Амидогидролазы для приготовления пищевых продуктов или стимуляторов

Амидогидролазы для приготовления пищевых продуктов или стимуляторов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение касается применения амидогидролазы для приготовления пищевых продуктов или стимулятора.

Пищевые продукты, содержащие углеводы, потреблялись людьми во всем мире в течение многих столетий. В настоящее время такие пищевые продукты получают в широком многообразии форм, например в виде хрустящих хлебцев, сухарей, булочек, кренделей с солью, белого хлеба для тостов, сухих завтраков, бисквиты, картофельных чипсов, чипсов тортийя, чипсов, рисовых лепешек и т.д.

Акриламид часто образуется во время обработки или приготовления пищевых продуктов, содержащих углеводы, в особенности во время процессов нагрева, таких, которые имеют место во время выпечки, обжарки, панировки, жарки на гриле или во фритюре, например, и таким образом концентрируется в этих пищевых продуктах. Подобное явление также наблюдается во время приготовления стимуляторов, таких как приготовление кофе, например.

Результаты испытания по концентрации акриламида в пищевых продуктах были впервые опубликованы шведским уполномоченным органом по безопасности пищевых продуктов в апреле 2002 г. В том же году Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) опубликовала отчет, который, среди других вопрос, обсуждал риски для здоровья, которые могли бы возникнуть в результате высокой концентрации акриламида в пищевых продуктах (FAO/WHO: "Health Implications of Acrylamide in Food", Женева 2002 г.).

Акриламид - вещество, которое действует непосредственно на генетический код человека (ДНК). Кроме того, акриламид преобразуется ферментами в печени в глицидамид, который, по оценкам, обладает генотоксичным эффектом. И акриламид и глицидамид образуют соединения с аминокислотами и нуклеиновыми основаниями и поэтому могут изменять структуру и функцию ДНК и гемоглобина, например. Акриламид классифицируется всеми экспертами как канцерогенный, повреждающий ДНК, ядовитый, как вызывающий раздражение, гиперчувствительность и представляющий угрозу для репродуктивной системы.

Самый важный источник для образования акриламида в продуктах - аминокислота аспарагин, которая распространена в пищевых продуктах, таких как картофель, рис и хлебные злаки, но также присутствует в весьма высоких концентрациях в кофе, сухофруктах. Если пищевой продукт/стимулятор также содержат сахар, такой как, например, фруктоза или глюкоза помимо аспарагина, то это еще более способствует образованию акриламида при высоких температурах.

Процессы приготовления для пищевых продуктов или стимуляторов, включая стадии предобработки для снижения содержания акриламида уже известны из уровня техники (см. США 7037540, США 2004/81724 или США 2005/202153, например). Процессы, в которых ферменты, в особенности аспарагиназы, используются для предобработки, также известны из уровня техники. Эти стадии предобработки, которые предназначены для облегчения удаления, инактивации и/или извлечения аспарагина из пищевых продуктов или стимуляторов, которые будут приготовлены, являются в некоторых случаях очень дорогостоящими и/или занимающими много времени.

Таким образом, процессы для приготовления кофейных бобов соответственно включают, например, сложные стадии высушивания, пропаривания или смачивания. Цель таких стадий предобработки состоит в том, чтобы открыть поры кофейных бобов таким образом, чтобы аспарагин, содержащийся в кофейных бобах, мог быть извлечен, снижен или инактивирован лучшим образом.

В течение операции высушивания кофейные бобы нагревают при температурах ниже приблизительно 50°С, чтобы затем вымачивать в инактивирующих аспарагин растворах, таких как, например, лактат кальция или цитрат кальция.

В течение операции пропаривания/смачивания кофейные бобы обрабатывают паром или водой при низком давлении или атмосферном давлении, во время чего влага поглощается бобами. Затем бобы обычно обрабатывают инактивирующими аспарагин растворами в отдельной стадии.

Все вышеупомянутые сложные, и в некоторых случаях также отнимающие много времени, стадии предобработки прямо или косвенно влекут за собой повышенные затраты, так как они продлевают процесс приготовления в целом и поэтому также делают его дороже.

Поэтому цель, формирующая основу изобретения, состоит в том, чтобы улучшить процессы приготовления для пищевых продуктов или стимуляторов, известных из уровня техники. Такие усовершенствования должны, в особенности, упростить стадии предобработки для снижения содержания аспарагина или акриламида в пищевых продуктах или стимуляторах таким образом, чтобы сделать весь процесс приготовления короче и менее дорогостоящим.

