Иммуномодулирующее средство на основе 3-о-пропионата аллобетуленола (19β,28-эпокси-18α-олеанан-3β-ил и пропионат)

Иммуномодулирующее средство на основе 3-о-пропионата аллобетуленола (19β,28-эпокси-18α-олеанан-3β-ил и пропионат)

Реферат

Изобретение относится к химии, медицине и фармацевтике и касается нового иммуномодулирующего средства тритерпеноида олеананового ряда 3-O-пропионата аллобетуленола и его иммуномодулирующей активности. Данное вещество может быть использовано как иммуномодулятор для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, а также как вспомогательное средство при вирусных заболеваниях.

3-O-Пропионат аллобетуленола (19β,28-эпокси-18α-олеанан-3β-ил пропионат, 3-O-пропионат аллобетулинола, АН-12) является сложным эфиром пропионовой кислоты и аллобетуленола, имеет брутто-формулу C₃₃H₅₄O₃ и молекулярную массу 498,78 (рис.1).

Известно, что в медицинской практике применяется ряд препаратов тритерпеновой природы для лечения различных заболеваний, а именно, кислота глицирризиновая и ее соли, кислота олеаноловая, азиатикозид, кислота глицирретовая (Эноксолон) и ее соли, натрия карбеноксолон и эсцин [Энциклопедия лекарств РЛС, 2013; Sweetman S.C. Martindale: The Complete Drug Reference. London, Chicago, 36^th ed., 2009; The European Pharmacopoeia 7^th ed., 2010; Sheng H., Sun H. Synthesis, biology and clinical significance of pentacyclic triterpenes: a multi-target approach to prevention and treatment of metabolic and vascular diseases // Nat Prod Rep. 2011. Vol.28. №3. P.543-593; British Pharmacopoeia, 2013]. Данные средства имеют природное и синтетическое происхождения и относятся к тритерпеноидам олеананового ряда.

Также известны препараты данной группы, проходящие клинические испытания для лечения разнообразных болезней: эсцин, глицирризиновая, глицирретовая кислоты, QS-21, бардоксолон (CDDO, RTA-401), метил-бардоксолон (CDDO-Me, RTA-402), босвелловая кислота, S-0139. Многие полусинтетические тритерпеноиды олеананового типа обладают высокой биологической активностью, улучшенными фармакокинетическими показателями и действуют как многофункциональные (мультитаргетные) агенты на разных уровнях регуляции организма [Yadav V.R., Prasad S,, Sung В., Kannappan R., Aggarwal B.B. Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer // Toxins (Basel). 2010. Vol.2. №10. P.2428-2466; Dehaen W., Mashentseva A.A., Seitembetov T.S. Allobetulin and its derivatives: synthesis and biological activity // Molecules. 2011. Vol.16. №3. P.2443-2466; Sheng H., Sun H. Synthesis, biology and clinical significance of pentacyclic triterpenes: a multi-target approach to prevention and treatment of metabolic and vascular diseases // Nat Prod Rep. 2011. Vol.28. №3. P.543-593; Liby K.T., Sporn M.B. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease // Pharmacol Rev. 2012. Vol.64. №4. P.972-1003; Patlolla J.M., Rao C.V. Triterpenoids for cancer prevention and treatment: current status and future prospects // Curr Pharm Biotechnol. 2012. Vol.13. №1. P.147-155; http://clinicaltrials.gov].

QS-21 (стимулон) - природный олеанановый сапонин - используется в качестве иммунологического адъюванта для лечения различных видов рака. QS-21 получают из коры мыльного дерева (Quillaja saponaria) или синтетическим путем [Ragupathi G., Gardner J.R., Livingston P.O., Gin D.Y. Natural and synthetic saponin adjuvant QS-21 for vaccines against cancer // Expert Rev Vaccines. 2011. Vol.10. №4. P.463-470; Garcon N., Van Mechelen M. Recent clinical experience with vaccines using MPL- and QS-21-containing adjuvant systems // Expert Rev Vaccines. 2011. Vol.10. №4. P.471-486].

Аллобетуленол (аллобетулин, аллобетулинол) представляет собой тритерпеновый моноспирт олеананового ряда с молекулярной формулой C₃₀H₅₀O₂, содержит в своей структуре скелет олеанана, гидроксильную группу при С-3 положении с β-конфигурацией и 19β,28-эпокси группу. Аллобетуленол получен впервые в 1922 г. химическим путем, он крайне редко встречается в природных источниках [Кислицын А.Н. Экстрактивные вещества бересты: выделение, состав, свойства, применение // Химия древесины. 1994. №3, С.3-28]. Его кристаллическая структура установлена недавно в работе [Santos R.C., Pinto R.M., Matos Beja A., Salvador J.A., Paixao J.A. 19β,28-Epoxy-18α-olean-3β-ol // Acta Crystallogr Sect E Struct Rep Online. 2009. Vol.65. Pt 9. P. o2088-2089].

