у особ, которые были вакцинированы сезонной вакциной против гриппа А, природных антител человека, нейтрализующих, с широким спектром, действия вирус гриппа А разных субтипов, а также новых эпитопов, с которыми связываются антитела по изобретению. Такие антитела являются желательными, поскольку для нейтрализации разных субтипов вируса гриппа А потребуется только одно или несколько антител. Кроме того, эпитопы, распознаваемые такими антителами, могут быть частью вакцины, способной индуцировать широкое защитное действие против как сезонных, так и возможных пандемичных изолятов разных субтипов.

Соответственно, в одном аспекте, изобретение предусматривает антитело и его антигенсвязывающие фрагменты, которые нейтрализуют по меньшей мере два вируса гриппа А в субтипах группы 1 и группы 2. В одном варианте исполнения, изобретение предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые нейтрализуют инфекцию вируса гриппа А субтипа группы 1 и субтипа группы 2.

В другом аспекте изобретения, оно предусматривает нейтрализующее антитело и его антигенсвязывающие фрагменты, обладающие широкой специфичностью против ГА разных субтипов вируса гриппа А. В одном варианте исполнения, антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению специфически связываются с эпитопом в области стебля ГА, являющимся консервативным для двух или более субтипов вируса гриппа А, выбранных из группы 1 и группы 2. В другом варианте исполнения, антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению специфически связываются с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:37, 38, 39 или 40.

Моноклональные антитела человека, иммортализованные клоны В-клеток или трансфицированные клетки-хозяева, которые секретируют антитела по изобретению, и нуклеиновая кислота, кодирующая антитела по изобретению также включены в объем изобретения.

В используемом тут значении, термины "антигенсвязывающий фрагмент", "фрагмент" и "фрагмент антитела" используются взаимозаменяемо для обозначения любого фрагмента антитела по изобретению, который сохраняет антигенсвязывающую активность антитела. Типичные примеры фрагментов антител включают, без ограничений, одноцепочечное антитело, Fab, Fab', F(ab')2, Fv или scFv. Термин "антитело", в используемом тут значении, включает как антитела, так и их антигенсвязывающие фрагменты.

В используемом тут значении, термин "широкая специфичность" используется для описания антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, которые могут связываться с и/или нейтрализовать один или несколько субтипов группы 1 и один или несколько субтипов группы 2 вируса гриппа А.

В используемом тут значении, "нейтрализующее антитело" представляет собой антитело, которое может нейтрализовать, т.е., предупреждать, ингибировать, ослаблять, затруднять или препятствовать способности патогена инициировать и/или поддерживать инфекцию хозяина. Термины "нейтрализующее антитело" и "антитело, которое нейтрализует" или "антитела, которые нейтрализуют" используются тут взаимозаменяемо. Такие антитела могут быть использованы, сами или в комбинации, в качестве профилактических или терапевтических агентов при соответствующем составлении композиций, в сочетании с активной вакцинацией, в качестве диагностического инструмента или в качестве производственного инструмента, как описано тут.

Антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению нейтрализуют один или несколько субтипов вируса гриппа А из группы 1 (Н1, Н2, Н5, Н6, Н8, Н9, НИ, Н12, Н13 и Н16 и их варианты) и один или несколько вирусов гриппа А из группы 2 (Н3, Н4, Н7, Н10, Н14 и Н15 и их варианты). В одном варианте исполнения, типичные примеры субтипов группы 1 включают Н1, Н2, Н5, Н6 и Н9 и типичные примеры субтипов группы 2 включают Н3 и Н7.

Антитело и фрагмент антитела по изобретению способны нейтрализовать различные комбинации субтипов вируса гриппа А. В одном варианте исполнения, антитело может нейтрализовать субтипы Н1 и Н3 вируса гриппа А, или субтипы Н2 и Н3, или субтипы Н3 и Н5, или субтипы Н3 и Н9, или субтипы Н1 и Н7, или субтипы Н2 и Н7, или субтипы Н5 и Н7, или субтипы Н7 и Н9.