Эта цель достигается предметом формулы изобретения патента.

К удивлению было обнаружено, что пищевые продукты или стимуляторы могут быть приготовлены с применением амидогидролазы, остаточная активность которой после инкубации продолжительностью 5 минут при 50°С составляет по крайней мере 75%.

Изобретение касается применения амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, остаточная активность которой после инкубации продолжительностью 5 минут при 50°С составляет по крайней мере 75%, для приготовления пищевого продукта или стимулятора, предпочтительно снижения содержания аспарагины в пищевом продукте или стимуляторе. Снижение содержания аспарагина предпочтительно также вызывает уменьшение содержания акриламида в пищевых продуктах или стимуляторе, потому что аспарагин представляет собой предшественник акриламида при подвергании пищевого продукта или стимулятора последующей тепловой обработке.

Фигура 1 показывает линию калибровки определения ионов аммония с применением реактива Несслера. ось X: количество NH₄ в 40 мкл, ось Y: оптическая плотность (OD) при 436 нм. Коэффициент корреляции R² составляет 0,9979.

Фигура 2 показывает ферментативную активность аспарагиназы I Pyrococcus furiosus при различных температурах инкубации. rA: относительная активность (в %), Т [°С]: температура в градусах Цельсия.

Фигура 3 показывает температурную стабильность аспарагиназы I Pyrococcus furiosus при температуре 95°С. rA: относительная активность (в %), мин: время в минутах. Очевидно из графика, что при 95°С после инкубации продолжительностью 60 минут относительная активность или остаточная активность аспарагиназы составляет приблизительно 100%.

Фигура 4 показывает температурную стабильность аспарагиназы I Pyrococcus furiosus при температуре 99°С. rA: относительная активность (в %), мин: время в минутах. Очевидно из графика, что при 99°С после инкубации продолжительностью 60 минут относительная активность или остаточная активность аспарагиназы составляет приблизительно 70%.

Фигура 5 показывает снижение содержания акриламида после обжарки двух типов кофе путем предварительной обработки сырых кофейных бобов аспарагиназой согласно изобретению, как в Примере 4 при 80°С. Контроль 1 и образец 1 - кофе типа смеси кофе "арабика", контроль 2 и образец 2 - кофе типа Бразильская "арабика".

Амидогидролазы принадлежат к семейству ферментов гидролаз. Отличительный признак амидогидролаз состоит в том, что они расщепляют/гидролизируют амидные группы. Они скоординированы под номерами ЕС 3.5.1 и 3.5.2 (номер Ферментной Комиссии (Enzyme Commission) согласно определению Комитета по номенклатуре Международного Союза Биохимии и Молекулярной Биологии (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology - NC-IUBMB).

В смысле описания термин "остаточная активность", как подразумевают, означает любую определенную/объемную ферментативную активность, которую фермент имеет после определенной продолжительности инкубации при определенной температуре по сравнению с оригинальной определенной/объемной активностью в диапазоне его температурного оптимума при иначе идентичных условиях реакции (рН, субстрат и т.д.). В этом случае, в контексте описания определенная/объемная активность фермента, как подразумевают, означает определенное количество превращенного субстрата (в мкмоль) на единицу времени (в минуту) на количество фермента (в мг или мл). Остаточная активность фермента следует из определенной/объемной активности фермента после вышеупомянутой продолжительности инкубации, разделенной на оригинальную определенную/объемную активность, выраженную в процентах (%). В этом случае, специфическая активность фермента предпочтительно указывается в Е/мг, а объемная активность фермента предпочтительно указывается в Е/мл. Альтернативно, определенная/объемная активность фермента может также указываться в катал/мг или катал/мл в контексте описания.

Термин "ферментативная активность", иногда также обозначаемый как "каталитическая активность" или "каталитическая эффективность", общеизвестен специалисту, квалифицированному в данной области, и касается скорости превращения фермента и обычно выражается отношением k_kat/K_M, где k_kat - каталитическая постоянная (также называется числом преобразования), и значение K_M соответствует концентрации субстрата, при которой скорость реакции находится на половине ее максимальной величины. Альтернативно, ферментативная активность фермента может также быть определена определенной активностью (мкмоль превращенного субстрата х мг^-1 х мин ^-1; см. выше) или объемной активностью (мкмоль превращенного субстрата х мл^-1 х мин^-1; см. выше). Ссылка может также быть сделана на общую литературу, такую как Voet et al., "Biochemie" [Biochemistry], 1992, VCH-Verlag, Глава 13, страницы 331-332 относительно ферментативной активности.