Следует подчеркнуть, что аллобетуленол является перспективной тритерпеновой платформой промышленного масштаба в поиске новых лекарств, полученных путем химической модификации. Его синтетические аналоги проявляют широкий спектр биологического действия. Они обладают противовирусной, иммунотропной, антибактериальной, противогрибковой, противовоспалительной, цитотоксичной, антифидантной (подавляющая питание насекомых) и гликогенфосфорилаза-ингибирующей активностью [Dehaen W., Mashentseva A.A., Seitembetov T.S. Allobetulin and its derivatives: synthesis and biological activity // Molecules. 2011. Vol.16. №3. P.2443-2466].

В настоящее время родоначальником для получения аллобетуленола и его производных является доступный в природе бетуленол (3β,28-ди-гидрокси-20(29)-лупен, бетулин, бетулинол) - основной компонент коры березы разных видов. Содержание бетуленола во внешней коре составляет до 35% от сухой массы, а в рафинированной отходной коре березы при деревообработке - до 24%. Каждый день фанерная и целлюлозно-бумажная промышленность в США, Канаде, Финляндии, Китае и России производят около 40 тонн необработанной коры (~15% бересты), тем самым расходуется приблизительно 5 тонн бетуленола. Учитывая высокий выход процесса его выделения (до 97% степени извлечения) с применением разнообразных доступных растворителей, бетуленол в настоящее время можно получить практически в любом количестве [Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. Том 13. №1. С.1-30; Абышев А.З., Агаев Э.М., Гусейнов А.Б. Исследование химического состава экстракта коры березы Cortex betula сем. Betulaceae // Хим.-фарм. журнал. 2007. Том 41. №8. С.22-26. Левданский В.А., Левданский А.В., Кузнецов Б.Н. Способ получения бетулина // Патент РФ №2458934, Бюл. №23, 20.08.2012; Krasutsky P.A. Birch bark research and development // Nat Prod Rep. 2006. Vol.23. №6. P.919-942; Sarek J., Svoboda M, Hajduch M. Method of preparation and isolation of betulin diacetate from birch bark from paper mills and its optical processing to betulin // US Patent №8093413 B2, 2012].

Способы получения аллобетуленола из бетуленола или непосредственно из бересты описаны в работах [Кислицын А.Н., Трофимов А.Н. Способ получения аллобетулина // Патент РФ №2174126, 27.09.2001; Кузнецова С.А., Кузнецов Б.Н., Редькина Е.С., Скворцова Г.П. Способ получения аллобетулина // Патент РФ №2334759, Бюл. №27, 27.09.2008; Левданский В.А., Левданский А.В., Кузнецов Б.Н. Способ получения аллобетулина // Патент РФ №2374261, Бюл. №33, 27.11.2009; Левданский В.А., Левданский А.В., Кузнецов Б.Н. Способ получения аллобетулина // Патент РФ №2379314, Бюл. №2, 20.01.2010; Казакова О.Б., Медведева Н.И., Казаков Д. В., Толстиков Г.А. Способ получения аллобетулина // Патент РФ №2402561, Бюл. №30, 27.10.2010]. Химическая сущность известных методов получения аллобетуленола заключается в изомеризации (перегруппировке Вагнера-Меервейна) бетуленола в присутствии кислотного катализатора.

Наиболее близким к способу получения аллобетуленола предлагаемого изобретения является способ, описанный в патенте РФ №2402561 (2010). Согласно данному методу к суспензии 5,3 г (12 ммоль) бетуленола в 300 мл хлороформа добавляют 1 г FeCl₃·6H₂O (3,9 ммоль). Реакционную массу перемешивают в течение 30 мин (ТСХ-контроль), хлороформ упаривают в вакууме водоструйного насоса. Продукт промывают водой для удаления соли железа и перекристаллизовывают из смеси хлороформ-гексан. Выход аллобетуленола составляет 4,9 г (92%), чистота 95%.

Этот способ имеет следующие недостатки:

- использование большого количества токсичного растворителя хлороформа (~226 мл на 4,0 г бетуленола) при проведении реакции,

- невысокая степень чистоты конечного продукта. Наличие следа соли железа в аллобетуленоле может вызывать образование побочных продуктов его окисления, тем самым загрязняется целевой аллобетуленол при хранении.

В способе получения аллобетуленола заявляемого изобретения (1-я стадия получения АН-12) в качестве кислотного катализатора используется FeCl₃·6H₂O, в качестве растворителя - хлороформ (без предварительной очистки и перегонки, в соотношении: 60 мл хлороформа на 4,0 г бетуленола). Реакция протекает при кипячении с обратным холодильником в течение 30-45 мин. Удаление солей железа при очистке продукта осуществляется путем промывания хлороформной фазы водой 3-5 раз (20 мл воды на 80 мл хлороформа).

