Полипептид, обладающий активностью d-лактатдегидрогеназы, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и способ получения d-молочной кислоты

Полипептид, обладающий активностью d-лактатдегидрогеназы, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и способ получения d-молочной кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому полипептиду, используемому для получения D-молочной кислоты, где указанный полипептид обладает активностью D-лактатдегидрогеназы; к полинуклеотиду, кодирующему данный полипептид; и к трансформанту, в который был встроен полинуклеотид. Настоящее изобретение также относится к способу получения D-молочной кислоты, который включает культивирование трансформанта.

Предпосылки создания изобретения

Исходя из положения нейтральности углерода, уделялось особое внимание полимолочным кислотам (ПМК), которые в качестве исходного материала используют возобновляемый источник, биомассу. ПМК характеризуются относительно низкой стоимостью и термоустойчивостью, поскольку имеют точку плавления примерно 170°C; и в этой связи ожидается, что они будут представлять собой биодеградируемый полимер, который можно формовать в расплавленном состоянии. Кроме того, известно, что стереокомплексные полимолочные кислоты могут быть получены при смешивании поли-L-молочной кислоты и поли-D-молочной кислоты (патентные документы 1-3). Известны стереокомплексные полимолочные кислоты, которые имеют более высокую точку плавления и повышенную способность к кристаллизации, в сравнении с единичными полимерами, и позволяют создавать формованные изделия, такие как изделия, изготовленные из волокна, пленок и смол. В случае обоих указанных исходных материалов, L-молочной кислоты и D-молочной кислоты, имеется потребность в способе их получения с высокой чистотой и высокой эффективностью.

В природе существуют бактерии, которые эффективно продуцируют молочные кислоты, такие как молочнокислые бактерии, и некоторые из соответствующих способов продукции молочной кислоты с использованием таких бактерий уже нашло практическое применение. Примеры бактерий, которые эффективно продуцируют L-молочную кислоту, включают Lactobacillus delbrueckii. Дополнительно, в качестве бактерий, которые эффективно продуцируют D-молочную кислоту, известны такие микроорганизмы, как Sporolactobacillus laevolacticus (патентный документ 4). Во всех этих случаях количество накопленной молочной кислоты достигало высокого уровня в условиях анаэробной культуры; однако, поскольку D-молочная кислота и L-молочная кислота образуются как побочный продукт при ферментации L-молочной кислоты и ферментации D-молочной кислоты, соответственно, оптическая чистота снижается. Кроме того, чрезвычайно трудно разделять эти молочные кислоты.

В этой связи в качестве способа получения молочной кислоты с высокой оптической плотностью, рассматривался вариант встраивания гена, кодирующего L-лактатдегидрогеназу или D-лактатдегидрогеназу в дрожжи, которые не обладали природной способностью к продукции молочной кислоты, и далее проводили ферментацию L-молочной кислоты и D-молочной кислоты (патентные документы 4-6 и непатентный документ 1). В том, что касается ферментации L-молочной генетически сконструированными дрожжами, то введение высоко активного гена из Xenopus laevis, который кодирует L-лактатдегидрогеназу, позволяет эффективно осуществлять ферментацию молочной кислоты с достижением высокой оптической чистоты (патентный документ 4). С другой стороны, в том, что касается ферментации D-молочной кислоты с использованием генетически сконструированных дрожжей, то, хотя D-молочная кислота с высокой оптической чистотой может быть получена таким же способом, как и в случае ферментации L-молочной кислоты, достижение хорошего выхода представляет собой проблему (патентные документы 5 и 6 и непатентный документ 1).

Документы, описывающие уровень техники

Патентные документы

Патентный документ 1: JP S61-36321A

Патентный документ 2: JP S63-241024A

Патентный документ 3: JP 2000-17163A

Патентный документ 4: WO2007/043253

Патентный документ 5: JP 2007-074939A

Патентный документ 6: WO2004/104202

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Ishida N et al., Journal of Bioscience and Bioengineering (2006), 101, 172-7.

Краткое описание сущности изобретения

Проблемы, которые разрешает настоящее изобретение

Целью настоящего изобретения является достижение высокопродуктивной ферментации D-молочной кислоты с использованием полипептида, обладающего D-лактатдегидрогеназной активностью, которая превышает таковую для обычных полипептидов и полинуклеотида, кодирующего соответствующий полипептид.

