Микроорганизм, экспрессирующий ксилозоизомеразу

Микроорганизм, экспрессирующий ксилозоизомеразу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к микроорганизму.

В частности, настоящее изобретение относится к трансформированному микроорганизму, способному к: более высокой активности ксилозоизомеразы, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией, и/или к более высокой скорости роста в среде для роста или на среде для роста, содержащей ксилозу, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией; и/или более быстрому метаболизму ксилозы, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией; и/или к более высокой продукции этанола при выращивании в анаэробных условиях на ксилозе в качестве источника углерода, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения трансформированных микроорганизмов, способных к: более высокой активности ксилозоизомеразы, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией, и/или к более высокой скорости роста в среде для роста или на среде для роста, содержащей ксилозу, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией; и/или более быстрому метаболизму ксилозы, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией; и/или к более высокой продукции этанола при выращивании в анаэробных условиях на ксилозе в качестве источника углерода, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией.

Кроме того, настоящее изобретение относится к инокуляту и культуральной среде, содержащим микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением или микроорганизм, полученный способом в соответствии с настоящим изобретением.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ферментации, включающему культивирование в культуральной среде микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением или микроорганизма, полученного способом по настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения биотоплива и/или продукта, происходящего из ксилозы, включающим культивирование в культуральной среде микроорганизма по настоящему изобретению или микроорганизма, полученного способом по настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к биотопливу и/или продукту, происходящему из ксилозы, полученному способом по настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением или микроорганизма, полученного способом по настоящему изобретению, для получения продукта, происходящего из ксилозы, и/или биотоплива.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Этанол считается привлекательной альтернативой транспортному топливу, которую можно использовать в качестве добавки, дополнения или частичной замены бензина из ископаемого топлива, которое является ограниченным в конечном итоге источником.

Этанол можно использовать в меньших концентрациях вместо метил-трет-бутилового эфира (MTBE) в качестве более чистой присадки, повышающей октановое число, или оксигенирующей добавки в бензин, или его можно использовать для примешивания в бензин в более высоких количествах, составляющих от 10 до 85%, причем эти смеси можно использовать в только незначительно модифицированных автомобильных двигателях по сравнению с известными в настоящее время двигателями. Таким образом, он имеет огромное преимущество относительно других альтернативных транспортных топлив. Можно проводить любую частичную замену с максимальной гибкостью, и без значительных изменений технологии транспортных двигателей, известной на сегодняшний день.

Этанол имеет преимущество, состоящее в том, что он является возобновляемым источником, поскольку его можно получать в очень больших количествах из растительного материала. Из этого также следует преимущество наличия низкого суммарного вклада в выброс диоксида углерода в атмосферу, поскольку диоксид углерода, высвобождаемый при использовании этанола, повторно абсорбируется вследствие необходимости продукции растительного материала для регенерации использованного этанола.

При традиционной продукции этанола посредством ферментации используемым растительным материалом является сахар с 6 атомами углерода, либо прямо экстрагированный из растений, содержащих свободные моносахариды или дисахариды, либо образованный путем гидролиза крахмала из крахмалсодержащих частей растений. Эти сахара получают из частей растений, которые также используются для употребления человеком или животными. Таким образом, традиционная продукция этанола прямо конкурирует за растительный материал, который в ином случае использовался бы для продуктов питания или кормов. Конверсия пищи в топливо приводит к этическим проблемам в мире, где миллионы людей голодают; вычисления показывают, что количество кукурузы, необходимое для продукции бака топлива для одного самого обычного вездеходного автомобиля в США, приблизительно равно количеству, требуемому для того, чтобы кормить одного голодающего, в противном случае, человека в течение одного полного года.

Альтернативным решением является применение для получения энергии и топлива лигноцеллюлозного растительного материала, который в ином случае считается отходами. Это, в общем, воспринимается высоко положительно, и, таким образом, разработка путей применения лигноцеллюлозного растительного материала для продукции этанола получила во многих странах решительную поддержку, как политически, так и в обществе. Другим преимуществом является изобилие лигноцеллюлозного материала, что в действительности делает теоретически возможной замену 50% или более современного употребляемого бензина этанолом.