Ацилирование, в частности, с образованием сложных эфиров, играет важную роль в улучшении фармакологических свойств (повышение или образование новой активности, увеличение биодоступности, уменьшение токсичности, изменение механизма действия и т.д.) новых соединений.

Известны примеры синтеза лекарств-терпеноидов: гемисукцинилирование дигидроартемизинина (сесквитерпеновой группы) с образованием более эффективного противомалярийного препарата артесуната, гемисукцинилирование глицирретовой кислоты (тритерпена олеананового ряда) с образованием карбеноксолона, гемисукцинилирование природной бетуленоловой кислоты (тритерпена лупанового ряда) с образованием высокоактивного препарата бевиримата (РА-457) для клинических испытаний против ВИЧ, или полусинтез противоракового препарата таксола (паклитаксела), который можно рассматривать как ацилированный дитерпен таксанового типа.

Известно, что сложные эфиры аллобетуленола по С-3-положению получают взаимодействием данного соединения с ангидридами или хлорангидридами кислот в условиях реакции с использованием третичного амина (трибутиламин, пиридин) в качестве катализатора в течение 6 часов при комнатной температуре [Li T.-S., Jian-Xin Wang J.-X., Zheng X.-J. Simple synthesis of allobetulin, 28-oxyallobetulin and related biomarkers from betulin and betulinic acid catalysed by solid acids // J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. 1998. №23. P.3957-3966; Flekhter О.В., Medvedeva N.I., Karachurina L.T., Baltina L.A., Zarudii F.S., Galin F.Z., Tolstikov G.A. Synthesis and antiinflammatory activity of new acylated betulin derivatives // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2002. Vol.36. №9. P.488-491; Kazakova О.В., Khusnutdinova E.F., Tolstikov G.A., Suponitsky K.Yu. Synthesis of new olean-18(19)-ene derivatives from allobetulin // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2010. Vol.36. №4. P.512-515].

До заявляемого изобретения, сведения о сложном эфире пропионовой кислоты аллобетуленола (АН-12) не были описаны в отечественной и зарубежной литературе.

С другой стороны, в связи с общим снижением иммунного статуса населения, а также быстрым распространением инфекционных заболеваний, вызванных различными вирусами (особенно вирусом иммунодефицита человека) в настоящее время актуальным является поиск новых препаратов, обладающих иммуностимулирующим действием.

Задача изобретения - создание нового эффективного средства -иммуномодулятора на основе 3-O-пропионата аллобетуленола, полученного из природного бетуленола простой химической модификацией, с целью расширения арсенала иммуномодулирующих средств.

Сущность получения АН-12 заключается в двухстадийном синтезе из бетуленола.

а) изомеризация бетуленола

Суспензия из бетуленола и FeCl₃·6H₂O (кислотного катализатора) в хлороформе (растворителе) нагревается до кипения, выдерживается при данной температуре в течение 30-45 мин. Реакция контролируется ТСХ в системе метилен хлористый: этанол: уксусная кислота - 95:5:1. В конце реакции наблюдается полное растворение. При обработке реакции механические примеси удаляются фильтрованием через бумажный фильтр, а растворимую часть соли железа - промыванием хлороформной водой 3-5 раз (по 20 мл воды на 80 мл хлороформа). Продукт очищается кристаллизацией из хлороформа, этилового спирта или их смеси.

б) ацилирование полученного аллобетуленола

В качестве ацилирующего агента используется ангидрид пропионовой кислоты в избытке (7 экв.), в качестве растворителя - хлороформ. Катализатором является третичный амин: пиридин или ДМАП (N,N-диметиламинопиридин). Реакция проводится при комнатной температуре в течение 4 ч под ТСХ-контролем (Сорбфил УФ-254, силикагель СТХ-1А) в системе метилен хлористый: этанол; уксусная кислота - 95:5:1. При обработке третичный амин удаляется промыванием раствором соляной кислоты (3%), продукт выделяется экстракцией хлороформом. Очистка продукта АН-12 осуществляется перекристаллизацией из изопропилового спирта. При этом получают АН-12 состава C₃₃H₅₄O₃, т.пл. 254-256°C, Rf 0,75.

Изобретение иллюстрируется примерами получения 3-O-пропионата аллобетуленола и исследования его иммуномодулирующей активности.