Способы решения проблем

Авторы настоящего изобретения провели масштабное и интенсивное изучение большого числа D-лактатдегидрогеназ с целью выявления полипептида, который усиливает продукцию D-молочной кислоты и обладает D-лактатдегидрогеназной активностью с образованием при этом небольшого количества побочного продукта, а также полинуклеотида, кодирующего полипептид, что составило суть настоящего изобретения.

Соответственно, настоящее изобретение относится к следующим элементам.

(1) Полипептид, который представляет собой любой из указанных ниже полипептидов (A)-(C):

(A) полипептид с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2;

(B) полипептид с той же аминокислотной последовательностью, которая показана в SEQ ID NO:1 или 2; с тем исключением, что одна или несколько аминокислот замещены, делетированы, встроены и/или добавлены, где указанный полипептид обладает D-лактатдегидрогеназной активностью; и

(С) полипептид с аминокислотной последовательностью, которая характеризуется идентичностью по последовательности на уровне менее 80% с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, где указанный полипептид обладает D-лактатдегидрогеназной активностью.

(2) Полинуклеотид, который представляет собой один из указанных ниже полинуклеотидов (a)-(e):

(a) полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:3 или 4;

(b) полинуклеотид с той же нуклеотидной последовательностью, которая показана в SEQ ID NO:3 или 4, с тем исключением, что в ней один или несколько нуклеотидов замещены, делетированы, встроены и/или добавлены, где указанный полинуклеотид кодирует полипептид, обладающий D-лактатдегидрогеназной активностью;

(c) полинуклеотид, который гибридизуется в жестких условиях с полноразмерным полинуклеотидом или его частью, где указанный полинуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:3 или 4, или с его комплементарной цепью, где указанный полинуклеотид кодирует полипептид, обладающий D-ЛДГ активностью;

(d) полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, которая характеризуется идентичностью по последовательности на уровне не менее чем 80% с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:3 или 4, где указанный полинуклеотид кодирует полипептид, обладающий D-лактатдегидрогеназной активностью; и

(e) полинуклеотид, кодирующий полипептид, соответствующий п.(1).

(3) Конструкция ДНК, в которой соединены полинуклеотид по п.(2) и промотор, способный осуществлять экспрессию полинуклеотида.

(4) Конструкция ДНК по п.(3), отличающаяся тем, что указанный выше промотор представляет собой промотор гена пируватдекарбоксилазы 1 (ген PDC1), гена супрессии экспоненциального дефекта 1 (ген SED1) или гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы 3 (ген TDH3).

(5) Конструкция ДНК по п.(3) или (4), где указанный выше промотор выбран из любого промотора (I)-(III):

(1) промотор с нуклеотидной последовательностью, показанной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 5-7;

(II) промотор с нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 5-7, или с нуклеотидной последовательностью, включающей ее часть; и

(III) промотор с той же нуклеотидной последовательностью, которая была показана в любой из последовательностей SEQ ID NO: 5-7, с тем исключением, что в ней один или несколько нуклеотидов делетированы, замещены и/или добавлены.

(6) Трансформант, в который введен полинуклеотид по п.(2) или введена конструкция ДНК по любому из (3)-(5).

(7) Трансформированные дрожжи, в которые введен полинуклеотид по (2) или введена конструкция ДНК по любому из пп.(3)-(5).

(8) Трансформированные дрожжи по п.(7), в которых по меньшей мере один ген из группы, включающей ген пируватдегидрогеназы 1 (ген PDC1), ген супрессии экспоненциального дефекта 1 (ген SED1) и ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы 3 (ген TDH3) из указанных выше трансформированных дрожжей, замещен полинуклеотидом по п.(2) или конструкцией ДНК по любому из пп.(3)-(5).

(9) Трансформированные дрожжи по п.(8), в которых по меньшей мере один из указанных выше генов представляет собой ген PDC1.

(10) Способ получения D-молочной кислоты, который включает стадию культивирования трансформанта по п.(6) или трансформированных дрожжей по любому из пп.(7)-(9).

(11) Трансформант, в котором полинуклеотид, кодирующий D-лактатдегидрогеназу, получен из семейства Limulidae или конструкции ДНК, в которую встроены слитый полинуклеотид и промотор, способный осуществлять экспрессию указанного полинуклеотида.

