Применение мимотопов для лечения бетта-амилоидозов

Применение мимотопов для лечения бетта-амилоидозов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к применению мимотопов для профилактики, лечения и диагностики заболеваний, обусловленных образованием и(или) агрегацией β-амилоида (β-амилоидозы).

Различные дегенеративные заболевания характеризуются аномальными процессами полимеризации и накопления определенных белков. Так называемые протеинопатии включают неврологические заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона, а также различные системные заболевания, включая амилоидозы. Настоящее изобретение относится к профилактике, лечению и диагностике протеинопатии, обусловленных белками β-амилоида и объединенных термином β-амилоидозы. Самая известная форма β-амилоидозов - болезнь Альцгеймера (БА). Другие примеры включают, но не ограничиваются перечисленным, деменцию с тельцами Леви и деменцию при синдроме Дауна.

Для БА характерно аномальное накопление внеклеточных бляшек амилоида, тесно связанное с обширным астроцитозом и микроглиозом, а также дистрофией и гибелью нейронов. Эти амилоидные бляшки состоят в основном из белков амилоида β (Аβ) - Аβ40 и Аβ42, - получающихся их белка-предшественника амилоида (БПА), который экспрессируется на различных типах клеток нервной системы. Считается, что белки Аβ принимают прямое участие в патогенезе и прогрессировании БА.

В норме БПА подвергается превращениям за счет двух этапов расщепления с образованием известных на сегодняшний день форм Абета × -40/42/43. Первое расщепление происходит под воздействием ферментов 1 и 2, расщепляющих БПА в бета-сайте (ВАСЕ1 и ВАСЕ); второй этап протеолиза осуществляет комплекс гамма-секретазы (обзоры De Strooper et al., J Cell Sci 113 (2000): 1857-1870).

Ферменты ВАСЕ распознают два сайта на N-конце предполагаемого белка Аβ: первое взаимодействие ВАСЕ с БПА ведет к разрезанию последовательности DAEFR (положение 1 в АД) и образованию Abeta 1-Х. Или же ВАСЕ также может разрезать последовательность в будущем положении 11 в Аβ с образованием фрагмента 11-Х, Таким образом, превращения БРА, опосредованные ВАСЕ, ведут к образованию различных форм Аβ, где главным компонентом являются полноразмерные белки Abeta 1-40/42. Активность гамма-секретазы ведет к образованию 3 основных фрагментов: Aβ 1-40/42/43. После образования эти белки подвергаются дальнейшей обработке аминопептидазами с последующим поэтапным разрушением. Эти дальнейшие этапы ведут к образованию других форм, например, Aβ3-40/42 соответственно. У человека в среднем 60-85% материала амилоидных бляшек образовано производными Aβ40/42, которые укорочены на N-конце и часто модифицированы. Относительные количества укороченных с N-конца форм Aβ различаются по уровням Аβ, мутациям и активности ВАСЕ.

Самые часто встречающиеся укороченные формы Аβ - это Аβ3-40/42 и Aβ11-40/42. Оба пептида содержат на М-конце остаток глутамина, который часто превращен ферментами в пироглутамат, с образованием Aβ3 (рЕ) - 40/42 и Aβ11 (рЕ) - 40/42 соответственно. Поскольку аминоконец белков Abeta 3 (рЕ) и 11 (рЕ) блокирован внутренним лактамом, он защищен от протеолитического действия аминопептидаз, отличающихся от специфичных к пироглутамату, и, таким образом, он может оставаться в тканях стабильным.

Самая частая форма модифицированного амилоида, укороченного с N-конца, образуется белком 3 (рЕ) - 40/42, который, как полагают, составляет до 50% всех укороченных форм. Это означает, что на эти изоформы приходится 25-40% всех белков амилоида в головном мозге при БА. Другая часто встречающаяся форма укороченных пептидов Аβ - Аβ11-40/42: Naslund et al. и Huse et al. удалось продемонстрировать, что значимый уровень таких укороченных форм присутствует в головном мозге больных БА, а также у больных с субклинической БА. Кроме того, эти пептиды подвергаются внутримолекулярной дегидратации и образуют стабильные формы (рЕ) с последствиями, схожими с описанными в отношении 3 (рЕ) - 40/42.

Ранее показано, что укороченные и модифицированные пептиды более стабильны в тканях нервной системы, чем полноразмерный Аβ. Кроме того, укороченные с N-конца формы Аβ имеют более выраженные амилоидогенные свойства, чем неизмененные пептиды Аβ, таким образом ускоряя образование бляшек, а также они проявляют нейротоксические свойства при воздействии на нейроны в культуре и экспериментах in vivo. Укороченные формы Аβ можно выявить в диффузных скоплениях Аβ уже на ранних стадиях БА, и они могут участвовать в раннем образовании бляшек, действуя как отдельные «затравки» in vivo.