В предпочтительных вариантах осуществления A₁-A₇ - F₁-F₇, остаточная активность амидогидролазы, используемой согласно изобретению, составляет предпочтительно по крайней мере 75%, более предпочтительно по крайней мере 80% и наиболее предпочтительно по крайней мере 90%, при условиях, определенных в следующей таблице:

№	Продолжительность	Температура (°С)
		А	В	с	D	Е	F
1	5 минут	50	60	70	80	90	100
2	10 минут	50	60	70	80	90	100
3	20 минут	50	60	70	80	90	100
4	30 минут	50	60	70	80	90	100
5	40 минут	50	60	70	80	90	100
6	50 минут	50	60	70	80	90	100
7	60 минут	50	60	70	80	90	100

В вышеупомянутой таблице вариант осуществления С₆, например, означает, что по крайней мере через 50 минут при 70°С остаточная активность амидогидролазы составляет по крайней мере 75%, более предпочтительно по крайней мере 80%, наиболее предпочтительно по крайней мере 90%. В особенно предпочтительном варианте осуществления остаточная активность амидогидролазы находится в диапазоне предпочтительно 75-100%, более предпочтительно 75-90%, при определенных выше условиях.

В предпочтительном варианте осуществления используемая амидогидролаза представляет собой аспарагиназу. В контексте описания аспарагиназа, как подразумевают, является ферментом, который катализирует гидролиз аспарагина до аспартата и аммония. В предпочтительном варианте осуществления это аспарагиназа типа I, а в другом предпочтительном варианте осуществления - аспарагиназа типа II.

Амидогидролаза, предпочтительно аспарагиназа, предпочтительно термоактивна.

В контексте описания "термоактивный" означает, что температурный оптимум таких амидогидролаз, предпочтительно аспарагиназ, находится выше 50°С.

Термин "температурный оптимум" является общеизвестным квалифицированному специалисту и касается диапазона температур, в котором фермент показывает свою максимальную ферментативную активность. В связи с этим может быть сделана ссылка на соответствующую литературу, такую как, например, Voet et al., "Biochemie", 1992, VCH-Verlag, Глава 13, страница 331; I.H. Segel, Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems, Wiley Interscience, 1993; и A.G. Marangoni, Enzyme Kinetics: A Modern Approach, Wiley Interscience, 2002.

В контексте описания температурный оптимум, как предпочтительно подразумевают, представляет собой диапазон температур, в котором максимальная ферментативная активность амидогидролазы, используемой согласно изобретению, составляет по крайней мере 80%, предпочтительно по крайней мере 90% при иначе постоянных условиях реакции.

Температурный оптимум амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, предпочтительно находится в диапазоне от 60° до 130°С, более предпочтительно в диапазоне от 70° до 120°С, еще более предпочтительно в диапазоне от 75° до 110°С, наиболее предпочтительно в диапазоне от 80° до 100°С и в особенности в диапазоне от 85° до 95°С.

Поэтому амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, используемые согласно изобретению предпочтительно не только устойчивы к высоким температурам (то есть, противостоят тепловой обработке относительно их ферментативной активности), но дополнительно термоактивны (то есть, развивают их полную ферментативную активность только при повышенной температуре).

Из предшествующего уровня техники к настоящему времени не известно никакого процесса, в котором термоактивная аспарагиназа применялась для обработки пищевых продуктов или стимуляторов для снижения содержания акриламида.

В предпочтительном варианте осуществления, при температуре предпочтительно от 60° до 120°С, более предпочтительно от 65° до 110°С, еще более предпочтительно от 70° до 100°С, наиболее предпочтительно от 75° до 100°С и в особенности от 80° до 90°С, специфическая активность амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, предпочтительно составляет, по крайней мере 100, более предпочтительно по крайней мере 200, еще более предпочтительно по крайней мере 300, еще более предпочтительно по крайней мере 500, наиболее предпочтительно по крайней мере 800 и в особенности по крайней мере 100 единиц/мг, причем 1 единица определяется как количество амидогидролазы, которое высвобождает 1,0 мкмоль аммиака в минуту из L-аспарагина при соответствующей температуре реакции и значении рН, составляющем 8,6 (50 мМ Трис-HCl, коррекция рН при 25°С).