(12) Трансформированные дрожжи, в которых полинуклеотид, кодирующий D-лактатдегидрогеназу, получен из рода Limulus или конструкции ДНК, в которую встроены слитый полинуклеотид и промотор, способный осуществлять экспрессию указанного полинуклеотида.

(13) Трансформированные дрожжи по п.(12), в которых по меньшей мере один ген из группы, включающей ген пируватдегидрогеназы 1 (ген PDC1), ген супрессии экспоненциального дефекта 1 (ген SED1) и ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы 3 (ген TDH3) из указанных выше трансформированных дрожжей, замещен указанным выше полинуклеотидом, кодирующим D-лактатдегидрогеназу из семейства Limulidae, или конструкцией ДНК, в которую встроены слитые полинуклеотид и промотор, способный осуществлять экспрессию полинуклеотида.

(14) Способ получения D-молочной кислоты, включающий стадию культивирования трансформанта по п.(11) или трансформированных дрожжей по п.(12) или (13).

Эффекты, достигаемые при осуществлении настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к полипептиду, обладающему D-лактатдегидрогеназной активностью, подходящей для энзиматической продукции D-молочной кислоты, и к полинуклеотиду, кодирующему указанный полипептид. Дополнительно, при использовании полинуклеотида по настоящему изобретению может быть легко получен трансформант с высокой продуктивной способностью по D-молочной кислоте и, в свою очередь, может быть эффективно получена D-молочная кислота с высокой чистотой при культивировании данного трансформанта.

Краткое описание фигур

На фиг.1 проиллюстрированы процедуры создания штаммов дрожжей SU042 по настоящему изобретению.

На фиг.2 показаны результаты, получаемые при непрерывном культивировании штамма дрожжей со слитыми мембранами SU042 по настоящему изобретению.

Способ осуществления настоящего изобретения

Ниже приводится подробное описание способов осуществления настоящего изобретения.

Термин "D-лактатдегидрогеназная (далее обозначаемая как "D-ЛДГ") активность" (или, альтернативно, “активность "D-лактатдегидрогеназы (D-ЛДГ”)) представляет собой активность, направленную на превращение восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) и пировиноградной кислоты в D-молочную кислоту и окисленный никотинамидадениндинуклеотид (НАД+).

Настоящее изобретение относится к полипептиду с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:1 или 2 или их гомологу, где указанный полипептид обладает D-ЛДГ активностью.

Полипептид с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, представляет собой полипептид. полученный из Limulus polyphemus, который относится к семейству Limulidae и роду Limulus.

Примеры гомолога полипептида с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, включают полипептид с той же аминокислотной последовательностью, которая показана в SEQ ID NO:1 или 2, с тем исключением, что одна или несколько, предпочтительно 1-10, более предпочтительно 1-5, еще более предпочтительно 1 или 2 аминокислоты замещены, делетированы, встроены и/или добавлены, где указанный полипептид также обладает D-ЛДГ активностью.

Кроме того, гомолог полипептида, показанного в SEQ ID NO:3 или 4, может также представлять собой полипептид с аминокислотной последовательностью, которая характеризуется идентичностью по последовательности на уровне не менее чем 80%, предпочтительно 90%, более предпочтительно не менее чем 95%, к аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, где указанный полипептид также обладает D-ЛДГ активностью. Согласно настоящему изобретению, идентичность на уровне последовательности любой рассматриваемой аминокислотной последовательности может быть легко определена с использованием хорошо известной в данной области программы BLAST. Любой специалист со средним уровнем знаний в данной области может с помощью программы BLAST, доступной через сайт Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI; National Center for Biotechnology Information), легко проверить идентичность, используя заданные параметры.

Кроме того, гомолог полипептида с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, может также представлять собой полипептид, полученный из живого организма из семейства Limulidae, предпочтительно, живого организма из рода Limulus или Tachypleus, более предпочтительно, из Limulus polyphemus, относящегося к роду Limulus, или из Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas или Tachypleus rotundicauda, относящихся к роду Tachypleus, где указанный полипептид обладает D-ЛДГ активностью.