Имеются убедительные доказательства, что присутствие форм Аβ, укороченных с N-конца, коррелирует с нарастанием тяжести и ранним началом нейродегенерации в спорадических и семейных случаях болезни Альцгеймера, а также у больных с синдромом Дауна. Склонность к агрегации в сочетании с повышенной стабильностью этих пептидов превращают их в потенциально опасный фактор в развитии БА. Анализ больных, страдающих субклинической формой семейной БА или синдромом Дауна, убедительно продемонстрировал, что Aβ 3 (рЕ) - 42 можно выявить на самых ранних стадиях заболевания, также называемых «затравочными» стадиями. В это время неврологические симптомы отсутствуют или проявляются в минимальной степени, хотя начинают формироваться бляшки, содержащие формы пептидов Аβ 3 (рЕ) - 42. Таким образом, данные по таким больным предполагают связь между начальным образованием укороченных форм Аβ и началом заболевания, а также его прогрессированием.

В свете этих данных, видимо, важно уменьшить количество таких пептидных форм у больных с БА, чтобы замедлить прогрессирование заболевания, а также снизить токсичность и сопутствующее ухудшение когнитивных функций. Следовательно, оптимальная вакцина против. БА должна вызывать иммунный ответ, который направлен против самых частых форм пептидов Аβ, присутствующих в головном мозге больных с БА.

Фактически иммунотерапия, где использовалась активная и пассивная иммунизация против полноразмерных Аβ, приводила к уменьшению бляшек Аβ и оказывала благоприятное действие в отношении прогрессирования заболевания у экспериментальных животных с моделью БА. Эксперименты на мышах с моделью БА с использованием пассивной иммунизации четко продемонстрировали, что антитела, специфичные к N- и С-концам Аβ 40/42, способны уменьшать объем бляшек в головном мозге и также улучшать когнитивные функции у леченых животных, что следует из анализов поведения. Схожие находки получены в экспериментах с активной иммунизацией, где применяли различные методики индукции иммунного ответа на Аβ 40/42 у мышей. Во всех этих методиках использовали полноразмерные Аβ 40/42 или их фрагменты, содержащие неизмененную последовательность Аβ, ив большинстве случаев наблюдали уменьшение объема бляшек амилоида у трансгенных мышей с моделью БА. Важно, что у этих животных также наблюдали улучшение когнитивных функций. Strikingly, Lemere et al. (Am J Pathol 165 (2004): 283-297) удалось воспроизвести эти результаты у приматов, не относящихся к человекообразным, при этом выявлено четкое уменьшение бляшек и сопутствующих патологических изменений после активной иммунизации против полноразмерного Аβ. Однако первую IIa фазу клинического испытания у больных с БА с использованием полноразмерного Аβ 42 в качестве антигена пришлось прервать из-за тяжелых побочных эффектов, обусловленных воспалением тканей нервной системы, включая инфильтрацию головного мозга аутореактивными Т-лимфоцитами. Тем не менее, исследования, где изучали клинические эффекты у больных, леченых AN-1792, выявили, что у больных, у которых развился антительный ответ на Аβ 42, но не развился менингоэнцефалит, результаты тестов когнитивных функций были лучше, чем у больных, у которых иммунный ответ отсутствовал, что указывает на то, что иммунотерапия может оказаться полезным методом лечения БА.

Очень важно, что недавние результаты, полученные при аутопсии больных, прошедших вакцинацию AN1792, продемонстрировали исчезновение полноразмерных форм Аβ из головного мозга, но формы Аβ, укороченные с N-конца, сохранялись. Этот факт подчеркивает необходимость в изобретении новых вакцин, которые направлены против полноразмерных Аβ, a также форм, укороченных с N-конца, и модифицированных форм этой молекулы.

Индукция иммунного ответа на пептиды Аβ 40/42 у человека может влиять на снижение когнитивных функций у больных с БА, но безопасная вакцина против болезни Альцгеймера не должна вызывать образование аутореактивных Т-лимфоцитов. Вакцинация нативными пептидами Aβ 40/42 или их фрагментами несет риск аутоиммунного заболевания у больных, так как иммунный ответ не может быть направлен исключительно на Аβ.

Цель настоящего изобретения - получение соединений и лекарственных средств, которые можно применять для лечения и(или) профилактики В-амилоидозов, включая болезнь Альцгеймера. Эти соединения не должны нести никакого риска или нести существенно сниженный риск аутоиммунных заболеваний при введении субъекту. Согласно другому аспекту настоящего изобретения, вышеуказанные соединения могут быть способны вызывать in vivo образование антител у субъекта к укороченным и(или) стабилизированным формам Аβ, которые обычно являются главными компонентами отложений амилоида.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению по крайней мере одного соединения, содержащего аминокислотную последовательность

X 1 R X 2 D X 3 ( X 4 ) n ( X 5 ) m ( X 6 ) o                                       ( Ф о р м у л а     I ) ,

где:

