Способ определения концентрации с-реактивного протеина методом иммуноимпедансного анализа

Способ определения концентрации с-реактивного протеина методом иммуноимпедансного анализа

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и предназначено для повышения эффективности определения концентрации С-реактивного протеина в сыворотке крови и других биологических жидкостях.

Наиболее близким аналогом является метод иммуноферментного анализа, основанный на фотометрическом измерении интенсивности окраски раствора субстрата, связанного с иммунным комплексом С-реактивного протеина и моноклональных антител, изменяющего цвет раствора пропорционально количеству связанного вещества под действием фермента миелопероксидазы (Клиническая лабораторная аналитика Том II. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории / Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Лабинформ-РАМЛД, 1999. - С.201). Метод иммуноферментного анализа для определения концентрации С-реактивного протеина в сыворотке крови выполняется следующим образом. Образцы сыворотки крови разводят буферным раствором для разведения образцов в 100 раз и тщательно перемешивают. В лунки иммунологического планшета с фиксированными моноклональными антителами вносят по 50 мкл разведенных образцов сыворотки крови и контрольных образцов с известными концентрациями С-реактивного протеина. Во все лунки, включая контрольные, содержащие известные концентрации С-реактивного протеина, и опытные, вносят по 100 мкл моноклональных антител определенной концентрации, конъюгированных с ферментом миелопероксидазой хрена. Планшет инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Выполняют процедуру 3-х кратной отмывки промывающим буферным раствором, тщательно удаляют влагу из лунок. В каждую лунку вносят по 100 мкл хромогенного субстрата, инкубируют 30 минут при комнатной температуре и, затем, добавляют останавливающий раствор, содержащий концентрированную серную кислоту. Изменение цвета раствора в лунках исследуют методом фотометрии. Затем рассчитывают концентрацию С-реактивного протеина в каждом опытном образце сыворотки крови, сравнивая полученное значение с калибровочным графиком, построенным на основании контрольных образцов с известными концентрациями С-реактивного протеина.

Недостатки прототипа: существующий метод иммуноферментного анализа недостаточно эффективный, требует применения моноклональных антител и дополнительных дорогостоящих химических реактивов, а также лабораторного оборудования, специально обученного медицинского персонала (лаборант), имеет продолжительность не менее 2,5 часов, предназначен для применения в условиях лечебно-профилактического учреждения и недостаточно экономически эффективен.

Изобретение направлено на решение задачи - упрощение процесса.

Поставленная задача решается с помощью признаков, указанных в формуле изобретения, общих с прототипом, таких как способ определения концентрации С-реактивного протеина в сыворотке крови или других биологических жидкостях в лунках иммунологического планшета, и отличительных, существенных признаков, таких как для исследования применяют биполярный метод электроимпедансометрии с определением модульного значения электрического импеданса | Z | , измеренного на частоте 20000 Гц переменного тока малой мощности, раствора моноклональных антител и исследуемого или контрольного образца, и расчет концентрации выполняют на основании отношений исследуемой и известной концентраций вещества к величинам модульного значения электрического импеданса, измеренным в опытной лунке и контрольной пробе.

Технический результат от вышеперечисленной совокупности существенных признаков - повышение эффективности метода за счет устранения необходимости в применении дополнительных к моноклональным антителам химических реактивов и части лабораторного оборудования, уменьшение времени выполнения исследования и снижение себестоимости применения метода.

Решение указанной задачи достигается путем измерения электрического импеданса раствора моноклональных антител, помещенного в лунки стандартного иммунологического планшета, объемом 300 мкл, по 250 мкл с последующим внесением 50 мкл исследуемого образца сыворотки крови, биполярным методом с применением зондирования переменным электрическим током малой мощности с частотой 20000 Гц. Для повышения точности метода измерения повторяют не менее 576000 раз в течение 3 секунд, и рассчитывают среднюю величину модульного значения электрического импеданса | Z | . Одновременно, параллельно выполняется контрольный тест с внесением 50 мкл образца, содержащего известную концентрацию С-реактивного протеина в лунку, содержащую 250 мкл раствора моноклональных антител, аналогично опытной пробе. После этого рассчитывают концентрацию С-реактивного протеина в исследуемом образце (опытной пробе) на основании уравнения С о п / | Z | о п = С к / | Z | к и эквивалентного уравнения С о п = С к × | Z | о п / | Z | к , где Соп - исследуемая концентрация С-реактивного протеина в опытной пробе, | Z | о п - модульное значение электрического импеданса в опытной пробе, Ск - концентрация С-реактивного протеина в контрольной пробе с известной концентрацией, | Z | к - модульное значение электрического импеданса в контрольной пробе с известной концентрацией С-реактивного протеина.