В другом варианте исполнения, антитело и фрагмент антитела по изобретению могут нейтрализовать субтипы вируса гриппа А Н1, Н2 и Н3, или субтипы Н1, Н3 и Н5, или субтипы Н1, Н3 и Н9, или субтипы Н2, H3 и Н5, или субтипы Н2, H3 и Н9, или субтипы H3, Н5 и Н9, или субтипы Н1, Н2 и Н7, или субтипы Н1, Н5 и Н7, или субтипы Н1, Н7 и Н9, или субтипы Н2, Н5 и Н7, или субтипы Н2, Н7 и Н9, или субтипы Н5, Н7 и Н9, или субтипы Н1, H3 и Н7, или субтипы Н2, H3 и Н7, или субтипы H3, Н5 и Н7, или субтипы H3, Н7 и Н9.

В еще одном варианте исполнения, антитело может нейтрализовать субтипы вируса гриппа А Н1, Н2, H3 и Н7, или субтипы Н1, H3, Н5 и Н7, или субтипы Н1, H3, Н7 и Н9, или субтипы Н2, H3, Н5 и Н7, или субтипы Н2, H3, Н7 и Н9, или субтипы H3, Н5, Н7 и Н9 или субтипы Н1, Н2, H3 и Н5, или субтипы Н1, Н2, H3 и Н9, или субтипы Н1, H3, Н5 и Н9, или субтипы Н2, H3, Н5 и Н9, или субтипы Н1, Н2, Н5 и Н7, или субтипы Н1, Н2, Н7 и Н9, или субтипы Н1, Н5, Н7 и Н9, или субтипы Н2, Н5, Н7 и Н9.

В еще одном варианте исполнения, антитело по изобретению может нейтрализовать субтипы вируса гриппа А Н1, Н2, H3, Н5 и Н7, или субтипы Н1, Н2, H3, Н7 и Н9, или субтипы Н1, H3, Н5, Н7 и Н9, или субтипы Н2, H3, Н5, Н7 и Н9, или субтипы Н1, Н2, H3, Н5 и Н9, или субтипы Н1, Н2, Н5, Н7 и Н9, или субтипы Н1, Н2, H3, Н5, Н7 и Н9. В еще одном варианте исполнения, антитело и антигенсвязывающие фрагменты по изобретению нейтрализуют одну или несколько вышеуказанных комбинаций в дополнении к нейтрализации субтипа Н6 вируса гриппа А.

Антитело и антигенсвязывающий фрагмент по изобретению обладают высокой нейтрализующей активностью. Концентрация антитела по изобретению, необходимая для 50% нейтрализации вируса гриппа А, может составлять, например, примерно 50 мкг/мл или меньше. В одном варианте исполнения, концентрация антитела по изобретению, необходимая для 50% нейтрализации вируса гриппа А, составляет примерно 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 17,5, 15, 12,5, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5 или примерно 1 мкг/мл или меньше. В другом варианте исполнения, концентрация антитела по изобретению, необходимая для 50% нейтрализации вируса гриппа А, составляет примерно 0,9, 0,8, 0,75, 0,7, 0,65, 0,6, 0,55, 0,5, 0,45, 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,075, 0,05, 0,04, 0,03, 0,02, 0,01, 0,008, 0,006, 0,004, 0,003, 0,002 или примерно 0,001 мкг/мл или меньше. Это означает, что лишь низкие концентрации антитела будут необходимы для 50% нейтрализации вируса гриппа А. Специфичность и активность могут быть измерены с использованием стандартного анализа нейтрализации, известного квалифицированным специалистам.

Антитела по изобретению

Изобретение предусматривает антитело, обладающее особенно широкой специфичностью к ГА, которое нейтрализует один или несколько субтипов вируса гриппа А из группы 1 и один или несколько субтипов вируса гриппа А из группы 2. Антитело по изобретению связывается с эпитопом в области ГА, являющейся консервативной для двух или более субтипов вируса гриппа А, выбранных из группы 1 и группы 2.