X₁ - изолейцин (I) или валин (V),

X₂ - триптофан (W) или тирозин (Y),

Х₃ - треонин (Т), валин (V), аланин (А), метионин (М), глутамин (Q) или глицин (G),

Х₄ - пролин (Р), аланин (А), тирозин (Y), серин (S), цистеин (С) или глицин (G),

Х₅ - пролин (Р), лейцин (L), глицин (G) или цистеин (С),

Х₆ - цистеин (С)

n, m и - независимо друг от друга 0 или 1 причем вышеуказанное соединение обладает связывающей способностью антитела, которое специфично к эпитопу бета-пептида амилоида (Аβ), содержащему аминокислотную последовательность EFRHDSGY и(или) pEFRHDSGY для производства лекарственного средства для профилактики и(или) лечения (3-амилоидозов.

Неожиданно оказалось, что соединение, содержащее аминокислотную последовательность формулы I, способно индуцировать in vivo образование антител, которые направлены против укороченных форм Аβ - Аβ рЕ3 - 40/42 и Аβ3 - 40/42. Образующиеся антитела способны связывать вышеуказанные фрагменты Ар с последующим разрушением бляшек Аβ.

Формула I и II и все другие пептидные молекулы, описанные в данном документе, имитируют естественные пептиды Аβ и варианты Аβ 1-40/42, Аβ рЕ3-40/42, Аβ 3-40/42 и Aβ 11-40/42 так, что соединения, содержащие аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, способны индуцировать образование соответствующих антител.

Изобретение, описанное в данном документе, относится к антигенам, которые не содержат последовательности нативного пептида Аβ и имитируют структуру неоэпитопов, не выявляющихся мимотопами, такими как описанные в WO 2004/062556. Такие вакцины против БА, основанные на мимотопах, будут, следовательно, индуцировать антительные ответы, направленные исключительно против аномальных молекул Аβ, упомянутый в данном документе, но не против родительских структур, таких как БПА. Кроме того, мимотопы не содержат потенциальные эпитопы Т-лимфоцитов и не вызывают образование вредных аутореактивных Т-лимфоцитов.

«β-амилоидозы», согласно употреблению в данном документе, означают различные нейродегенеративные заболевания, которые характеризуются аберрантной полимеризацией и накоплением специфических белков, - так называемые протеинопатии. Настоящее изобретение относится к профилактике, лечению и диагностике протеинопатии, обусловленных белками β-амилоида и объединенных термином β-амилоидозы. Самая известная форма β-амилоидозов - болезнь Альцгеймера (БА). Другие примеры включают, но не ограничиваются перечисленным, деменцию с тельцами Леви и деменцию при синдроме Дауна. Другие примеры - деменция с тельцами Леви, миозит, спорадический миозит с тельцами включения, наследственное кровоизлияние в мозг с амилоидозом (голландского типа), мозговая амилоидная ангиопатия, Аβ-ассоциированный ангиит.

Согласно конкретному предпочтительному варианту настоящего изобретения, «β-амилоидозы» означают болезнь Альцгеймера.

Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения, соединение содержит пептид, имеющий аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей IRWDTP (C), VRWDVYP (C), IRYDAPL (C), IRYDMAG (C), IRWDTSL (C), IRWDQP (C), IRWDG (C) и IRWDGG (C).

Конкретные предпочтительные соединения настоящего изобретения включают или состоят из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где С-конец вышеуказанного пептида может содержать или не содержать остаток цистеина (указанный скобками) так, что получающееся соединение может быть связано, например, с молекулой-носителем. Однако разумеется, также возможно связать цистеиновый остаток с N-концом вышеуказанного пептида.

Согласно конкретному предпочтительному варианту настоящего изобретения аминокислотная последовательность представляет собой IRWDTP (C), VRWDVYP (C), IRYDAPL (C) или IRYDMAG (C).

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению по крайней мере одного соединения, содержащего аминокислотную последовательность

E X 1 W H X 2 X 3 ( X 4 ) n ( X 5 ) m                                       ( Ф о р м у л а     I I ) ,

где:

X₁ - валин (V), аргинин (R) или лейцин (L),

X₂ - аргинин (R) или глутаминовая кислота (Е),

Х₃ - аланин (А), гистидин (Н), лизин (К), лейцин (L), тирозин (Y) или глицин (G),

Х₄ - пролин (Р), гистидин (Н), фенилаланин (F), глутамин (Q) или цистеин (С)

Х₅ - цистеин (С),

n и m - независимо друг от друга 0 или 1,

причем вышеуказанное соединение обладает связывающей способностью антитела, которое специфично к эпитопу бета-пептида амилоида (Аβ), содержащему аминокислотную последовательность EVHHQKL, для производства лекарственного средства для профилактики и(или) лечения β-амилоидозов.

Введение соединения, содержащего аминокислотную последовательность формулы II, вызывает иммунный ответ на укороченную форму Аβ - Aβ 11 - 40/42.

Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения, соединение содержит пептид, имеющий аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей EVWHRHQ (С), ERWHEKH (С), EVWHRLQ (С), ELWHRYP (С), ELWHRAF (С), ELWHRA (C), EVWHRG (C), EVWHRH (C) и ERWHEK (C), предпочтительно EVWHRHQ (С), ERWHEKH (С), EVWHRLQ (С), ELWHRYP (С) и ELWHRAF (С).

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению по крайней мере одного соединения, содержащего аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей QDFRHY (C), SEFKHG (C), TSFRHG (C), TSVFRH (C), TPFRHT (C), SQFRHY (C), LMFRHN (C), SAFRHH (C), LPFRHG (C), SHFRHG (C), ILFRHG (C), QFKHDL (C), NWFPHP (C), EEFKYS (C), NELRHST (C), GEMRHQP (C), DTYFPRS (C), VELRHSR (C), YSMRHDA (C), AANYFPR (C), SPNQFRH (C), SSSFFPR (C), EDWFFWH (C), SAGSFRH (C), QVMRHHA (C), SEFSHSS (C), QPNLFYH (C), ELFKHHL (C), TLHEFRH (C), ATFRHSP (C), APMYFPH (C), TYFSHSL (C), HEPLFSH (C), SLMRHSS (C), EFLRHTL (C), ATPLFRH (C), QELKRYY (C), THTDFRH (C), LHIPFRH (C), NELFKHF (C), SQYFPRP (C), DEHPFRH (C), MLPFRHG (C), SAMRHSL (C), TPLMFWH (C), LQFKHST (C), ATFRHST (C), TGLMFKH (C), AEFSHWH (C), QSEFKHW (C), AEFMHSV (C), ADHDFRH (C), DGLLFKH (C), IGFRHDS (C), SNSEFRR (C), SELRHST (C), THMEFRR (C), EELRHSV (C), QLFKHSP (C), YEFRHAQ (C), SNFRHSV (C), APIQFRH (C), AYFPHTS (C), NSSELRH (C), TEFRHKA (C), TSTEMWH (C), SQSYFKH (C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C) HEFRH и HEFRH (C) для производства лекарственного средства для профилактики и(или) лечения β-амилоидозов.

Каждое из этих соединений способно вызывать in vivo образование антител, направленных против Аβ 1 - 40/42, Аβ рЕ3 - 40/42 и Аβ 3 - 40/42. Следовательно, эти соединения особенно хорошо подходят для лечения и(или) профилактики β-амилоидозов, таких как БА, поскольку введение одного соединения приводит к образования антител, способных распознавать три главные формы Аβ - Аβ1 - 40/42, Аβ рЕ3 - 40/42 и Аβ3 - 40/42.

Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения, соединение состоит из или содержит пептид, имеющий аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей QDFRHY (C), SEFKHG (C), TSFRHG (C), TSVFRH (C), TPFRHT (C), SQFRHY (C), LMFRHN (C), SAFRHH (C), LPFRHG (C), SHFRHG (C), ILFRHG (C), QFKHDL (C), NWFPHP (C), EEFKYS (C), SPNQFRH (C), TLHEFRH (C), THTDFRH (C), DEHPFRH (C), QSEFKHW (C), ADHDFRH (C), DGLLFKH (C), EELRHSV (C), TEFRHKA (C), (C) SEFKH, SEFKH (C), (C) HEFRH и HEFRH (C) предпочтительно SEFKHG (C), TSVFRH (C), SQFRHY (C), LMFRHN (C), ILFRHG (C), SPNQFRH (C), ELFKHHL (C), TLHEFRH (C), THTDFRH(C), DEHPFRH (C), QSEFKHW (C), ADHDFRH (C), YEFRHAQ (C), TEFRHKA (C).

Аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, считаются мимотопами эпитопов Аβ, содержащих аминокислотные последовательности EFRHDSGY, pEFRHDSGY или EVHHQKL. Согласно настоящему изобретению, термин «мимотоп» означает молекулу, которая имеет конформацию, являющуюся топологическим эквивалентом эпитопа, который она имитирует. Мимотоп связывается с тем же самым антигенсвязывающим участком антитела, с которым специфически связывается нужный антиген. Мимотоп будет вызывать иммунный ответ у хозяина, проявляющийся в реакции на антиген, который он имитирует. Также мимотоп может действовать как конкурент за связывание эпитопа, который он имитирует в анализах торможения in vitro (например, в твердофазном иммуноферментном анализе), где участвуют эпитоп и антитело, связывающее вышеуказанный эпитоп. Однако мимотоп настоящего изобретения необязательно может предотвращать связывание эпитопа или конкурировать за связывание эпитопа, который он имитирует в анализах торможения in vitro, хотя он способен вызывать иммунный ответ при введении млекопитающему.