Существуют многочисленные источники лигноцеллюлозного материала, который можно использовать для продукции этанола, при условии что может быть достигнут эффективный и экономичный процесс сбора и конверсии. Несколько примеров, где сбор уже проводится в настоящее время, включает жмых сахарного тростника, древесную стружку, кукурузную солому и пшеничную солому.

Двумя главными техническими проблемами, с которыми сталкиваются при применении лигноцеллюлозного материала для продукции этанола посредством ферментации, являются:

1. трудность гидролиза целлюлозы, содержащей сахар с 6 атомами углерода, до глюкозы без образования побочных продуктов, которые мешают или препятствуют дальнейшей микробной конверсии глюкозы в этанол; и

2. отсутствие организма, который способен эффективно осуществлять конверсию сахаров с 5 атомами углерода (например, ксилозы и арабинозы), присутствующих в гемицеллюлозной части лигноцеллюлозного материала, в этанол.

Saccharomyces cerevisiae в течение более чем 6000 лет является предпочтительным микроорганизмом для конверсии сахаров с 6 атомами углерода, происходящих из растительного материала, в этанол. Это является следствием благоприятной комбинации высокого выхода этанола, высокой удельной продуктивности и высокой толерантности к этанолу вместе со способностью расти и осуществлять ферментацию при низких pH, где другим конкурирующим микроорганизмам трудно просто выжить. Когда трудности в гидролизе целлюлозы будут преодолены, S. cerevisiae, наиболее вероятно, продолжат быть предпочтительным организмом для получения этанола ферментацией высвобожденных мономеров сахаров с 6 атомами углерода. Однако, к сожалению, S. cerevisiae не способны метаболизировать сахара с 5 атомами углерода, которые составляют вплоть до одной трети лигноцеллюлозного сахарного материала.

Следовательно, в последние два десятилетия проводится работа по поиску путей для модификации способами генетической инженерии S. cerevisiae для внесения в них способности ферментировать сахар из 5 атомов углерода. Эта работа, главным образом, сфокусирована на ферментации ксилозы, поскольку ксилоза составляет преобладающую часть сахаров с 5 атомами углерода в лигноцеллюлозе. Хотя S. cerevisiae не могут метаболизировать ксилозу, они способны метаболизировать ее изомер ксилулозу (Wang and Schneider, 1980), которая представляет собой метаболит, являющийся точкой вхождения в пентозофосфатный путь. Таким образом, в принципе, проблема может быть решена предоставлением S. cerevisiae, способных конвертировать ксилозу в ксилулозу.

Для направления ксилозы на пентозофосфатный путь через ксилулозу в S. cerevisiae были внесены два различных существующих биохимических каскада. В природных метаболизирующих ксилозу грибах ксилоза конвертируется в ксилулозу в двухстадийном процессе (см. фигуру 1). Сначала ксилоза восстанавливается до ксилита ксилозоредуктазой (XR - EC 1.1.1.21). Затем ксилит дегидрогенизируется до ксилулозы ксилитдегидрогеназой (XDH - EC 1.1.1.9). Редуктаза и дегидрогеназа не присутствуют в S. cerevisiae, однако возможно перенести и экспрессировать гены, кодирующие эти два фермента, из Pichia stipitis в S. cerevisiae, и полученный модифицированный штамм S. cerevisiae будет способен метаболизировать ксилозу.

Активность этих двух ферментов требует NADPH и NAD+, и в результате нее образуются NADP+ и NADH, так что необходимо, чтобы организм регенерировал баланс NAD+ - NADH и NADP+ - NADPH посредством окислительно-восстановительных процессов где-либо в другой части метаболизма, иначе метаболизм ксилозы будет прекращать функционировать при истощении NADPH и NAD+. Довольно низкую скорость метаболизма ксилозы и образования значительных количеств ксилита в штаммах S. cerevisiae, модифицированных подобным образом, связывают с этой присущей им проблемой каскада ксилозоредуктазы-ксилитдегидрогеназы.

В метаболизирующих ксилозу бактериях конверсия ксилозы в ксилулозу отличается: один фермент, ксилозоизомераза (EC 5.3.1.5), конвертирует ксилозу непосредственно в ксилулозу (см. фигуру 1). Этот путь очевидно является более простым, и не создает дисбаланса NAD+ - NADPH, упомянутого выше. Таким образом, это также было первоначальной стратегией, предложенной для обеспечения способности S. cerevisiae метаболизировать ксилозу. Однако было показано, что осуществление этой стратегии является трудным. Экспрессия большинства генов ксилозоизомеразы из бактерий не приводит к присутствию активной ксилозоизомеразы в S. cerevisiae, и точная причина этого до сих пор неизвестна. В различных исследованиях было выявлено, что часто белок, продуцируемый при экспрессии бактериального гена, может быть выявлен, однако экспрессированный белок, по-видимому, не сворачивается в S. cerevisiae в активный фермент.