К удивлению было обнаружено, что у термоактивной аспарагиназы есть существенные преимущества перед другими аспарагиназами. Например, расщепление аспарагина может быть проведено при сравнительно высоких температурах, используя термоактивные аспарагиназы, и это приводит к совместимости с процессами, в которых высокие температуры, в особенности процессы выдержки при высоких температурах, все еще играют роль. Кроме того, расщепление аспарагина при более высоких температурах может быть проведено при более высокой скорости реакции.

Например, при ферментативной обработке кофейных бобов необходимо дать зеленым кофейным бобам набухнуть в воде прежде, чем их можно будет обработать ферментом. Затем кофейные бобы должны быть высушены снова прежде, чем они смогут быть прожарены. Поэтому ферментативная обработка кофе требует, среди прочего, следующих стадий: а) смачивания; b) ферментативной обработке в смоченном состоянии; с) высушивания; d) прожарки.

Обычные производственные процессы для декафенизации или обеспечения "умеренного вкуса" уже включают вышеупомянутые стадии процесса а), с) и d).

Для стадии высушивания с) кофейные бобы должен быть нагреты до достаточной температуры, так как вода не может быть удалена иначе. Нагревание и смачивание кофейных бобов предпочтительно проводятся с использованием горячего пара (>100°С). Затем при 70-80°С выполняется последующая стадия высушивания с).

Если бы используемая амидогидролаза имела только температурный оптимум, составляющий 50°С, например, это было бы очень неблагоприятно, так как ее нужно было бы во-первых охладить до 50°С для ферментативной обработки и затем снова нагреть для высушивания.

Напротив, не нужно никакого охлаждения при применении термоактивных аспарагиназ, предпочтительных согласно изобретению, и это представляет специфическое преимущество изобретения.

Дальнейшее преимущество при применении термоактивных аспарагиназ состоит в том, что диффузия аспарагина, который будет гидролизироваться, увеличивается в результате повышения температуры, и это аналогично приводит к улучшению эффективности процесса согласно изобретению.

Процесс согласно изобретению позволяет получить операцию приготовления, используя амидогидролазу, сохраняя стадии процесса обычных процессов для приготовления пищевого продукта или стимулятора, то есть без любых серьезных изменений в циклах процесса. Ферментативная обработка может предпочтительно быть проведена во время стадии процесса, в которой пищевой продукт или стимулятор подвергаются, тем не менее, повышенной температуре.

В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления, при температуре, составляющей предпочтительно от 60° до 120°С, более предпочтительно от 65° до 110°С, еще более предпочтительно от 70° до 100°С, наиболее предпочтительно от 75° до 100°С и в особенности 80-90°С, объемная активность амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, составляет предпочтительно, по крайней мере 50, более предпочтительно по крайней мере 100, еще более предпочтительно по крайней мере 300, еще более предпочтительно по крайней мере 500, наиболее предпочтительно по крайней мере 800 и в особенности по крайней мере 1000 единиц/мг, причем 1 единица определяется как количество амидогидролазы, которое высвобождает 1,0 мкмоль аммиака в минуту из L-аспарагина при соответствующей температуре реакции и значении рН, составляющем 8,6 (50 мМ Трис-HCl, коррекция рН при 25°С).

В предпочтительном варианте осуществления оптимум рН амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, находится в диапазоне предпочтительно от 1 до 14, более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12, еще более предпочтительно в диапазоне от 5 до 11, наиболее предпочтительно в диапазоне от 7 до 10 и в особенности в диапазоне от 8 до 9. Термин "оптимум рН" является общеизвестным квалифицированному специалисту и касается диапазона рН, в котором у фермента есть своя максимальная ферментативная активность. В связи с этим может быть сделана ссылка на соответствующую литературу, такую как, например, Voet et al., "Biochemie", 1992, VCH-Verlag, Глава 13, страница 331. В контексте описания термин оптимум рН, как предпочтительно подразумевают, означает диапазон рН, в котором максимальная ферментативная активность амидогидролазы, используемой согласно изобретению, составляет по крайней мере 80%, предпочтительно по крайней мере 90% при иначе постоянных условиях реакции.