Способ осуществляют следующим образом. Кровь для исследования берут из локтевой вены или пальца пациента. Выделяют сыворотку крови и 50 мкл ее вносят в лунку иммунологического планшета, содержащую 250 мкл раствора моноклональных антител с помощью пипетки-дозатора. Иммунологический планшет инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Электроды программно-аппаратного комплекса, например, «БИА-лаб Спиро» (Патент РФ №2487662, 20.07.13 г., МПК A61B 5/08 опубл. 20.07.13 г. или Медасс АВС-01, или другого (Патент РФ «Устройство для измерения импеданса биологических сред» №2462185 от 19.07.2011. МПК A61B 5/08, опубл. 27.09.12 г.) подключают к электродам, помещенным в лунки иммунологического планшета, включают прибор в режиме посекундной визуализации результатов на частоте 20000 Гц, затем осуществляют запись результатов исследования. Общая продолжительность записи не менее 3 секунд, в течение которых регистрируют не менее 576000 результатов измерений. Результат записывается автоматически в электронную папку, названную по фамилии пациента. Общее время выполнение исследования в одной лунке иммунологического планшета не превышает 3-4 секунд, а стрипа стандартного иммунологического планшета, содержащего 8 лунок, - 12 секунд.

Диагностика концентрации С-реактивного протеина в исследуемом образце сыворотки крови может осуществляться в автоматическом режиме с помощью программы для ЭВМ.

Погрешность метода для определения концентрации С-реактивного протеина не превышает 0,001 мкг/мл, что сопоставимо с результатами иммуноферментного анализа.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1

Пациент Ч., 53 лет, диагноз: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения 2 ф.к.

Концентрация С-реактивного протеина в сыворотке крови, определенная иммуноферментным методом, составляет 2,8 мкг/мл.

Методом иммуноимпедансного анализа определена концентрация: С-реактивного протеина в сыворотке крови 2,8 мкг/мл.

Представленный пример демонстрирует высокую точность применения иммуноимпедансного анализа в случае диагностики концентрации С-реактивного протеина в сыворотке крови в клинической практике при нормальном значении определяемого параметра (менее 3 мкг/мл).

Пример 2

Пациент С., 54 года. Диагноз: Цереброваскулярная болезнь. Последствия острого нарушения мозгового кровообращения в бассейне левой средней мозговой артерии, перенесенного в 2010 г. Правосторонний гемипарез. Энцефалопатия сосудистого генеза.

Концентрация С-реактивного протеина в сыворотке крови, определенная иммуноферментным методом, составляет 6,1 мкг/мл.

Методом иммуноимпедансного анализа определена концентрация: С-реактивного протеина в сыворотке крови 6,1 мкг/мл.

Представленный пример демонстрирует высокую точность применения иммуноимпедансного анализа в случае диагностики концентрации С-реактивного протеина в сыворотке крови больного в случае превышения нормального диапазона.

Пример 3

Пациент П., 27 лет. Диагноз: Внебольничная пневмония, в нижней доле слева, не тяжелое течение. ОДН 1 ст.

Концентрация С-реактивного протеина в сыворотке крови, определенная иммуноферментным методом, составляет 78,3 мкг/мл. Методом иммуноимпедансного анализа определена концентрация С-реактивного протеина 78,2 мкг/мл.

Представленный пример демонстрирует высокую точность применения иммуноимпедансного анализа в случае диагностики концентрации С-реактивного протеина в сыворотке крови больного пневмонией и значительном превышении нормального диапазона его концентрации в крови.

Предлагаемый способ отличается от известного следующими признаками. В предлагаемом способе используется определение электрического импеданса в лунке стандартного иммунологического планшета объемом 300 мкл, содержащей 250 мкл раствора моноклональных антител и 50 мкл исследуемой биологической жидкости (сыворотки крови) или контрольного образца, что позволяет определить концентрацию С-реактивного протеина на основании решения математического уравнения отношений исследуемой и известной концентраций вещества к величинам модульного значения электрического импеданса, измеренным в опытной лунке и контрольной пробе (лунке).

Из описания и практического применения настоящего изобретения специалистам будут очевидны и другие частные формы его выполнения. Данное описание и примеры рассматриваются как материал, иллюстрирующий изобретение, сущность которого и объем патентных притязаний определены в нижеследующей формуле изобретения, совокупностью существенных признаков и их эквивалентами.

Способ определения концентрации С-реактивного протеина в сыворотке крови в лунках иммунологического планшета, отличающийся тем, что для исследования применяют биполярный метод электроимпедансометрии с определением модульного значения электрического импеданса |Z|, измеренного на частоте 20000 Гц переменного тока малой мощности, раствора моноклональных антител, исследуемого и контрольного образцов, и расчет концентрации выполняют на основании решения математического уравнения отношений исследуемой и известной концентраций вещества к величинам модульного значения электрического импеданса, измеренным в опытной лунке и контрольной пробе.