Термостабильные ферменты часто являются более стабильными в других типах экстремальных условий, таких как высокое содержание соли и предельные значения pH. Это может указывать на то, что термостабильные ферменты с большей вероятностью сохраняют (и, возможно, также претерпевают) правильное сворачивание. Кроме того, действительно можно найти примеры бактериальных генов ксилозоизомеразы, выделенных из термофильных организмов, которые экспрессируют активные ксилозоизомеразы в S. cerevisiae (см.: Walfridsson et al, 1996; и Bao et al, 1999). Было показано, что эти гены обеспечивает метаболизм ксилозы в S. cerevisiae, но с очень низкой скоростью. Низкую скорость приписывают тому факту, что термостабильные ксилозоизомеразы имеют оптимальную активность при 80-90°С, но температуры, которые поддерживают выживание большинства штаммов S. cerevisiae, составляют 30-35°C.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к трансформированному микроорганизму, способному к:

(a) более высокой активности ксилозоизомеразы, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией; и/или

(b) более высокой скорости роста в среде для роста или на среде для роста, содержащей ксилозу, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией; и/или

(c) более быстрому метаболизму ксилозы, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией; и/или

(d) более быстрой продукции этанола при выращивании в анаэробных условиях на ксилозе в качестве источника углерода, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к инокуляту, содержащему микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к культуральной среде, содержащей микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения трансформированного микроорганизма, причем указанный способ включает стадию трансформации микроорганизма, так чтобы указанный трансформированный микроорганизм был способен к:

(a) более высокой активности ксилозоизомеразы, чем у микроорганизма перед трансформацией; и/или

(b) более высокой скорости роста в среде для роста или на среде для роста, чем у микроорганизма перед трансформацией; и/или

(c) более быстрому метаболизму ксилозы, чем у микроорганизма перед трансформацией; и/или

(d) более быстрой продукции этанола при выращивании в анаэробных условиях на ксилозе в качестве источника углерода, чем у микроорганизма перед трансформацией.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ферментации, включающему культивирование в культуральной среде микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением или микроорганизма, полученного способом по настоящему изобретению.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения продукта, происходящего из ксилозы, включающему культивирование в культуральной среде микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением или микроорганизма, полученного способом по настоящему изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения биотоплива, где указанный способ включает стадию культивирования в культуральной среде микроорганизма по настоящему изобретению или микроорганизма, полученного способом по настоящему изобретению.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрено биотопливо, полученное способом по настоящему изобретению.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен продукт, происходящий из ксилозы, полученный способом по настоящему изобретению.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрено применение микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением или микроорганизма, полученного способом по настоящему изобретению, для продукции продукта, происходящего из ксилозы.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением или микроорганизма, полученного способом по настоящему изобретению, для продукции биотоплива.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к трансформированному микроорганизму, где указанный трансформированный микроорганизм содержит экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу.