Полипептид с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, может быть экстрагирован из Limulus polyphemus по известному способу или может быть получен с использованием известного метода пептидного синтеза. Кроме того, указанный полипептид может быть также получен в рамках методов рекомбинантной технологии с использованием полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1 или 2. Указанный полипептид с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, может быть также экстрагирован из живого организма, относящегося к роду Tachypleus, по известному способу или может быть получен по известному методу пептидного синтеза. Кроме того, указанный полипептид может быть также получен в рамках методов рекомбинантной генной технологии с использованием полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствующую данному полипептиду.

Гомолог полипептида с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, может обладать улучшенной D-ЛДГ активностью и/или повышенной термостабильностью, в сравнении с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1 или 2. В контексте настоящего описания термин "улучшенная D-ЛДГ активность" обозначает более высокие показатели по сродству к субстрату и молекулярной активности (Kcat) применительно к пировиноградной кислоте и НАДН, а также смещение оптимального для ферментативной активности полипептида значения pH ближе в тому значению pH, которое подходит для роста клеток, экспрессирующих данный полипептид. Такой полипептид может быть искусственно сконструирован на основе полипептида аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, или может быть выделен из природного источника. Кроме того, в ген D-лактатдегидрогеназы может быть введена случайная мутация по методу эволюционной молекулярной инженерии для скрининга предпочтительного полипептида.

Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:3 или 4, или к ее гомологу, где указанный полинуклеотид кодирует полипептид, обладающий D-ЛДГ активностью. В контексте настоящего описания источник "полинуклеотида" не имеет значения, и такой полинуклеотид может представлять собой кДНК, геномную ДНК, синтетическую ДНК, мРНК, синтетическую РНК, репликон РНК; однако, предпочтительно, - это ДНК или РНК, более предпочтительно, ДНК. Кроме того, рассматриваемый "полинуклеотид" может быть одноцепочечным или двуцепочечным, содержащим комплементарную цепь. Дополнительно, указанный "полинуклеотид" может также содержать природное или искусственно полученное нуклеотидное производное.

Полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:3 или 4, представляет собой такой полинуклеотид, который был получен из Limulus polyphemus и который характеризуется тем, что он кодирует полипептид, обладающий указанной выше D-ЛДГ активностью.

Примеры гомолога полинуклеотида, показанного в SEQ ID NO:3 или 4, включают полинуклеотид с той же нуклеотидной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:3 или 4, с тем исключением, что один или несколько, предпочтительно 1-40, более предпочтительно, 1-30, еще более предпочтительно, 1-20, особенно предпочтительно, 1-10, и наиболее предпочтительно, от 1 до 5 нуклеотидов замещены, делетированы, встроены и/или добавлены в нее, где указанный полинуклеотид также кодирует полипептид, обладающий D-ЛДГ активностью.

Другие примеры гомолога полинуклеотида, показанного в SEQ ID NO:3 или 4, также включают полинуклеотид, который гибридизуется в жестких условиях с полноразмерным полинуклеотидом или его частью, где указанный полинуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:3 или 4, или соответствует ее комплементарной цепи, и где указанный полинуклеотид также кодирует полипептид, обладающий D-ЛДГ активностью. В контексте настоящего описания фраза "полинуклеотид, который гибридизуется в жестких условиях" относится, например, к полинуклеотиду, который гибридизуется в рамках известного метода гибридизации (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wily & Sons, Section 6.3-6.4) или аналогичной процедуры, при использовании в качестве одного или нескольких зондов одного или большего числа полинуклеотидов, которые включают по меньшей мере 20, предпочтительно 25, более предпочтительно, по меньшей мере 30 произвольно выбранных последовательных нуклеотидов из исходной нуклеотидной последовательности. В контексте настоящего описания гибридизация в жестких условиях может быть достигнута, например, при проведении гибридизации в 50% формамиде при температуре гибридизации 37°C, а также при 42°C для создания более жестких условий, и при 65°C для создания еще более жестких условий, с последующей промывкой полученной смеси с использованием 0,1x-2x раствора SSC (солевой раствор-цитрат натрия) (состав 1 × SSC раствора: 150 мМ хлорида натрия и 15 мМ цитрата натрия).

Кроме того, гомолог полинуклеотида, показанного в SEQ ID NO:3 или 4, может также представлять собой полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, которая характеризуется идентичностью по последовательности на уровне не менее чем 80%, более предпочтительно, не менее 90%, еще более предпочтительно, не менее 95%, к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:3 или 4, где указанный полипептид, обладающий D-ЛДГ активностью. Идентичность используемой в настоящем изобретении нуклеотидной последовательности полинуклеотида на уровне последовательности может быть определена с использованием описанной выше программы для генного анализа BLAST или другой аналогичной программы.