В одном варианте исполнения, изобретение предусматривает антитело, например, выделенное антитело или очищенное антитело, которые специфически связываются с консервативным эпитопом в области стебля ГА субтипов вируса гриппа А группы 1 и группы 2 и препятствуют вирусной репликации или распространению. Изобретение также предусматривает антитело, например, выделенное антитело или очищенное антитело, которое специфически связывается с консервативным эпитопом в области стебля ГА субтипов группы 1 и группы 2 и ингибирует проникновение вируса в клетку. Без ограничений какой-либо теорией, в типичном варианте исполнения антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению связываются с консервативным эпитопом в области стебля вируса гриппа А и ингибируют проникновение вируса в клетку путем препятствования стадии слияния. Эпитоп или антигенная детерминанта белка соответствует тем частям молекулы, которые специфически распознаются связывающим сайтом (или паратопом) антитела. Эпитопы, таким образом, представляют собой родственные структуры, которые нуждаются в комплементарных паратопах для их функционального распознавания. Эпитоп, консервативный для разных вариантов белка, означает, что один и тот же паратоп может специфически распознавать такие разные варианты путем вхождения в контакт с одинаковыми частями молекул.

Антитела по изобретению могут быть моноклональными, например, моноклональными антителами человека, или рекомбинантными антителами. Изобретение также предусматривает фрагменты антител по изобретению, особенно фрагменты, которые сохраняют антигенсвязывающую активность антител. Хотя описание, включая формулу изобретения, может, в некоторых местах, недвузначно указывать на антигенсвязывающий фрагмент(ы), фрагмент(ы) антитела, вариант(ы) и/или производное (производные) антител, подразумевается, что термин "антитело" или "антитело по изобретению" включает все категории антител, а именно, антигенсвязывающий фрагмент(ы), фрагмент(ы) антитела, вариант(ы) и производное (производные) антител.

В одном варианте исполнения, антитела и фрагменты антител по изобретению нейтрализуют комбинацию двух или больше субтипов вируса гриппа А группы 1 и группы 2. Типичные примеры субтипов вируса гриппа А включают, без ограничений, H5N1 (A/Vietnam/1203/04), H1N1 (A/New Caledonia/20/99), H1N1 (A/Salomon lsland/3/2006), H3N2 (A/Wyoming/3/03) и H9N2 (A/chicken/Hong Kong/G9/97). В другом варианте исполнения, антитела нейтрализуют и/или являются специфическими по отношению к комбинации 3, 4, 5, 6, 7 или больше субтипов группы 1 и группы 2 вируса гриппа А.

В типичном варианте исполнения, изобретение предусматривает антитело или фрагмент антитела, являющиеся специфическими по отношению к субтипам вируса гриппа А Н1 и H3 (например H1N1 и H3N2); или Н1, H3, Н5 и Н9 (например H1N1, H3N2, H5N1 и H9N2). В еще одном варианте исполнения, антитело или фрагменты антител являются специфическими по отношению к Н1, H3, Н5, Н7 и Н9 (например, H1N1, H3N2, H5N1, H7N1, H7N7, H9N2). Другие типичные примеры комбинаций субтипов вируса гриппа А приведены ранее в заявке.

Номера SEQ ID аминокислотных последовательностей вариабельных участков тяжелой цепи (V_H) и вариабельных участков легкой цепи (V_L) типичных примеров антител по изобретению, а также номера SEQ ID кодирующих их последовательностей нуклеиновых кислот приведены в Таблице 1.