К удивлению было обнаружено, что могут быть предоставлены амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, которые являются активными в очень широком диапазоне рН. В диапазоне рН 5 - 10 активность этих амидогидролаз, предпочтительно аспарагиназ, предпочтительно составляет по крайней мере 10% максимальной активности. В результате этого возможно применять этот фермент в различных процессах с широко отличающимися диапазонами рН. Также возможно применять его в процессах, в которых значение рН подвергается существенным колебаниям в процессе. Возможны также процессы, в которых значения рН составляют от 5 до 10. При обработке зеленых кофейных бобов с использованием воды из-под крана, например, могут встречаться очень низкие значения рН, составляющие ~5.

В предпочтительном варианте осуществления, во всем диапазоне рН, составляющем 5-10, активность амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, согласно изобретению составляет по крайней мере 10%, более предпочтительно по крайней мере 15%, еще более предпочтительно по крайней мере 20%, наиболее предпочтительно по крайней мере 25% и в особенности по крайней мере 30% по сравнению с максимальной активностью, то есть с максимальной активностью с оптимальным значением рН при иначе идентичных условиях, предпочтительно при оптимальной температуре и концентрации.

Амидогидролаза, предпочтительно аспарагиназа, используемая согласно изобретению предпочтительно устойчива при хранении. В предпочтительных вариантах осуществления G₁-G₁₇ - K₁-K₁₇ остаточная активность амидогидролазы составляет по крайней мере 80%, более предпочтительно по крайней мере 85%, еще более предпочтительно по крайней мере 90% и в особенности по крайней мере 95%, при условиях, определенных в следующей таблице:

		Диапазон температуры (°С)
	Период хранения	G	H	I	J	K
1	5 дней	25	15	10	8	5
2	10 дней	25	15	10	8	5
3	15 дней	25	15	10	8	5
4	20 дней	25	15	10	8	5
5	25 дней	25	15	10	8	5
6	30 дней	25	15	10	8	5
7	60 дней	25	15	10	8	5
8	90 дней	25	15	10	8	5
9	120 дней	25	15	10	8	5
10	150 дней	25	15	10	8	5
11	180 дней	25	15	10	8	5
12	210 дней	25	15	10	8	5
13	240 дней	25	15	10	8	5
14	270 дней	25	15	10	8	5
15	300 дней	25	15	10	8	5
16	330 дней	25	15	10	8	5
17	360 дней	25	15	10	8	5

В вышеупомянутой таблице вариант осуществления Is, например, означает, что после хранения в течение 25 дней при 10°С, остаточная активность амидогидролазы составляет по крайней мере 80%, более предпочтительно по крайней мере 85%, еще более предпочтительно по крайней мере 90% и в особенности по крайней мере 95%. В особенно предпочтительном варианте осуществления, в случае хранения при 4°С в течение 30 дней, остаточная активность амидогидролазы, используемой согласно изобретению, составляет по крайней мере 80%.

Группа амидогидролаз включает, среди прочего, семейство ферментов аспарагиназ (ЕС 3.5.1.1), которые катализируют гидролиз аспарагина до аспартата и аммиака. В предпочтительном варианте осуществления амидогидролаза, используемая согласно изобретению, представляет собой аспарагиназу.

Общеизвестно, что аспарагиназы могут преобразовать и аспарагин (L и D форму) и глутамин (L и D форму).

Ввиду этой разнородности субстратов аспарагиназ, аспарагиназа, используемая согласно изобретения, гидролизует L-аспарагин предпочтительно быстрее, чем L-глутамин и/или возможно быстрее чем D-аспарагин.

Соотношение значений K_M (соответственно в мМ) L-аспарагина к L-глутамину предпочтительно находится в диапазоне от 1:10 до 1:400, более предпочтительно в диапазоне от 1:20 до 1:200, еще более предпочтительно в диапазоне от 1:30 до 1:100, наиболее предпочтительно в диапазоне от 1:40 до 1:80.

В предпочтительном варианте осуществления аспарагиназа, используемая согласно изобретению, предпочитает L-аспарагин L-глутамину и/или D-аспарагину. Соотношение значений Км (соответственно в мМ) L-аспарагина к L-глутамину предпочтительно находится в диапазоне от 1:1 до 1:400, более предпочтительно в диапазоне от 1:5 до 1:100, еще более предпочтительно в диапазоне от 1:10 до 1:50.