Дополнительно, гомолог полинуклеотида, показанного в SEQ ID NO:3 или 4, может также представлять собой полинуклеотид, полученный из живого организма, относящегося к семейству Limulidae, предпочтительно живого организма, относящегося к роду Limulus или Tachypleus, более предпочтительно, Limulus polyphemus, Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas или Tachypleus rotundicauda, где указанный полипептид обладает D-ЛДГ активностью.

Хотя описанный выше полинуклеотид может быть получен при клонировании из живого организма, относящегося к семейству Limulidae, предпочтительно, из живого организма, относящегося к семейству Limulidae и роду Limulus (которые далее в целом обозначаются как "Limulus"), он также может быть синтезирован химически или по методу Fujimoto et al. (Hideya Fujimoto, Production Method of Synthetic Gene, Plant Cell Engineering Series 7, Plant PCR Experimental Protocol, 1997, Shujunsha Co., Ltd., рр.95-100), известному как метод синтеза длинноцепочечной ДНК. Обычно полинуклеотид, клонированный из Limulus, может быть выделен по известному методу. Примеры таких методов включают любой метод, в соответствии с которым с использованием праймера, синтезированного на основе последовательности кДНК, которая характеризуется высокой консервативностью по D-лактатдегидрогеназе, где указанная кДНК была получена из поли A(+)РНК, выделенной из Limulus hemocytes, амплифицируют и секвенируют частичный фрагмент и затем определяют полную последовательность ORF по процедурам 5'-RACE и 3'-RACE, с последующей амплификацией в рамках реакции ПЦР с получением полинуклеотида. Дополнительно, клонирование из Limulus может быть также осуществлено при комплементировании функции D-лактатдегидрогеназы. Соответствующий принцип метода подробно описан в работе DOMINIQUE, G., Appl Environ. Microbiol, United States (1995), 61, 266-272. Таким же образом, полинуклеотид по настоящему изобретению, нуклеотидная последовательность которого уже определена, может быть получен из Limulus hemocytes; однако он может быть также напрямую синтезирован химически с использованием синтезатора ДНК.

В настоящем описании указанный выше полинуклеотид может быть модифицирован в нужном направлении при введении соответствующих мутаций за счет одного или нескольких замещений, одной или нескольких делеций, одной или нескольких вставок и/или добавлений к его нуклеотидной последовательности или соответствующей аминокислотной последовательности по стратегии сайт-специфического мутагенеза (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wily & Sons Section 8.1-8.5) или аналогичной стратегии. При этом, такая модификация аминокислотной последовательности полипептида или нуклеотидной последовательности полинуклеотида не ограничивается процедурами искусственного введения или синтеза мутации, но охватывает не только модификации, достигаемые за счет искусственного введения мутации, но также природные модификации, возникающие в результате мутации аминокислот.

Описанный выше полинуклеотид может использоваться для получения клеток, продуцирующих D-молочную кислоту, путем генной рекомбинации. Для того, чтобы клетка-хозяин, в которую полинуклеотид по настоящему изобретению был введен путем генной рекомбинации (далее называемая просто "трансформант"), стала способной продуцировать D-молочную кислоту, необходимо, чтобы полипептид, обладающий D-ЛДГ активностью и который кодируется данным полинуклеотидом, экспрессировался в трансформанте. В этом случае в рамках способа, позволяющего достичь экспрессии полипептида, обладающего D-ЛДГ активностью, можно использовать конструкцию ДНК, в которой связаны полинуклеотид и промотор, способный осуществлять его экспрессию, то есть конструкцию ДНК, в которой полинуклеотид связан с 3'-концом промотора, и такая конструкция ДНК также включается в область настоящего изобретения. Указанная конструкция ДНК по настоящему изобретению может быть получена по способу, в соответствии с которым полинуклеотид (ДНК) по настоящему изобретению и промотор, способный экспрессировать указанный полинуклеотид, каждый расщепляют, одним или несколькими, ферментом(ами) рестрикции и затем встраивают в сайт фермента рестрикции или в сайт множественного клонирования описанного ниже вектора ДНК, подлежащего слиянию, или проводят связывание полинуклеотида (ДНК) по настоящему изобретению и промотора в рамках реакции ПЦР.