Таблица 1.
Номера SEQ ID полипептидов и полинуклеотидов VH и VL для типичных примеров антител, нейтрализующих вирус гриппа А
	SEQ ID NO полипептидов и полинуклеотидов VH и VL
	VH Полипептид	VL Полипептид	VH Полинуклеотид	VL Полинуклеотид

Вариант 1 FI6	13	14	15	16
Вариант 2 FI6	33	14	34	16
Вариант 1 FI28	29	30	31	32
Вариант 2 FI28	35	30	36	32

В одном варианте исполнения, антитело или фрагмент антитела по изобретению предусматривает вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, примерно на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO:13, 33, 29 или 35. В другом варианте исполнения, антитело или фрагмент антитела по изобретению предусматривает вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, примерно на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную последовательности, приведенной в SEQ ID NO:14 или 30.

В еще одном варианте исполнения, вариабельный участок тяжелой цепи антитела по изобретению может кодироваться нуклеиновой кислотой, имеющей последовательность, примерно на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO:15, 34, 31 или 36. В еще одном варианте исполнения, вариабельный участок легкой цепи антитела по изобретению может кодироваться нуклеиновой кислотой, имеющей последовательность, примерно на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную последовательности, приведенной в SEQ ID NO:16 или 32.

CDR тяжелых цепей антитела обозначены CDRH1, CDRH2 и CDRH3, соответственно. Аналогично, CDR легких цепей антитела обозначены CDRL1, CDRL2 и CDRL3, соответственно. Положения аминокислот CDR определяются в соответствии с системой нумерации IMGT следующим образом: CDR1 - положения 27-38 по IMGT, CDR2 - положения 56-65 по IMGT и CDR3 - положения 105-117 по IMGT.

В Таблице 2 приведены номера SEQ ID аминокислотных последовательностей шести CDR тяжелых и легких цепей, соответственно, для типичных примеров антитела по изобретению.

Таблица 2.
Номера SEQ ID полипептидов CDR типичных примеров антител, нейтрализующих вирус гриппа А
	SEQ ID NO. полипептидов CDR
	CDRH1	CDRH2	CDRH3	CDRL1	CDRL2	CDRL3
Вариант 1 FI6	1	2	3	4	5	6
Вариант 2 FI6	1	2	3	4	5	6
Вариант 1 FI28	17	18	19	20	21	22
Вариант 2 FI28	17	18	19	20	21	22

В одном варианте исполнения, антитело или фрагмент антитела по изобретению предусматривает по меньшей мере один CDR с последовательностью, имеющей по меньшей мере 95% идентичности последовательности с любым одним из SEQ ID NO:1-6 или 17-22.

В другом варианте исполнения, изобретение предусматривает антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую один или несколько (т.е. один, два или все три) CDR тяжелой цепи из варианта 1 FI6, варианта 2 FI6, варианта 1 FI28 или варианта 2 FI28. В типичном варианте исполнения, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению предусматривают CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:17; CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:18; и CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:19. В определенных вариантах исполнения, антитело или фрагмент антитела, предусматриваемые тут, содержат тяжелую цепь, содержащую (i) SEQ ID NO:1 в качестве CDRH1, SEQ ID NO:2 в качестве CDRH2 и SEQ ID NO:3 в качестве CDRH3, или (ii) SEQ ID NO:17 в качестве CDRH1, SEQ ID NO:18 в качестве CDRH2 и SEQ ID NO:19 в качестве CDRH3.

Также предусматривается антитело, содержащее легкую цепь, содержащую один или несколько (т.е. один, два или все три) CDR легкой цепи из варианта 1 FI6, варианта 2 FI6, варианта 1 FI28 или варианта 2 FI28, В типичном варианте исполнения, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению предусматривают CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:20; CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:21; и CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:22. В определенных вариантах исполнения, предусматриваемое тут антитело содержит легкую цепь, содержащую (i) SEQ ID NO:4 в качестве CDRL1, SEQ ID NO:5 в качестве CDRL2 и SEQ ID NO:6 в качестве CDRL3, или (ii) SEQ ID NO:20 в качестве CDRL1, SEQ ID NO:21 в качестве CDRL2 и SEQ ID NO:22 в качестве CDRL3.