Амидогидролазы или аспарагиназы могут быть неустойчивыми или устойчивыми к высокой температуре. Устойчивые к высокой температуре аспарагиназы уже известны из предшествующего уровня техники (см., например, Li et al., Anal. Chem. 2002, 74, ст.3336-3341, США 5719056 или Agathi et al, Mol. Cell. Biochem. 2001, 216, ст.93-101). Однако, показания для их применения в процессах для приготовления продуктов питания или стимуляторов не очевидны из этих публикаций.

В контексте описания термины "устойчивая к высокой температуре амидогидролаза" или "устойчивая к высокой температуре аспарагиназа", как должны предпочтительно подразумевать, означают амидогидролазу или аспарагиназу, остаточная активность которой после инкубации продолжительностью 5 минут при 50°С составляет по крайней мере 75%.

Аспарагиназа предпочтительно представляет собой аспарагиназу, выбранную из Archeoglobus sp.(например, Archeoglobus fulgidus}, Thermus sp. (например, Thermus therophilus), Pyrococcus sp. (например, Pyrococcus abyssi), Thermococcus sp. (например, Thermococcus kodakarensis}, Methanothermobacter sp. (например, Methanothermobacter thermautrophicus), или аспарагиназу, выбранную из Euryarchaeota или аспарагиназу I из Pyrococcus furiosus.

В предпочтительном варианте осуществления аспарагиназа кодируется нуклеотидной последовательностью, которая предпочтительно имеет по крайней мере 60%, более предпочтительно по крайней мере 80%, еще более предпочтительно по крайней мере 90%, еще более предпочтительно по крайней мере 95%, наиболее предпочтительно по крайней мере 99% и в особенности по крайней мере 99,9% гомологии с нуклеотидной последовательностью <SEQ ID NO:1>. В этом случае, гомология предпочтительно определяется посредством алгоритма согласно Smith & Waterman (J. Mol. Biol., 1981, 147(1), 195-7) с применением матрицы BLOSUM62 и значений 11.0 для открытия промежутка или 1.0 для расширения промежутка.

Предпочтительно в особенности, что аспарагиназа, используемая согласно изобретению, кодируется нуклеотидной последовательностью <SEQ ID NO:1>.

В предпочтительном варианте осуществления аминокислотная последовательность аспарагиназы имеет по крайней мере 50%, более предпочтительно по крайней мере 75%, еще более предпочтительно по крайней мере 80%, еще более предпочтительно по крайней мере 90%, еще более предпочтительно по крайней мере 95%, наиболее предпочтительно по крайней мере 99% и в особенности по крайней мере 99,9% гомологии (идентичности последовательности) с аминокислотной последовательностью <SEQ ID NO:2>. В этом случае, гомология предпочтительно определяется посредством алгоритма согласно Smith & Waterman (J. Mol. Biol., 1981, 147(1), 195-7) с использованием матрицы BLOSUM62 и значений 11.0 для открытия промежутка или 1.0 для расширения промежутка.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления аспарагиназа, используемая согласно изобретению, включает аминокислотную последовательность <SEQ ID NO:2>.

Как уже изложено выше, процессы приготовления для пищевых продуктов или стимуляторов, предпочтительно содержащих углеводы, часто имеют стадии предобработки для снижения содержания акриламида в этих пищевых продуктов или стимуляторах. Поэтому предпочтительно, чтобы применение амидогидролазы согласно изобретению служит для приготовления, в особенности как часть операции предобработки, для гидролиза аспарагина до аспарагиновой кислоты.

В контексте описания термин "пищевые продукты, содержащие углеводы", как предпочтительно подразумевают, означает пищевые продукты, имеющее содержание углеводов, составляющее предпочтительно по крайней мере 0,1% по весу, более предпочтительного по крайней мере 1% по весу, еще более предпочтительно по крайней мере 5% по весу, еще более предпочтительно по крайней мере 10% по весу, наиболее предпочтительно по крайней мере 20% по весу и, в особенности, по крайней мере 30% по весу относительно общей массы пищевого продукта.

Дополнительно предпочтительно, чтобы применение амидогидролазы согласно изобретению служило для приготовления, в особенности как часть операции предобработки, для снижения содержания аспарагина и/или акриламида в пищевых продуктах или стимуляторе.