В предпочтительном варианте описанной выше конструкции ДНК указанная конструкция ДНК переносится вектором, таким как плазмида (ДНК), бактериофаг (ДНК), ретротранспозон (ДНК) или искусственная хромосома (например, YAC, PAC, BAC или MAC). В зависимости от способа введения конструкции ДНК (внутрь генома хозяина или за его пределами) и типа клетки-хозяина, выбирают прокариотический вектор, эукариотический вектор, вектор на основе животной клетки или вектор на основе растительной клетки из числа известных в данной области.

Согласно настоящему описанию, примеры плазмиды включают шаттл-векторы YCp-типа Escherichia coli-дрожжей, такие как pRS413, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 и pAUR123; шаттл-векторы YEp-типа Escherichia coli-дрожжей, такие как pYES32 и Yep13; шаттл-векторы YIp-типа Escherichia coli-дрожжей, такие как pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pAUR101 и pAUR135; плазмиды, происходящие из Escherichia coli (например, плазмиды ColE-типа, такие как pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG396 и pTrc99A; плазмиды p1A-типа, такие как pACYC177 и pACYC184; и плазмиды pSC101-типа, такие как pMW118, pMW119, pMW218 и pMW219); а также плазмиды, происходящие из Bacillus subtilis (такие как pUB110 и pTP5). Примеры бактериофага включают λ-фаги (такие как Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt100, gt11 и zap), φX174, M13mp18 и M13mp19. Примером ретротранспозона является Ty фактор и пример YAC включает pYACC2.

Термин "промотор" в описанной выше конструкции ДНК означает нуклеотидную последовательность, вовлекаемую в инициацию транскрипции мРНК для данного рассматриваемого гена и обычно относится к последовательности против направления считывания информации от 5'-конца гена, имеющегося в хромосоме. Длина нуклеотидной последовательности промотора составляет предпочтительно 1-3000 п.н., более предпочтительно, 1-1000 п.н.; однако она особым образом не ограничивается, главное, чтобы такая нуклеотидная последовательность выполняла функцию инициации транскрипции мРНК гена, расположенного по направлению считывания информации. Кроме того, известны мутации и действия, направленные на улучшение транскрипционной активности промотора, и термин "промотор" также включает такие промоторы, которые были модифицированы по известному в данной области способу. Промотор в указанной выше конструкции ДНК особым образом не ограничивается, главное, чтобы он обладал промоторной активностью в трансформанте, при введении в составе конструкции ДНК; однако, как будет описано ниже, поскольку предпочтительно, чтобы конструкция ДНК по настоящему изобретению вводилась в дрожжи, промотор предпочтительно функционирует в дрожжах.

Предпочтительные примеры промотора, функционирующего в дрожжах, включают промоторы гена кислой фосфатазы (PH05), генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (TDH1, 2 и 3), генов алкогольдегидрогеназы (ADH1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7), генов, связанных с метаболизмом галактозы (GAL1, 7 и 10), гена цитохрома c (CYC1), гена триозофосфатизомеразы (TP11), гена фосфоглицераткиназы (PGK1), гена фосфофруктокиназы (PFK1) и генов пируватдекарбоксилазы (PDC1, 5, 6), а также промоторы гена энолазы-1 (ENO1), гена белка клеточной стенки 2 (CWP2) и гена супрессии экспоненциального дефекта 1 (SED1), описание которых и варианты использования которых приведены в международной заявке на патент PCT/JP 2008/072129, и которые демонстрируют экспрессию гена на уровне, не менее чем в 5 раз превышающем средний относительный уровень экспрессии всех генов через 50 часов или позже после начала роста культуры дрожжей.

Более предпочтительные примеры промотора, функционирующего в дрожжах, включают промотор PDC1 и промотор TDH3, которые экспрессируются на высоком уровне в дрожжах на пути продуцирования этанола, и промотор SED1, который экспрессируется на высоком уровне в дрожжах, культивируемых в течение длительного периода времени, и более конкретные примеры включают промотор PDC1 с последовательностью SEQ ID NO:5, промотор SED1 с последовательностью SEQ ID NO:6 и промотор TDH3 с последовательностью SEQ ID NO:7.