В одном варианте исполнения, антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержат все CDR варианта 1 антитела FI6, указанные в Таблице 2, и нейтрализуют инфекцию вируса гриппа А. В другом варианте исполнения, антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержат все CDR варианта 2 антитела FI6, указанные в Таблице 2, и нейтрализуют инфекцию вируса гриппа А. В еще одном варианте исполнения, антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержат все CDR варианта 1 антитела FI28, указанные в Таблице 2, и нейтрализуют инфекцию вируса гриппа А. В еще одном варианте исполнения, антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержат все CDR варианта 2 антитела FI28, указанные в Таблице 2, и нейтрализуют инфекцию вируса гриппа А.

Типичные примеры антител по изобретению включают, без ограничений, вариант 1 FI6, вариант 2 FI6, вариант 1 FI28 или вариант 2 FI28.

Изобретение далее предусматривает антитело, или его фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом, что и антитело по изобретению, или антитело, конкурирующее с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по изобретению.

Антитела по изобретению также включают гибридные молекулы антитела, содержащие один или несколько CDR из антитела по изобретению и один или несколько CDR из другого антитела к этому же эпитопу. В одном варианте исполнения, такие гибридные антитела содержат три CDR из антитела по изобретению и три CDR из другого антитела к этому же эпитопу. Типичные примеры гибридных антител включают i) три CDR легкой цепи из антитела по изобретению и три CDR тяжелой цепи из другого антитела к этому же эпитопу, или ii) три CDR тяжелой цепи из антитела по изобретению и три CDR легкой цепи из другого антитела к этому же эпитопу.

Варианты антител также включены в объем изобретения. Таким образом, варианты последовательностей, указанные в заявке, также включены в объем изобретения. Такие варианты включают природные варианты, образующиеся в результате соматической мутации in vivo при иммунном ответе или in vitro при культивировании иммортализованных клонов В-клеток. Альтернативно, варианты могут возникать вследствие вырожденности генетического кода, как было указано выше, или могут продуцироваться в результате ошибок транскрипции или трансляции.

Дополнительные варианты последовательностей антител, обладающих повышенной аффинностью и/или активностью, могут быть получены с использованием способов, известных специалистам, и включены в объем изобретения. Например, замещения аминокислот могут быть использованы для получения антител с дополнительно повышенной аффинностью. Альтернативно, оптимизация кодонов нуклеотидной последовательности может быть использована для повышения эффективности трансляции в системах экспрессии для продуцирования антитела. Кроме того, полинуклеотиды, содержащие последовательности, оптимизированные по специфичности или нейтрализующей активности антитела путем применения способа напрвленной эволюции к любой из последовательностей нуклеиновой кислоты по изобретению, также входят в объем изобретения.

В одном варианте исполнения, последовательности вариантов антител могут иметь 70% или больше (т.е. 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или больше) идентичности аминокислотной последовательности с последовательностями, указанными в заявке. В некоторых вариантах исполнения, такая идентичность последовательностей рассчитывается по отношению к полной длине референсной последовательности (т.е. последовательности, указанной в заявке). В некоторых дополнительных вариантах исполнения, процент идентичности, указываемый тут, рассчитывается с помощью BLAST версии 2.1.3 с использованием параметров по умолчанию, определенных NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [матрица Blosum 62; штраф за открытие пробела=11 и штраф за продолжение пробела=1].

В другом аспекте, изобретение также включает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие часть или все легкие и тяжелые цепи и CDR антител по настоящему изобретению. Предусматриваются последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие часть или все легкие и тяжелые цепи и CDR типичных примеров антител по изобретению. В Таблице 1 приведены номера SEQ ID для последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих вариабельные участки тяжелой цепи и легкой цепи типичных примеров антител по изобретению. Например, предусматриваемые тут последовательности нуклеиновой кислоты включают SEQ ID NO:15 (кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи варианта 1 FI6), SEQ ID NO:34 (кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи варианта 2 FI6), SEQ ID NO:16 (кодирующую вариабельный участок легкой цепи варианта 1 FI6 и варианта 2 FI6), SEQ ID NO:31 (кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи варианта 1 FI28); SEQ ID NO:36 (кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи варианта 2 FI28) и SEQ ID NO:32 (кодирующую вариабельный участок легкой цепи варианта 1 и варианта 2 FI28).