В результате такого применения амидогидролазы согласно изобретению предпочтительно происходит снижение содержания аспарагина таким образом, чтобы пищевые продукты или стимуляторы имели сниженное содержание акриламида во время тепловой послеобработки.

В контексте описания термин "тепловая послеобработка", как предпочтительно подразумевают, означает процессы, которые сопровождаются нагреванием пищевых продуктов или стимулятора. Обычные тепловые послеобработки включают нагревание, сухую жарку, жарку на гриле, кипячение, готовку, выпекание, пропаривание, глубокую жарку и т.п..

Особенно предпочтительно, если амидогидролаза, используемая согласно изобретению, подходит для применения в процессах приготовления для пищевых продуктов, содержащих углеводы, таких как, например, рис, хлеб и выпечка, закуски, готовые смеси, сухофрукты, корм для животных и т.д. или стимуляторов, таких как кофе или какао. Такие пищевые продукты и/или стимуляторы предпочтительно выбираются из группы, включающей хрустящие хлебцы, сухари, булочки, крендели с солью, белый хлеб для тостов, вафли, сдобы, рогалики, круассаны, шоколадные пирожные, сухие завтраки, бисквиты, картофельные чипсы, чипсы тортилья, кукурузные чипсы, крекеры, орехи, чипсы, рисовые лепешки, поленту, кускус, блины, готовые смеси, смеси для тортов, смеси для булочек, смеси для хлеба, гренки, пищу для собак, пищу для кошек, кофейные бобы, бобы какао.

Особенно предпочтительны кофейные бобы. Предпочтительные типы кофейного боба включают Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea liberica и Coffea robusta.

В особенно предпочтительном варианте осуществления приготовление стимулятора включает декафеинизацию и/или промывку кофейных бобов, в которых используется амидогидролаза согласно изобретению.

В аналогично особенно предпочтительном варианте осуществления приготовление стимулятора включает гидролиз кофейных бобов в комбинации с применением амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, согласно изобретению. Кофейные бобы подвергаются паровой обработке в течение подготовки процесса декафеинизации или для повышения вкуса. В этом случае бобы сильно нагреваются и контактируют с водой. Применение термоактивной амидогидролазы, как оказалось, было особенно выгодно здесь для снижения концентрации аспарагина в зеленом кофейном бобе. Применение фермента при температурах выше 70°С позволяет полную совместимость с установленными процессами и, кроме того, позволяет получить очень высокие скорости реакции, которые очень уменьшают время процесса.

Применение амидогидролазы, предпочтительно аспарагиназы, согласно изобретению, имеющей вышеописанные свойства, приводит к многочисленным удивительным преимуществам, которые обрисованы в общих чертах ниже на основе четырех иллюстративных примеров. Квалифицированный специалист знает, что такие примеры не следует рассматривать в любом случае ограничивающими, так как амидогидролаза согласно изобретению подходит для применения во множестве процессов приготовления для пищевых продуктов или стимуляторов.

Таким образом, при приготовлении картофельных чипсов, картофель обычно предварительно обрабатывают аспарагиназой перед приготовлением на пару, то есть картофель разрезают на части, и аспарагиназа может или быть распылена на них или картофельные части опускают в раствор, содержащий аспарагиназу. Продолжительность такой обычной обработки аспарагиназой может быть существенной в некоторых случаях (до нескольких часов), поскольку из-за температурного оптимума фермента (обычно 37°С, см., например, США 7 037 540, Пример 5), температура обработки должна составлять максимум 37°С, и расщепление аспарагипа является соответственно медленным.

В результате свойств устойчивости к высокой температуры амидогидролазы, используемой согласно изобретению, картофельные части подвергаются обработке аспарагиназой при более высоких температурах, то есть снижение уровня аспарагина происходит быстрее, среди прочего потому что растворимость аспарагина увеличивается при более высоких температурах. В некоторых случаях, на основании свойств устойчивости к высокой температуры фермента, обработка аспарагиназой может даже происходить одновременно, в то время как картофель готовится на пару. В этом случае, аспарагиназа может быть распылена на картофельные части, например, заранее.