При этом промотор PDC1, промотор SED1 или промотор TDH3 могут также иметь, при условии сохранения промоторной активности, нуклеотидную последовательность, соответствующую любой из последовательностей SEQ ID NO: 5-7, соответственно, с тем исключением, что в них один или несколько, предпочтительно 1-40, более предпочтительно 1-30, еще более предпочтительно 1 или 20, особенно предпочтительно 1-10 и наиболее предпочтительно, 1-5 нуклеотидов делетированы, замещены и/или добавлены.

Кроме того, промотор PDC1, промотор SED1 или промотор TDH3 могут также иметь, при условии сохранения промоторной активности, нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:5-7, или с ее частью, соответственно. В контексте настоящего описания фраза нуклеотидная последовательность, которая «гибридизуется в жестких условиях», относится, например, к полинуклеотиду, который гибридизуется в рамках известной процедуры гибридизации (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wily & Sons, Section 6.3-6.4) или аналогичной методики, с использованием в качестве одного или нескольких зондов одного или большего числа выбранных полинуклеотидов, содержащих по меньшей мере 20, предпочтительно 25, более предпочтительно по меньшей мере 30 произвольно отобранных, непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов из исходной нуклеотидной последовательности. Для целей настоящего изобретения жесткие условия могут быть созданы, например, при проведении гибридизации в присутствии 50% формамида при температуре гибридизации 37°C, 42°C - для достижения более жестких условий, 65°C - для еще более жестких условий, с последующей промывкой полученной смеси в растворе 0,1x-2xSSC (солевой раствор-цитрат натрия) (состав раствора 1 × SSC: 150 мМ хлорида натрия и 15 мМ цитрата натрия).

Настоящее изобретение также включает трансформант, полученный при встраивании описанного выше полинуклеотида или конструкции ДНК в клетку-хозяина. Клетка-хозяин особым образом не ограничивается, при условии, что она стабильно удерживает полинуклеотид или конструкцию ДНК, и соответствующие ее примеры включают бактерии, такие как Escherichia coli, Bacillus subtilis и молочнокислые бактерии; дрожжи; клетки насекомых; клетки животных и клетки растений, и предпочтительно используются дрожжи, поскольку они являются кислотоустойчивыми и способны к росту даже в том случае, когда D-молочная кислота продуцируется на высоком уровне при экспрессии полипептида, обладающего D-ЛДГ активностью.

Примеры дрожжей включают дрожжи, относящиеся к роду Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Hansenura, Yarrowia, Zygosaccharomyces, Torulopsis, Debaryomyces, Issachenkia и Fellomyces; и предпочтительно, дрожжи, которые относятся к роду Saccharomyces, Candida или Kluyveromyces, более предпочтительно, Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Candida glabrata, Candida albicans, Candida boidinii, Candida sonorensis, Kluyveromyces lactis или Kluyveromyces marxianus.

Дополнительно, согласно настоящему изобретению, предпочтительно используются полиплоидные дрожжи, поскольку они могут поддерживать высокий уровень продукции D-молочной кислоты в течение длительного периода времени в простых условиях культивирования, так что можно поддерживать стабильную продукцию D-молочной кислоты с низкими затратами. В контексте настоящего описания термин "полиплоидные дрожжи" относится к дрожжам, включающим 2 или больше наборов хромосом в клетке. Число наборов хромосом в полиплоидных дрожжах особо не ограничивается; однако предпочтительными являются диплоидные дрожжи, содержащие 2 набора хромосом. Примеры полиплоидных дрожжей включают пекарские дрожжи, дрожжи для сакэ, винные дрожжи и пивные дрожжи, которые часто используются в бродильном производстве. Подходящие для использования полиплоидные дрожжи могут быть выделены из природной среды или из такого источника, свойства которого были частично модифицированы путем мутации или генной рекомбинации.

