Консорциум штаммов микроорганизмов acinetobacter sp. и ochrobactrum sp., используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов

Консорциум штаммов микроорганизмов acinetobacter sp. и ochrobactrum sp., используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов

Реферат

Изобретение относится к микробиологической промышленности, касается нового консорциума штаммов бактерий-деструкторов нефти и нефтепродуктов, обладающего нитрогеназной активностью (способностью к фиксации атмосферного азота), и может быть использовано для очистки почв и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами в сокращенные сроки.

Известен штамм Pseudomonas putida 36, обладающий способностью к биодеградации нефти и нефтепродуктов [1].

Недостатком данного штамма является то, что он растет и утилизирует нефть очень медленно и лишь при высокой температуре (28-42°C). На 30 сутки Pseudomonas putida 36 утилизирует 68-74% нефти.

Известен штамм Bacillus species 739 [2] и полученный на его основе бактериальный препарат «Бациспецин» [3], используемый для рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Недостатком штамма является его низкая эффективность, особенно в условиях высокого содержания нефти и нефтепродуктов в углеводородсодержащем субстрате.

Наиболее близким техническим решением является препарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, включающий консорциум из двух бактериальных штаммов Bacillus brevis ИБ ДТ5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ5-3 [4] (прототип).

Недостатком известного препарата является его неспособность к фиксации атмосферного азота, что очень важно при утилизации углеводородов, загрязняющих почву и воду, так как избыток нефти и нефтепродуктов влияет на соотношение углерод:азот в системе и это требует дополнительного внесения источника азота для успешной утилизации углеводородов.

Технической задачей изобретения является получение консорциума штаммов бактерий, способных к фиксации атмосферного азота с переводом его в легкодоступную форму и обладающих высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в широком диапазоне содержания последних в углеводородсодержащем субстрате в сокращенные сроки.

Полученный консорциум штаммов бактерий выделен из серой лесной почвы, искусственно загрязненной дизельным топливом, и хранится в Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН.

Полученный консорциум состоит из двух штаммов микроорганизмов, каждый из которых депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов и характеризуется следующими признаками.

Характеристика штамма Acinetobacter sp. № ИБ ДТ-5.1/1 (VKM В - 2753D).

Грамотрицательные неподвижные толстые короткие палочки, встречаются кокковидные одиночные или сдвоенные, размножаются делением: перетяжка и перегородка, каталазоположительные, оксидазоотрицательные, индол, сероводород не образуют; желатину не разжижает; молоко не изменяет, подщелачивает; нитраты не восстанавливает. Из источников углерода ассимилирует: глюкозу, сахарозу, галактозу, маннозу, раффинозу, крахмал, сорбит, глицерин. На МПА образует белые гладкие блестящие колонии, профиль равномерно возвышающийся, край ровный, диаметр 2,0-2,5 мм. Способен окислять углеводороды нефти. Растет в пределах температур 6-30°C, при pH среды 5,8-7,8. Непатогенен. Хранится на косяках МПА и в лиофилизированном состоянии при температуре +4°C.

Характеристика штамма Ochrobactrum sp. № ИБ ДТ-5.3/2 (VKM В - 2754D).

Грамотрицательные плеоморфные одиночные палочки, с возрастом укорачиваются до кокков. На плотных питательных средах образуют круглые матового цвета плоские гладкие непрозрачные колонии, по краям менее плотные, чем в центре. Сапрофит. Аэроб. Каталазоположителен, оксидазоотрицателен. Метаболизм окислительного типа. Хорошо усваивает сахарозу, фруктозу, мальтозу, лактозу, ксилозу, маннит, маннозу, арабинозу, L-рамнозу, глицерин. При выращивании на глюкозе образует газ. Усваивает аспарагин, аргинин, аланин; слабо усваивает валин, лизин. Потребляет цитраты в качестве единственного источника углерода. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индол не образует. Реакция Вогес-Проскауэра отрицательная. Отсутствие роста на среде с 6% NaCl. Способен окислять углеводороды нефти. Растет в пределах температур 6-30°C, при pH среды 5,8-7,8. Непатогенен. Хранится на косяках МПА и в лиофилизированном состоянии при температуре +4°C.