В Таблице 3 приведены номера SEQ ID для последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих CDR типичных примеров антител по изобретению. Вследствие избыточности генетического кода, будут существовать варианты таких последовательностей, которые кодируют те же самые аминокислотные последовательности.

Таблице 3.
Номера SEQ ID полинуклеотидов CDR типичных примеров антител, нейтрализующих вирус гриппа А
	SEQ ID NO полинуклеотидов CDR
	CDRH1	CDRH2	CDRH3	CDRL1	CDRL2	CDRL3
Вариант 1 FI6	7	8	9	10	11	12
Вариант 2 FI6	7	8	9	10	11	12
Вариант 1 FI28	23	24	25	26	27	28
Вариант 2 FI28	23	24	25	26	27	28

В одном варианте исполнения, последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением включают последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% идентичности с нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую или легкую цепь антитела по изобретению. В другом варианте исполнения, последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению имеет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую или легкую цепь CDR антитела по изобретению. Например, последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением предусматривает последовательность, являющуюся по меньшей мере на 75% идентичной с последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:7-12, 15, 16, 34, 23-28, 31, 32 или 36.

В объем изобретения дополнительно включены векторы, например, векторы экспрессии, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением. Клетки, трансформированные такими векторами, также включены в объем изобретения. Примеры таких клеток включают, без ограничений, эукариотические клетки, например, дрожжевые клетки, животные клетки или растительные клетки. В одном варианте исполнения, клетки принадлежат млекопитающему, например, клетки человека, СНО, HEK293T, PER.C6, NS0, миеломы или гибридомы.

Изобретение также относится к моноклональным антителам, которые связываются с эпитопом, способным связывать антитела по изобретению, включая, без ограничений, моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из варианта 1 FI6, варианта 2 FI6, варианта 1 FI28 и варианта 2 FI28.

Моноклональные и рекомбинантные антитела являются особенно пригодными для идентификации и очистки индивидуальных полипептидов или других антигенов, против которых они направлены. Антитела по изобретению дополнительно полезны тем, что они могут быть использованы в качестве реагентов для иммунологических анализов, радиоиммунологических анализов (RIA) или твердофазовых иммуноферментных анализов (ELISA). Для такого применения, антитела могут быть мечеными аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент. Антитела также могут быть использованы для молекулярной идентификации и характеризации (картирования эпитопов) антигенов.

Антитела по изобретению могут быть сцеплены с лекарственным препаратом для доставки к месту лечения или сцеплены с детектируемой меткой для облегчения визуализации участка, содержащего представляющие интерес клетки, такие как клетки, инфицированные вирусом гриппа А. Методы сцепления антител с лекарственными средствами и детектируемыми метками хорошо известны специалистам, так же как и методы визуализации с использованием детектируемых меток. Меченые антитела могут быть использованы для проведения различных анализов с использованием разнообразных меток. Детектированию образования комплекса антитело-антиген между антителом по изобретению и представляющим интерес эпитопом (эпитоп вируса гриппа А) может способствовать присоединение детектируемого вещества к антителу. Пригодные средства детектирования включают использование меток, таких как радионуклиды, ферменты, коферменты, люминофоры, хемилюминофоры, хромогены, субстраты или кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов, комплексы простетических групп, свободные радикалы, частицы, красители и т.п. Примеры пригодных ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры пригодных комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры пригодных флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин; примером люминесцентного материала является люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин; и примеры пригодных радиоактивных материалов включают ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S или ³H. Такие меченые реагенты могут быть использованы в различных хорошо известных анализах, таких как радиоиммунологические анализы, ферментные иммунологические анализы, например, ELISA, флуоресцентные имму