Кроме того, в настоящем изобретении предпочтительно используются прототрофные дрожжи, поскольку они не только позволяют использовать культуральную среду, содержащую меньше, чем в случае традиционных сред, количество питательных компонентов, т.е. представляют собой дешевую среду, но также позволяют стабильно поддерживать высокий уровень продукции D-молочной кислоты в течение длительного периода времени в простых условиях культивирования, так что может поддерживаться стабильная продукция молочной кислоты с низкими затратами. В контексте настоящего описания термин "ауксотрофный" означает, что мутация по какой-либо причине присутствует в гене, ответственном за синтез питательного компонента, в дрожжах дикого типа, что сказывается на недостаточной способности синтезировать этот питательный компонент. Соответственно, термин "прототрофные дрожжи" означает такие дрожжи, которые не содержат ауксотрофный генотип или иной генотип, где такой генотип комплементирован. Примеры способа получения прототрофных дрожжей за счет реверсирования ауксотрофной способности у ауксотрофных дрожжей включают способ, согласно которому ауксотрофность реверсируется за счет встраивания гена, отвечающего за синтез питательного компонента, по методу генной рекомбинации; а также способ, согласно которому процессы спаривания дрожжей с разной ауксотрофностью, позволяют формировать сумку для спороношения, и процедуру реверсии ауксотрофности повторяют до тех пор, когда будет достигнута реверсия всех видов ауксотрофности с получением прототрофных дрожжей. Следует также отметить, что определить, являются ли дрожжи прототрофными, можно на основании данных о том, могут ли рассматриваемые дрожжи расти в SD среде, которая представляет собой минимальную ростовую среду для дрожжей.

Дополнительно, дрожжи представляют собой микроорганизм, который осуществляет энергичную ферментацию этанола, и на этом метаболическом пути пировиноградная кислота, являющаяся продуктом гликолиза, превращается пируватдекарбоксилазой в ацетальдегид, который затем превращается в этанол алкогольдегидрогеназой. В этой связи предпочтительно, чтобы в качестве организма-хозяина использовался штамм дрожжей, в котором разрушен ген пируватдекарбоксилазы, служащий исходной точкой на пути метаболизма этанола, поскольку это позволяет достичь естественной метаболизации пировиноградной кислоты на пути метаболизма этанола с последующим использованием на пути метаболизма D-молочной кислоты.

В частности, в случае Saccharomyces cerevisiae, имеются три типа генов, кодирующих пируватдекарбоксилазу: ген пируватдекарбоксилазы 1 (PDC1), ген пируватдекарбоксилазы 5 (PDC5) и ген пируватдекарбоксилазы 6 (PDC6). Известно, что среди этих генов только PDC1 и PDC5 обладают пируватдегидрогеназной активностью в клетках дрожжей; в этой связи предпочтительно использовать штамм с разрушенным геном PDC1 или геном PDC5 и более предпочтительно, использовать штамм, содержащий разрушенный ген PDC1. Кроме того, как описано в JP 2008-048726A, в случае штамма, содержащего разрушенный ген PDC1, предпочтителен штамм, содержащий мутантный ген PDC5, который включает мутацию, приводящую к снижению активности PDC5, и более предпочтителен штамм, содержащий чувствительный к температуре ген PDC5 мутантного типа. В контексте настоящего описания фраза "чувствительный к температуре ген PDC5 мутантного типа" относится к гену PDC5 мутантного типа, который обладает способностью проявлять пируватдекарбоксилазную активность, в отличие от штамма с PDC5 дикого типа, при определенной температуре культивирования, но демонстрирует потерю или снижение активности PDC5 в случае изменения температуры культивирования до уровня, который не ниже определенной температуры культивирования. Нормальная температура культивирования Saccharomyces cerevisiae составляет от 28 до 30°C, и предпочтительно, чтобы температура, при которой проявляется такая температурная чувствительность, была ближе к нормальной температуре культивирования, поскольку это снижает количество тепла, необходимое для изменения температуры культивирования, так что в результате снижается стоимость культивирования. В частности, предпочтительно, чтобы чувствительный к температуре штамм с мутантным типом PDC5 проявлял температурную чувствительность при температуре не ниже 34°C.

Примеры способа, позволяющего достичь экспрессии полипептида с D-ЛДГ активностью в трансформированных дрожжах путем введения описанного(ой) выше полинуклеотида или конструкции ДНК в дрожжи, включают, как уже указывалось, способ, в рамках которого в дрожжи вводится внехромосомно вектор, содержащий конструкцию ДНК, и способ, согласно которому указанный(ую) полинуклеотид или конструкцию ДНК вводят в хромосому дрожжей, и оба этих способа могут использоваться.

В способе введения описанного выше полинуклеотида в хромосому дрожжей предпочтительно используется конструкция, которая содержит полинуклеотид по настоящему изобретению и сегмент ДНК для гомологичной рекомбинации, последовательность которого гомологична последова