Дезактивация амидогидролазы проводится обычным способом посредством тепловой послеобработки, то есть жарки картофельных частей во фритюре. Поэтому, нет никаких проблем для здоровья относительно применения этих устойчивых к высокой температурой амидогидролаз.

Дальнейший пример касается декафеинизации кофейных бобов. В этом процессе приготовления нежареные зеленые кофейные бобы подвергаются паровой обработке и/или погружаются в частично горячую воду для извлечения кофеина из бобов. С помощью амидогидролазы, используемой согласно изобретению, возможно объединить такие стадии декафеинизации, которые обычно проводят при температурах выше 37°С, с одновременной обработкой аспарагиназой, то есть процесс приготовления для кофе без кофеина также занимает меньше времени и поэтому менее дорогой. Обычные процессы для декафеинизация кофейных бобов известны квалифицированному специалисту и включают, среди других, "швейцарский водный процесс", "прямой метод", "косвенный метод" или "триглицеридный процесс". Ссылка может быть сделана на R. Heiss, Lebensmitteltechnologie: Biotechnologische, chemische, mechanische und thermische Verfahren der Lebensmittelverarbeitung [Пищевая технология: биотехнологические, химические, механические и тепловые процессы для обработки пищи], Springer, 6-ой выпуск, 2003, например, полностью в этом контексте.

К удивлению, амидогидролаза согласно изобретению может также применяться особенно полезно при обработке кофейных бобов пропариванием/смачиванием. Как уже изложено выше, такая обработка пропариванием/смачиванием служит для открывания пор кофейных бобов таким образом, чтобы аспарагин, присутствующий в бобах, мог быть впоследствии инактивирован/снижен более легко. Обработка пропариванием/смачиванием обычно происходит при повышенных температурах, то есть при температурах предпочтительно максимум до 100°С, так как растворимость аспарагина увеличивается в теплом растворителе, и также поры кофейных бобов открываются быстрее при повышенных температурах. При помощи устойчивой к высокой температуре амидогидролазы согласно изобретению снижение аспарагина может произойти одновременно во время обработки пропариванием /смачиванием, и в то же самое время снижение уровня аспарагина может происходить быстрее и эффективнее из-за высокой температурной переносимости фермента.

Амидогидролаза согласно изобретению может также применяться в производстве свежевыпеченных продуктов, таких как хлеб, рогаликов или подобного. Эти свежевыпеченные продукты часто производятся с применением процессов выпечки/экструзии, которые обычно проводят при температурах от 95° до 105°С. Из-за свойств устойчивости к высокой температуре амидогидролазы согласно изобретению фермент можно добавлять во время выпечки/экструзии и таким образом произвести снижение содержания аспарагина. То, что является важным для снижения аспарагина в случае выпечки/экструзии, так это замешивание теста, а также образование газовых пузырей, которые образуются при выходе углекислого газа из горячей воды. Амидогидролаза согласно изобретению инактивируется или денатурируется в результате последующего процесса жарки или обжарки, который обычно происходит в диапазоне температур от 200° до 600°С.

Много стадий для обработки пищевых продуктов и стимуляторов вовлекают операции инкубации в водной среде при высоких температурах от 70° до 110°С, и они предшествуют тепловой послеобработке, которая приводит к образованию акриламида. Они включают стадии готовки, например. Обработки водой в вышеупомянутом диапазоне температуры используются, например, в производстве сформированных чипсов или сформированных картофельных чипсов. Неожиданное преимущество аспарагиназы согласно изобретению состоит в том, что фермент может применяться непосредственно в этих процессах и достигает очень высоких скоростей реакции при высоких температурах, таким образом позволяя получить очень высокие скорости активности с очень маленькими количествами фермента.

Амидогидролаза может также полезно применяться в процессы обработки хлебных злаков. В производстве корнфлекса зерна готовят в смеси с сахаром, солью и солодом и затем далее обрабатывают и обжаривают. Обжаривание вызывает нежелательное образование акриламида. Во время приготовления достигаются температуры от 70° до 100°С, которые очень хорошо подходят для применения амидогидролазы согласно изобретению, чтобы позволить подавить образование акриламида.

Процессы экструзии очень часто вовлекаются в обработку зерна. Например, процессы экструзии проводятся при конечной температуре, составляющей 80-100°С, в производстве сухих завтраков. Также описаны процессы, которые включают процессы выдержки при высоких температурах, составляющих от 70° до 100°С.

Продукты, кот