ОБСУЖДЕНИЕ

Прежние попытки найти гены бактериальной ксилозоизомеразы мезофильного происхождения с высокой активностью при экспрессии, например, в Saccharomyces cerevisiae, оказались безуспешными. Неожиданно, как описано в настоящем документе, авторы изобретения успешно идентифицировали бактерии, в частности, мезофильные бактерии, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие ксилозоизомеразу, которая при экспрессии, например, в S. cerevisiae, приводит к высокой внутриклеточной активности ксилозоизомеразы в организме. Такие последовательности можно использовать, например, для конструирования штаммов семейства Saccharomyces, обеспечивая конверсию дрожжами ксилозы в ксилулозу и, тем самым способствуя эффективной продукции и/или метаболизму ксилозы в этанол. На фигуре 4 детально показан метаболизм ксилозы в этанол; ксилулоза-5-фосфат - промежуточное соединение, которое может образовываться из D-ксилозы - входит в пентозофосфатный путь и далее метаболизируется в этанол в анаэробных условиях. Однако в дополнение к этому, такие последовательности также можно использовать для конструирования штаммов, например, S. cerevisiae, являющихся эффективными продуцентами других соединений, происходящих из ксилозы, через пенозофосфатный путь. Примеры таких соединений включают, но не ограничиваются ими, ароматические аминокислоты, молочную кислоту, янтарную кислоту, уксусную кислоту, ацетальдегид, фурфураль, итаконовую кислоту, глутаминовую кислоту, лимонную кислоту, крезол, лизин, 3-гидроксипропионовую кислоту, поли-3-гидроксиалканоаты, протокатеховую кислоту, пирокатехол, гваякол, вератрол, резвератрол, ванилин, ванилиновую кислоту, ванилиновый спирт, муконовую кислоту, адипиновую кислоту, 4-гидроксибензойную кислоту, 4-гидроксибензальдегид, 4-метоксибензойную кислоту, 4-аминобензоат, 4-гидроксианилин, 4-метоксианилин, хинол, анизол, фенол, антраниловую кислоту, 3-гидроксиантранилат, 2,3-дигидроксибензойную кислоту, 2-аминофенол, 1,4-циклогександион, изопрен и стирол.

НЕКОТОРЫЕ ПРЕИМУЩЕСТВА

Преимущественно, настоящее изобретение относится к трансформации (инженерии) микроорганизмов, таких как микроорганизмы семейства Saccharomyces, для обеспечения метаболизма микроорганизмами ксилозы. Это, в свою очередь, преимущественно увеличивает эффективность микроорганизмов, в частности, штаммов Saccharomyces, в отношении продукции этанола из содержащего ксилозу сырья (такого как лигноцеллюлозный материал). Кроме того, это преимущественно увеличивает эффективность микроорганизмов в отношении продукции других природных или полученных способами инженерии метаболитов, происходящих из промежуточных соединений в пентозофосфатном пути, таких как ароматические аминокислоты, молочная кислота, янтарная кислота, уксусная кислота, ацетальдегид, фурфураль, итаконовая кислота, глутаминовая кислота, лимонная кислота, крезол, лизин, 3-гидроксипропионовая кислота, поли-3-гидроксиалканоаты, протокатеховая кислота, пирокатехол, гваякол, вератрол, резвератрол, ванилин, ванилиновая кислота, ванилиновый спирт, муконовая кислота, адипиновая кислота, 4-гидроксибензойная кислота, 4-гидроксибензальдегид, 4-метоксибензойная кислота, 4-аминобензоат, 4-гидроксианилин, 4-метоксианилин, хинол, анизол, фенол, антраниловая кислота, 3-гидроксиантранилат, 2,3-дигидроксибензойная кислота, 2-аминофенол, 1,4-циклогександион, изопрен и стирол. Кроме того, это способствует общему применению содержащего ксилозу материала в качестве сырья для выращивания штаммов семейства Saccharomyces для промышленных целей.

Следующее преимущество состоит в том, что нуклеотидная последовательность, кодирующая ксилозоизомеразу, происходит из мезофильного организма и/или способна к высокой активности при мезофильных температурах.

Другое преимущество состоит в том, что микроорганизмы в соответствии с настоящим изобретением продуцируют активную ксилозоизомеразу.

Преимущественно, с использованием микроорганизмов в соответствии с настоящим изобретением, можно получать биотоплива (такие как этанол).

Более преимущественно, с использованием микроорганизмов в соответствии с настоящим изобретением, можно получать биотоплива из отходов, таких как сельскохозяйственные отходы (включая солому злаковых, такую как пшеничная солома; свекловичную пульпу; жмых сахарного тростника; такую солому, как солома сорго, соевых бобов маиса или кукурузы; и древесную стружку). С помощью настоящего изобретения отсутствует необходимость (или снижается необходимость) в применении материалов (таких как экстракт сахарного тростника, экстракт сахарной свеклы, крахмал сорго, маисовый крахмал, пшеничный крахмал или кукурузный крахмал), которые в ином случае можно использовать в качестве источника пищи для людей и/или в качестве корма для животных.

Преимущественно, микроорганизмы в соответствии с настоящим изобретением обеспечивают оптимальное использование сахаров, высвобождающихся при гидролизе лигноцеллюлозного материала посредством ферментации пентозных сахаров, ксилозы.