Согласно использованию в данном документе, термин «эпитоп» означает иммуногенный участок антигена, который распознается молекулой определенного антитела. Как правило, антиген имеет один или несколько эпитопов, каждый из которых способен связывать антитело, способное распознавать определенный эпитоп.

Мимотопы настоящего изобретения можно получать синтетическим путем с помощью методик химического синтеза, известных в данной области техники, либо в виде отдельного пептида, либо как часть другого пептида или полипептида. Или же пептидный мимотоп можно получать в микроорганизме, вырабатывающем этот пептидный мимотоп, который затем выделяют и, при необходимости, подвергают дополнительной очистке. Пептидный мимотоп можно получать в таких микроорганизмах, как бактерии, дрожжи или грибы, в клетках эукариотов, таких как клетки млекопитающих или насекомых, или с помощью рекомбинантного вирусного вектора, такого как аденовирус, поксивирус, вирус герпеса, вирус леса Семлики, бакуловирус, бактериофаг, вирус синдбис или вирус сендаи. Пригодные для получения пептидного мимотопа бактерии включают Е. coli, В. subtilis или любые другие бактерии, которые способны вырабатывать пептиды, такие как пептидный мимотоп. Пригодные для получения пептидного мимотопа типы дрожжей включают Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris или любые другие дрожжи, способные вырабатывать пептиды. Соответствующие методики известны в данной области техники. Также методики выделения и очистки пептидов, получающихся рекомбинантным путем, хорошо известны в данной области техники и включают, например, гель-фильтрацию, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию и т.д.

Для облегчения выделения пептидного мимотопа может быть изготовлен гибридный полипептид, где пептидный мимотоп трансляционно слит (ковалентно связан) с гетерологичным полипептидом, который обеспечивает выделение с помощью аффинной хроматографии. Типичные гетерологичные полипептиды - His-Tag (например, His₆: 6 остатков гистидина), GST-Tag (глутатион-S-трансфераза) и т.д. Гибридный полипептид не только облегчает очистку мимотопов, но и предупреждает разрушение полипептида мимотопа в процессе очистки. Если требуется удалить гетерологичный полипептид после очистки, гибридный полипептид может содержать сайт расщепления в месте соединения между пептидным мимотопом и гетерологичным полипептидом. Сайт расщепления состоит из аминокислотной последовательности, которая расщепляется ферментом, специфичным для этой аминокислотной последовательности в данном сайте (например, протеазами).

Мимотопы настоящего изобретения также могут быть модифицированы в или вблизи их N- и(или) С-конца так, чтобы с ними в вышеуказанным положениях был связан остаток цистеина. В предпочтительном варианте концевые остатки цистеина (расположенные на N- и С-концах пептида) используются для циклизации пептидов за счет дисульфидной связи. Остаток цистеина также может служить для связывания дополнительной молекулы (например, носителя) с вышеуказанным пептидом или соединением.

Мимотопы настоящего изобретения также могут быть использованы в различных анализах и наборах, в частности, в иммунологических анализах и наборах. Таким образом, особенно предпочтительно, чтобы мимотоп мог быть частью другого пептида или полипептида, в частности, фермента, который используется как репортер в иммунологических анализах. Такие ферменты-репортеры включают, например, щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена обыкновенного.

Мимотопы, согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой антигенные полипептиды, которые в своей аминокислотной последовательности отличаются от аминокислотной последовательности Аβ или от фрагментов Аβ. В этом отношении мимотопы настоящего изобретения могут включать не только аминокислотные замены одного или нескольких естественных остатков аминокислот, но также одну или несколько аминокислот, не встречающихся в естественных условиях (например, не относящихся к 20 «классическим» аминокислотам), или они могут быть полностью собраны из аминокислот, не встречающихся в естественных условиях. Кроме того, антигены настоящего изобретения, которые могут индуцировать образование антител, направленных против и связывающих Аβ 1 - 40/42, Аβ рЕ3 - 40/42, Аβ 3 - 40/42 и Аβ 11 - 40/42, могут быть собраны из D- или L-аминокислот или комбинаций DL-аминокислот и, на выбор, они могут быть уже модифицированы за счет дополнительных модификаций, замыкания в кольцо или получения производных. Подходящие антигены, индуцирующие образование антител, можно получить из пептидных библиотек, имеющихся в продаже. Предпочтительно эти пептиды должны состоять по крайней мере из 7 аминокислот, и предпочтительно их длина должна составлять до 16 аминокислот, предпочтительно до 14 или 20 аминокислот (например, от 5 до 16 аминокислотных остатков). Однако согласно настоящему изобретению более длинные пептиды тоже могут быть успешно использованы в качестве антигенов, индуцирующих образование антител. Кроме того, мимотопы настоящего изобретения также могут быть частью какого-либо полипептида и, следовательно, содержать на N- или С-конце по крайней мере один дополнительный аминокислотный остаток.