Пример 1. Консорциум штаммов Acinetobacter sp. № ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum sp. № ИБ ДТ-5.3/2 после ферментации на питательной среде Эшби следующего состава, г/л: маннит - 20; NaCl - 0,2; CaCO₃ - 5,0; K₂SO₄ - 0,1; K₂HPO₄ - 0,2; MgSO₄·7H₂O - 0,2; вода дистиллированная - 1000 мл, не содержащей источников азота, способен к фиксации атмосферного азота в количестве 0,18 мкг N₂/мл/ч. Нитрогеназную активность определяли хроматографически ацетиленовым методом [5]. Консорциум по прототипу не способен к фиксации атмосферного азота.

Пример 2. Консорциум штаммов Acinetobacter sp. № ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum sp. № ИБ ДТ-5.3/2 выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: Na₂CO₃ - 0,1; CaCl₂ - 0,01; MnSO₄·7H₂O - 0,02; FeSO₄·7H₂O - 0,02; NaH₂PO₄ - 1,5; K₂HPO₄ - 1,0; MgSO₄·7H₂O - 0,2; NH₄NO₃ - 2,0; вода дистиллированная - 1000 мл.

Изучена деструктирующая активность консорциума штаммов при его выращивании на минеральной среде вышеуказанного состава с внесением в качестве единственного источника углерода дизельного топлива. Среду разливают по 100 мл в колбы объемом 250 мл и стерилизуют при 1 атм в течение 30 минут. Засевают 2% бактериальной суспензии, дизельное топливо вносят стерильно в количестве 1; 5; 10; 15 мас.%. Выращивание осуществляют стационарно при комнатной температуре, обеспечивая аэрацию путем принудительной подачи воздуха при помощи микрокомпрессора (расход воздуха 0,2 л/мин). В виде контроля ставят такую же колбу с добавкой 100 мл среды, соответствующего количества нефтепродуктов без клеток микроорганизмов. Параллельно ставят такую же колбу со средой, нефтепродуктами и клетками консорциум из двух бактериальных штаммов Bacillus brevis ИБ ДТ5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ5-3 для сравнения их утилизирующей способности в одинаковых условиях. По окончании эксперимента (через 7 суток) культуральную жидкость экстрагируют гексаном, биомассу клеток удаляют, остаток нефтепродуктов высушивают до постоянного веса. Сравнивают «сухой» вес остатка нефтепродуктов в контроле и в опытных пробах, находят процент утилизации нефтепродуктов. Сравнительные данные утилизации нефтепродуктов представлены в табл.1.

Пример 3. Как в примере 2, только в питательной среде отсутствует источник азота NH₄NO₃. Сравнительные данные утилизации нефтепродуктов представлены в табл.1.

Таким образом, приведенные в таблице результаты экспериментов свидетельствуют о высокой степени утилизации нефтепродуктов предлагаемым консорциумом штаммов микроорганизмов Acinetobacter sp. № ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum sp. № ИБ ДТ-5.3/2. Преимуществом консорциума является его эффективность в широком диапазоне содержания нефтепродуктов в углеводородсодержащем субстрате даже в отсутствие азотного питания за счет способности к фиксации атмосферного азота (нитрогеназной активности).

Таблица 1
Степень утилизации (мас.%) нефтепродуктов микроорганизмами в зависимости от присутствия источника азота в среде
Штамм	Наличие (+) - отсутствие (-) источника азота в среде	1,0	5,0	10,0	15,0
Консорциум Acinetobacter sp. № ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum sp. № ИБ ДТ-5.3/2	+	93,80	93,75	62,18	56,14
-	93,80	93,70	62,10	55,89
Консорциум Bacillus brevis ИБ ДТ5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ5-3 (по прототипу)	+	93,80	93,70	59,42	54,40
-	40,18	30,56	19,24	18,88

Список литературы

1. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья // Почвоведение. - 1990, №9. - С.148-151.

2. Авторское свидетельство СССР №1743019, кл. C12N 1/20, 1989.

3. Патент РФ №2077397, кл. С09K 3/32, 1997.

4. Патент РФ №2232806, кл. C12N 1/20, 2004.

5. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1986. - 136 с.

Консорциум штаммов микроорганизмов Acinetobacter sp. ВКМ В-2753D и Ochrobactrum sp. ВКМ В-2754D, обладающий нитрогеназной активностью, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.