Настоящее изобретение обеспечивает продукцию биотоплива, которое является более CO₂-нейтральным по сравнению с транспортным топливом на основе нефти. С помощью настоящего изобретения выброс CO₂ является низким (еще более низким) при получении биотоплива согласно настоящему изобретению, по сравнению с получением типичного транспортного топлива на основе нефти (ископаемые топлива).

ФИГУРЫ

Фигура 1. Схематическое представление метаболических каскадов, на которой детально показан метаболизм двух альдопентоз, D-ксилозы и L-арабинозы. Обе альдопентозы конвертируются в кетопентозу, и далее в D-ксилулоза-5-фосфат. Без связи с теорией, как показано на фигуре, один тип каскада (альдозоредуктазный тип) встречается у грибов, в то время как другой тип каскада (изомеразный тип) встречается у бактерий. В каскаде грибного типа, первые ферменты могут быть названы "D-ксилозоредуктаза" и "L-арабинозоредуктаза", однако часто один и тот же фермент может восстанавливать как D-ксилозу, так и L-арабинозу, а затем может участвовать в обоих каскадах, и он может быть обозначен менее специфическим названием "альдозоредуктаза".

Фигура 2. Без связи с теорией, на фигуре 2 показано схематическое представление грибного и бактериального типов метаболических каскадов для некоторых менее распространенных пентоз (D- и L-ликсоза, D-рибоза), детализирующее начальный метаболизм до вхождения в пентозофосфотный путь.

Фигура 3. Схематическое представление неокислительной части пентозофосфатного пути (PPP).

Фигура 4. Схематическое представление метаболической конверсии ксилозы в этанол. Здесь, кетопентоза ксилулоза-5-фосфат, которая может происходить из D-ксилозы, далее метаболизируется в этанол в анаэробных условиях. XI представляет собой ксилозоизомеразу, и XK представляет собой ксилулокиназу. Показано суммарное вхождение ксилозы в процесс и суммарный выход этанола из процесса (итог процесса).

Фигура 5. Активность ксилозоизомеразы (XI) в Saccharomyces cerevisiae, трансформированной нуклеотидной последовательностью, кодирующей бактериальную ксилозоизомеразу. Бактериальная ксилозоизомераза происходит из (i) Pseudomonas syringae, (ii) Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, (iii) Thermoanaerobacter thermohydrosulfurigenes или (iv) Lactococcus lactis subsp. lactis (Lactobacillus xylosus).

Фигура 6. Рост на ксилозе Saccharomyces cerevisiae, трансформированных нуклеотидными последовательностями, кодирующими и экспрессирующими бактериальную ксилозоизомеразу и нуклеотидную последовательность, кодирующую и экспрессирующую килулозокиназу, клонированную из Pichia stipitis.

Фигура 7. Удельная активность ксилозоизомеразы Saccharomyces cerevisiae, трансформированных нуклеотидной последовательностью, кодирующей и экспрессирующей вариант ксилозоизомеразы Lactococcus. Вариант ксилозоизомеразы (XI) Lactococcus имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как используют в настоящем документе, выражения "более высокая активность ксилозоизомеразы, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией" и "более высокая активность ксилозоизомеразы, чем у микроорганизма перед трансформацией" относятся к трансформированному микроорганизму, который обладает активностью ксилозоизомеразы по меньшей мере 0,16, 0,2, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 единиц ксилозоизомеразы на мг белка микроорганизма при культивирования в пригодных условиях культивирования, позволяющих по меньшей мере поддержание указанного микроорганизма; например, указанная культуральная среда может содержать один или несколько субстратов (например, ксилозу), способных активировать экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу, однако указанная культуральная среда не содержит какого-либо субстрата, который способен ингибировать экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу. Один пример пригодных условий культивирования описан в примере 5. Указанную активность ксилозоизомеразы измеряют с использованием анализа с цистеин-карбазолом, описанного Dische and Borenfreund (1951). Активность ксилозоизомеразы у трансформированного микроорганизма превышает активность ксилозоизомеразы у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией, или микроорганизма перед трансформацией, при культивировании в тех же условия культивирования, что и для трансформированного микроорганизма.