Для получения мимотопов настоящего изобретения (например, антигенов, индуцирующих образование антител, описанных в данном документе), конечно же, также пригодны библиотеки фагов и библиотеки пептидов, например, полученных с помощью методик комбинаторной химии или полученных путем высокопроизводительных методик скрининга наиболее меняющихся структур (Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al.; Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec.; 50 (6): 837-54).

Кроме того, согласно настоящему изобретению также могут быть использованы антигены, индуцирующие образование антител к Аβ 1 - 40/42, Аβ рЕ3 - 40/42, Аβ 3 - 40/42 и Aβ 11 - 40/42 и основанные на нуклеиновых кислотах, и их тоже можно найти с помощью большинства различных библиотек (олигонуклеотидов) (например, из 2-180 остатков нуклеиновых кислот) (например, Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690-700; Famulok et al., Ace. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, и т.д.). В антигенах на основе нуклеиновых кислот, индуцирующих образование антител, цепь нуклеиновой кислоты может быть получена, например, из естественных фосфорнодиэфирных соединений, или также из фосфотиоатов или комбинаций или химических вариантов (например, таких как пептид-нуклеиновая кислота), где в качестве нуклеотидов, согласно настоящему изобретению, могут быть использованы в основном U, Т, А, С, G, Н и mC. 2'-Остатки нуклеотидов, которые могут быть использованы согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой, ОН, F, Cl, NH₂, O-метил, O-этил, O-пропил или O-бутил, где нуклеиновые кислоты также могут быть модифицированы различным образом, например, с использованием защитных групп, как они традиционно используются в синтезе олигонуклеотидов. Таким образом, антигены на основе аптамеров, индуцирующие образование антител, также являются предпочтительными антигенами, индуцирующими образование антител в объеме настоящего изобретения.

Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения соединение связывают с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно KLH (гемоцианином фиссуреллы), столбнячным токсином, альбуминсвязывающим белком, бычьим сывороточным альбумином, дендримером (MAP; Biol. Chem. 358: 581), пептидными линкерами (или фланкирующими участками regions), а также веществами-адъювантами, описанными в Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (в частности, в таблице 1 этого документа) и O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 (в частности, эндогенные иммуномодулирующие соединения и системы доставки, описанные там), или их смесями. Конъюгированные химические соединения (например, с участием гетерофункциональных соединений, таких как GMBS и, конечно, других, таких как описаны в «Bioconjugate Techniques», Greg T.Hermanson) в данном контексте могут быть выбраны из реакций, известных специалисту в данной области техники. Кроме того, состав вакцин может быть дополнен адъювантом, предпочтительно малорастворимым алюминийсодержащим веществом, в частности, гидроксидом алюминия. Конечно, также могут быть использованы такие адъюванты, как гидрофосфат алюминия MF59, фосфат кальция, цитокины (например, ИЛ-2, ИЛ-12, ГМ-КСФ), сапонины (например, QS21), производные мурамил-l-аланил-d-изоглутамина, олиго-CpG, ЛПС, МПС, полифосфазены, эмульсии (например, эмульсия Фройнда, SAF), липосомы, виросомы, искомы, кохлеаты, полилактид-ко-гликолидные микрочастицы, полоксамерные частицы, вирусоподобные частицы, термолабильный энтеротоксин (ЛТ), холерный токсин (XT), мутантные токсины (например, LTK63 и LTR72), микрочастицы и(или) полимеризованные липосомы.

Соединение настоящего изобретения предпочтительно связано с носителем или адъювантом через линкер, который выбирают из группы, состоящей из NHS-поли(этиленоксида) (РЭО) (например, NHS-PEO₄-малеимид).

Вакцину, которая содержит настоящее соединение (мимотоп) и фармацевтически приемлемый носитель, можно вводить любым подходящим путем, например, внутрикожно, внутривенно, интраперитонеально, внутримышечно, интраназально, внутрь, подкожно и т.д., и в любом подходящем инжекторном устройстве (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). Соединение настоящего изобретения предпочтительно выпускать в фармацевтической форме для внутривенного, подкожного, внутрикожного или внутримышечного введения (см., например, «Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations», Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004).

Лекарственное средство (вакцина) согласно настоящему изобретению содержит соединение настоящего изобретения в количестве от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно от 10 нг до 1 мг, в частности, от 100 нг до 100 мкг, или же, например, от 100 фмоль до 10 мкмоль, предпочтительно до 10 пмоль до 1 мкмоль, в частности, от 100 пмоль до 100 нмоль. Типично вакцина может также содержать вспомогательные вещества, например, буферные растворы, стабилизаторы и т.д.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению соединения согласно определению выше для лечения и(или) уменьшения симптомов синуклеопатии.

Неожиданно оказалось, что соединения настоящего изобретения также можно использовать для лечения или уменьшения симптомов, обусловленных синуклеопатиями.

Амилоидозы и синуклеопатии обусловлены накоплением в головном мозге β-амилоида и α-синуклеина соответственно. У некоторых больных имеются клинические и морфологические проявления обоих заболеваний, что предполагает перекрывание механизмов патогенеза. Этих больных относят к страдающим вновь открытым синдромом, называемым деменцией с тельцами Леви или болезнью Паркинсона с деменцией (ДТЛ/БПД). Недавно на модели ДТЛ/БПД у трансгенных животных установлено, что суперэкспрессия и синуклеина, и белка-предшественника амилоида (чБПА) у мышей ведет к развитию когнитивных и двигательных нарушений, сопровождающихся утратой холинергических нейронов и уменьшением количества синаптических пузырьков, образованием обширных амилоидных бляшек и фибриллярных включений в нейронах, вступающих в иммунологическую реакцию с haSYN. Все эти признаки также обнаруживают при синдроме ДТЛ/БПД. Недавно описано, что обе молекулы способны взаимодействовать и образовывать гибридные олигомеры in vitro. Также обнаружено, что суперэкспрессия БПА может усугублять некоторые морфологические эффекты суперэкспрессии α-синуклеина. И наоборот, α-синуклеин способен усиливать секрецию и токсичность бета-пептидов амилоида и, возможно, также усиливать эффекты β-амилоида, что свидетельствует в поддержку перекрывания механизмов патогенеза при нейродегенеративном процессе.

Установлено, что при обеих протеинопатиях прогрессирующее накопление пептидных олигомеров является одним из главных проявлений токсичности, ведущим к различным изменениям, которые типичны либо для синуклеопатий, либо для амилоидозов. Несмотря на механическое сходство, предполагается, что α-синуклеин и Aβ вызывают разные, а также сходящиеся, патологические эффекты в отношении структурной целостности и функции головного мозга. Считается, что синуклеины влияют на моторную функцию гораздо сильнее, чем на когнитивную, в то время как пептиды и -амилоиды вызывают противоположные эффекты. Причина такого расхождения на сегодняшний день не установлена, но оно мешает точному выяснению взаимозависимости и эффектов обеих молекул.

Методика лечения, представленная в настоящем изобретении, описана как иммунотерапия, направленная на Aβ, что приведет к удалению главного внеклеточного амилоида. Такое лечение должно уменьшить изменения, вызванные амилоидом - от образования бляшек до гибели нейронов, - а также нарушения памяти и снижение когнитивных функций. Однако субклеточная локализация синуклеинов указывает, что эти внутриклеточные белки в основном активны на уровне синапсов, в частности, в синаптических пузырьках. Любопытно также, что скопления синуклеина, которые являются типичным морфологическим признаком синуклеопатий, в основном обнаруживаются внутри клеток. Кроме того, полагают, что механизм патогенеза синуклеопатий включает изменения внутри нейронов, начиная с нарушения функции митохондрий, накопления неправильно свернутых убиквитинированных или фосфорилированных белков, а также накопления альфа-синуклеина. Такие изменения в итоге приводят к изменениям функции синапсов, нарушению синаптической передачи и гибели дофаминергических нейронов с классическими проявлениями синуклеопатий. Aβ, наоборот, обнаруживается в основном во внеклеточном пространстве, и бляшки амилоида, а также волокна, протофибриллы и олигомеры бета-амилоида могут оказывать нейротоксическое воздействие при внесении во внеклеточное пространство или в ткань головного мозга. Таким образом, для опытного специалиста будет необычным, что методика, направленная в основном на внеклеточный амилоид, будет уменьшать симптомы синуклеопатий, таких как болезнь Паркинсона, которые влияют главным образом на внутриклеточные процессы, ведущие к развитию типичных симптомов, описанным ниже. Еще более неожиданно, что, как считается в настоящее время, перекрывающиеся эффекты обеих молекул обусловлены прямым взаимодействием двух белков, что должно происходить преимущественно внутри клеток. Согласно настоящему изобретению, термин «синуклеопатия» включает все нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся аномальными скоплениями синуклеина. Несколько нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона (БП), болезнь телец Леви (БТЛ), диффузную болезнь телец Леви (ДБТЛ), деменцию с тельцами Леви (ДТП), парксинсонизм с деменцией (БПД), множественную системную атрофию (МСА) и нейродегенерацию I типа с накоплением железа в головном мозге (НДНЖ I типа), объединены под названием синуклеопатии.