Как используют в настоящем документе, выражения "более высокая скорость роста в среде для роста или на среде для роста, содержащей ксилозу, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией" и "более высокая скорость роста в среде для роста или на среде для роста, чем у микроорганизма перед трансформацией" относятся к трансформированному микроорганизму, способному к увеличению скорости роста, так чтобы время, требуемое для удвоения числа микроорганизмов, было по меньшей мере на 10%, 15%, 20% или 25% ниже, чем время, требуемое для удвоения числа эквивалентных микроорганизмов перед трансформацией, или микроорганизмов перед трансформацией, при культивировании в одинаковых условиях.

Выражения "более быстрый метаболизм ксилозы, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией" и "более быстрый метаболизм ксилозы, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией", как используют в настоящем документе, относятся к трансформированному микроорганизму, который способен метаболизировать ксилозу, так чтобы употребленное количество ксилозы на клетку в культуральной среде было по меньшей мере на 10%, 20%, 25%, 30% или 35% выше, чем употребленное количество ксилозы для эквивалентного микроорганизма перед трансформацией, или микроорганизма перед трансформацией, при культивировании в одинаковых условиях в течение данного периода времени в экспоненциальной фазе роста. Указанный трансформированный микроорганизм культивируют в пригодных условиях культивирования, позволяющих по меньшей мере поддержание указанного микроорганизма; например, указанная культуральная среда может содержать одно или несколько веществ (например, ксилозу), способных активировать экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу, однако указанная культуральная среда не содержит какой-либо субстрат, который способен ингибировать экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу.

Как используют в настоящем документе, выражения "более быстрая продукция этанола при выращивании в анаэробных условиях на ксилозе в качестве источника углерода, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией" и "более быстрая продукция этанола при выращивании в анаэробных условиях на ксилозе в качестве источника углерода, чем у микроорганизма перед трансформацией" относятся к трансформированному микроорганизму, который способен продуцировать по меньшей мере на 10%, 20% или 30% больше этанола на клетку, чем эквивалентный микроорганизм перед трансформацией при культивировании в анаэробных условиях с ксилозой в качестве источника углерода в течение данного периода времени.

Термин "эквивалентный микроорганизм перед трансформацией", как используют в настоящем документе, включает указание на микроорганизм перед трансформацией нуклеотидной последовательностью, которая кодирует ксилозоизомеразу, или перед трансформацией нуклеотидной последовательностью, которая вызывает повышенную регуляцию (например, сверхэкспрессию) ксилозоизомеразы.

В одном варианте осуществления микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением трансформирован нуклеотидной последовательностью, которая приводит к сверхэкспрессии микроорганизмом ксилозоизомеразы. Например, в геном микроорганизма встраивают промотор, который обеспечивает сверхэкспрессию в микроорганизме эндогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу.

В другом варианте осуществления микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу. Например, микроорганизм трансформирован экспрессирующим вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу, функционально связанную с регуляторной последовательностью.

Предпочтительно, микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу.

Предпочтительно, микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей экзогенную ксилозоизомеразу.

Предпочтительно, микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей экзогенную ксилозоизомеразу, происходящую из видов Lactococcus.

В предпочтительном варианте осуществления микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную в качестве SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20, или ее вариант, гомолог или производное.

В более предпочтительном варианте осуществления микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную в качестве SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20, или ее вариант, гомолог или производное.

В предпочтительном варианте осуществления микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением трансформирован нуклеотидной последовательностью, представленной в качестве SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 28, или ее вариантом, гомологом или производным.

В более предпочтительном варианте осуществления микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением трансформирован нуклеотидной последовательностью, представленной в качестве SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 28, или ее вариантом, гомологом или производным.

В одном аспекте микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением трансформирован двумя или более нуклеотидными последовательностями, кодирующими ксилозоизомеразу.

Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая ксилозоизомеразу, упомянутую в настоящем документе, представляет собой кодирующий ее экспрессирующий вектор.

Предпочтительно, экспрессирующий вектор, упомянутый в настоящем документе, содержит промотор, способный сверхэкспрессировать нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу. Примеры таких промоторов включают промотор GPD, промотор TEF и промотор ADP. Предпочтительные промоторы, которые можно использовать для сверхэкспрессии ксилозоизомеразы, могут представлять собой любые из регуляторных элементов, контролирующих экспрессию нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки, вовлеченные в гликолиз и ферментацию глюкозы.