«Симптомы синуклеопатии» согласно употреблению в данном документе означают те симптомы синуклеопатии, в частности болезни Паркинсона, которые касаются двигательных и «немоторных» функций у больного, страдающего вышеуказанным заболеванием. «Двигательные симптомы» включают тремор в покое, брадикинезию, ригидность, нарушения равновесия, сгорбленную позу, дистонию, повышенную утомляемость, нарушения мелких движений и их координации, грубые нарушения координации, скудость движений (уменьшенный размах рук), акатизию, расстройства речи, такие как тихий голос или неразборчивая речь, вызванная отсутствием мышечного контроля, утрату выражения лица, или «лицо-маска», микрографию, трудности при глотании, нарушения половой функции, слюнотечение и т.д. «Немоторные» симптомы включают боль, деменцию или спутанность сознания, нарушения сна, запоры, кожные болезни, депрессию, страх или тревожность, нарушения памяти или заторможенность мышления, нарушения мочеиспускания, повышенную утомляемость и ноющие боли, потерю энергии, навязчивое поведение, судороги и т.д.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, синуклеопатию выбирают из группы, включающей болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, множественную системную атрофию и нейродегенерацию с накоплением железа в головном мозге. Особенно предпочтительна болезнь Паркинсона.

Другой аспект настоящего изобретения относится к пептиду, содержащему или состоящему из аминокислотной последовательности, которую выбирают из группы, содержащей IRWDTP (C), VRWDVYP (C), IRYDAPL (C), IRYDMAG (C), IRWDTSL (C), IRWDQP (C), IRWDG (C), IRWDGG (C), EVWHRHQ (C), ERWHEKH (C), EVWHRLQ (C), ELWHRYP (C), ELWHRAF (C), ELWHRA (C), EVWHRG (C), EVWHRH (C), ERWHEK (C), QDFRHY (C), SEFKHG (C), TSFRHG (C), TSVFRH (C), TPFRHT (C), SQFRHY (C), LMFRHN (C), SAFRHH (C), LPFRHG (C), SHFRHG (C), ILFRHG (C), QFKHDL (C), NWFPHP (C), EEFKYS (C), NELRHST (C), GEMRHQP (C), DTYFPRS (C), VELRHSR (C), YSMRHDA (C), AANYFPR (C), SPNQFRH (C), SSSFFPR (C), EDWFFWH (C), SAGSFRH (C), QVMRHHA (C), SEFSHSS (C), QPNLFYH (C), ELFKHHL (C), TLHEFRH (C), ATFRHSP (C), APMYFPH (C), TYFSHSL (C), HEPLFSH (C), SLMRHSS (C), EFLRHTL (C), ATPLFRH (C), QELKRYY (C), THTDFRH (C), LHIPFRH (C), NELFKHF (C), SQYFPRP (C), DEHPFRH (C), MLPFRHG (C), SAMRHSL (C), TPLMFWH (C), LQFKHST (C), ATFRHST (C), TGLMFKH (C), AEFSHWH (C), QSEFKHW (C), AEFMHSV (C), ADHDFRH (C), DGLLFKH (C), IGFRHDS (C), SNSEFRR (C), SELRHST (C), THMEFRR (C), EELRHSV (C), QLFKHSP (C), YEFRHAQ (C), SNFRHSV (C), APIQFRH (C), AYFPHTS (C), NSSELRH (C), TEFRHKA (C), TSTEMWH (C), SQSYFKH (C), (C) SEFKH, SEFKH (C), (C) HEFRH и HEFRH (C). Как указано путем использования скобок, пептиды настоящего изобретения могут содержать или не содержать остаток цистеина на С- или N-конце. Вследствие этого в объем настоящего изобретения также входят следующие аминокислотные последовательности: IRWDTP, VRWDVYP, IRYDAPL, IRYDMAG, IRWDTSL, IRWDQP, IRWDG, IRWDGG, EVWHRHQ, ERWHEKH, EVWHRLQ, ELWHRYP, ELWHRAF, ELWHRA, EVWHRG, EVWHRH, ERWHEK, QDFRHY, SEFKHG, TSFRHG, TSVFRH, TPFRHT, SQFRHY, LMFRHN, SAFRHH, LPFRHG, SHFRHG, ILFRHG, QFKHDL, NWFPHP, EEFKYS, NELRHST, GEMRHQP, DTYFPRS, VELRHSR, YSMRHDA, AANYFPR, SPNQFRH, SSSFFPR, EDWFFWH, SAGSFRH, QVMRHHA, SEFSHSS, QPNLFYH, ELFKHHL, TLHEFRH, ATFRHSP, APMYFPH, TYFSHSL, HEPLFSH, SLMRHSS, EFLRHTL, ATPLFRH, QELKRYY, THTDFRH, LHIPFRH, NELFKHF, SQYFPRP, DEHPFRH, MLPFRHG, SAMRHSL, TPLMFWH, LQFKHST, ATFRHST, TGLMFKH, AEFSHWH, QSEFKHW, AEFMHSV, ADHDFRH, DGLLFKH, IGFRHDS, SNSEFRR, SELRHST, THMEFRR, EELRHSV, QLFKHSP, YEFRHAQ, SNFRHSV, APIQFRH, AYFPHTS, NSSELRH, TEFRHKA, TSTEMWH, SQSYFKH, (C)SEFKH, SEFKH, HEFRH и HEFRH.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения пептид связан с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно гемоцианином фиссуреллы.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической форме, предпочтительно вакцине, содерж