В одном варианте осуществления в способе в соответствии с настоящим изобретением микроорганизм трансформируют нуклеотидной последовательностью, которая обеспечивает сверхэкспрессию микроорганизмом ксилозоизомеразы. Например, в геном микроорганизма встраивают промотор, который обеспечивает сверхэксирессию микроорганизмом эндогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу. В следующем примере в геном микроорганизма встраивают промотор, который обеспечивает конститутивную экспрессию микроорганизмом эндогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу.

В другом варианте осуществления в способе в соответствии с настоящим изобретением микроорганизм трансформируют нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу.

Например, микроорганизм трансформируют экспрессирующим вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу, функционально связанную с регуляторной последовательностью.

В следующем примере микроорганизм трансформируют экспрессирующим вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу, функционально связанную с регуляторной последовательностью, где указанная регуляторная последовательность обеспечивает конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу.

Предпочтительно, в способе в соответствии с настоящим изобретением, микроорганизм трансформируют нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу.

Предпочтительно, в способе в соответствии с настоящим изобретением, микроорганизм трансформируют нуклеотидной последовательностью, кодирующей экзогенную ксилозоизомеразу.

В предпочтительном варианте осуществления в способе в соответствии с настоящим изобретением микроорганизм трансформируют нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 28, или ее вариант, гомолог или производное.

В предпочтительном варианте осуществления в способе в соответствии с настоящим изобретением микроорганизм трансформируют нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в качестве SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20, или ее вариант, гомолог или производное.

В одном аспекте в способе в соответствии с настоящим изобретением микроорганизм трансформируют двумя или более нуклеотидными последовательностями, кодирующими ксилозоизомеразу.

В способе в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая ксилозоизомеразу, представляет собой кодирующий ее экспрессирующий вектор.

Как используют в настоящем документе термин "способ ферментации" относится к культивированию микроорганизма или микроорганизмов в аэробных и анаэробных условиях.

В одном варианте осуществления культуральная среда содержит ксилозу и/или источник ксилозы.

В одном варианте осуществления культуральная среда содержит пентозный сахар и/или источник пентозного сахара. Предпочтительно, пентозный сахар представляет собой ксилозу. В одном варианте осуществления пентозный сахар происходит и/или является получаемым из лигноцеллюлозного материала.

Альтернативно или дополнительно, культуральная среда содержит материал, происходящий из лигноцеллюлозного материала.

Предпочтительно, способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, включает стадию получения биотоплива из культуральной среды.

В одном варианте осуществления продукт, происходящий из ксилозы, выбран из группы, состоящей из ксилулозы, ксилулозо-5-фосфата, этанола, ароматических аминокислот, молочной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты, ацетальдегида, фурфураля, итаконовой кислоты, глутаминовой кислоты, лимонной кислоты, крезола, лизина, 3-гидроксипропионовой кислоты, поли-3-гидроксиалканоатов, протокатеховой кислоты, пирокатехола, гваякола, вератрола, резвератрола, ванилина, ванилиновой кислоты, ванилинового спирта, муконовой кислоты, адипиновой кислоты, 4-гидроксибензойной кислоты, 4-гидроксибензальдегида, 4-метоксибензойной кислоты, 4-аминобензоата, 4-гидроксианилина, 4-метоксианилина, хинола, анизола, фенола, антраниловой кислоты, 3-гидроксиантранилата, 2,3-дигидроксибензойной кислоты, 2-аминофенола, 1,4-циклогександиона, изопрена и стирола.

Предпочтительно, продукт, образованный из ксилозы, выбран из группы, состоящей из ксилулозы, ксилулоза-5-фосфата, этанола, ароматических аминокислот, молочной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты, ацетальдегида, фурфураля, итаконовой кислоты, глутаминовой кислоты, лимонной кислоты, крезола, лизина, 3-гидроксипропионовой кислоты и поли-3-гидроксиалканоатов.

В высоко предпочтительном варианте осуществления продукт, образованный из ксилозы, представляет собой этанол.

Как используют в настоящем документе, термин "сверхэкспрессирует" в выражении "нуклеотидная последовательность, которая обеспечивают сверхэкспрессию микроорганизмом ксилозоизомеразы" и "промотор, способный сверхэксирессировать нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу" относится к повышению экспрессии от нулевого уровня до некоторого у