Пример 1. Методика синтеза аллобетуленола

В колбу объемом 100 мл, снабженную нагревателем и холодильником, загружают 4,0 г (9,0 ммоль) бетуленола, добавляют 60 мл хлороформа и 1,0 г FeCl₃·6H₂O (3,7 ммоль). Реакционную смесь кипятят в течение 30-45 мин (до полного исчезновения исходного бетуленола при ТСХ-контроле). После этого реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, отфильтровывают, к фильтрату добавляют 60 мл воды, разделяют органический слой, экстрагируют водный слой 20 мл хлороформом. Органические слои объединяют и промывают водой 3-5 раз (по 20 мл) и подсушивают над Na₂SO₄ безводным. Растворители упаривают в вакууме до появления кристаллов. Отгон хлороформа используется для следующих опытов. Выход хроматографически однородного аллобетуленола составляет 3,5 г (87,5%) с т.пл. 264-266°C.

Структура полученного аллобетуленола подтверждена современными методами: ТСХ, ИК- и ЯМР-спектроскопией.

ТСХ-система: метилен хлористый: этанол: уксусная кислота - 95:5:1. ТСХ-пластинка: Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ (силикагель СТХ-1А, УФ-254 нм). Визуализация веществ проводится с помощью йодных паров. Аллобетуленол имеет Rf 0,55. Исходный бетуленол имеет Rf 0,50.

ИК-спектр (KBr, см^-1): 3431 и 3394 (-OH), 2937-2852 (C-H, CH₂, CH₃), 1450, 1386, 1041, 1035, 814, 769, 642.

ИК-спектр (вазелиновое масло, см^-1): 3429 и 3387 (-OH), 2924-2852 (C-H, CH₂, CH₃), 1462, 1377, 1039, 814, 769, 721, 642.

¹H-ЯМР-спектр (CDCl₃, δ, м.д.): 0,59-0,97 (м, 24H), 1,00-1,73 (м, 21H), 1,95-2,06 (м, 1H), 3,07-3,18 (м, 1H, H-3), 3,38 (д, J=7,78 Гц, 1Н, H-28а), 3,47 (c, 1H, H-286), 3,72 (д, J=7,53 Гц, 1H, H-19).

¹³C-ЯМР-спектр (CDCl₃, δ, м.д.): 13,46, 15,43, 15,66, 16,44, 18,22, 20,93, 24,51, 26,21, 26,39 (2C), 27,36, 27,99, 28,78, 32,67, 33,87, 34,10, 36,20, 36,68, 37,20, 38,85, 38,91, 40,56, 40,65, 41,41, 46,77, 51,02, 55,47, 71,19 (C-28), 78,64 (C-3), 87,86 (C-19).

Приведенные спектральные данные согласуются с такими, которые известны в литературе [патент РФ №2379314, патент РФ №2402561].

Пример 2. Методика синтеза 3-O-пропионата аллобетуленола (АН-12)

1,0 г (2,3 ммоль) аллобетуленола растворяют в 20 мл хлороформа и 3 мл пиридина в круглодонной колбе, вместимостью 100 мл, снабженной магнитной мешалкой, добавляют 2,0 мл (15,6 ммоль) пропионового ангидрида. Реакционную смесь постоянно перемешивают при комнатной температуре (20-25°C) до полного исчезновения исходного аллобетуленола при ТСХ-контроле (~4 ч). Затем реакционную смесь вливают в стакан с водой (30 мл) и подкисляют 3% раствором HCl (~70 мл) до pH 2. Разделяют органический слой, а водную фазу экстрагируют 2 раза по 15 мл хлороформа. Объединенный экстракт промывают водой до pH 5 (по 15 мл, ~5 раз). После отгонки растворителя и перекристаллизации из изопропилового спирта получают 0,9 г (79,9%) 3-O-пропионата аллобетуленола (АН-12) брутто-формулы C₃₃H₅₄O₃ с т.пл. 254-256°C.

Структура полученного 3-O-пропионата аллобетуленола установлена современными методами: ТСХ, ИК- и ЯМР-спектроскопией.

ТСХ-система: метилен хлористый : этанол : уксусная кислота - 95:5:1. ТСХ-пластинка: Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ (силикагель СТХ-1А, УФ-254 нм). Визуализация веществ проводится с помощью йодных паров. АН-12 имеет Rf 0,75.

ИК-спектр (KBr, см^-1): 2941, 2851, 1730 (C=O), 1464, 1444, 1390, 1377, 1363, 1194, 1078, 1060, 1035, 1008, 968, 891, 870, 806.

ИК-спектр (вазелиновое масло, см^-1): 2924, 2853, 1730 (C=O), 1462, 1388, 1377, 1363, 1194, 1078, 1059, 1035, 1008, 968, 891, 870, 806, 721.

¹H-ЯМР-спектр (CDCl₃, δ, м.д.): 0,76-1,04 (м, 24H), 1,06-1,77 (м, 24H), 2,32 (к, J=7,78 Гц, 2H, -CH₂COO-), 3,44 (д, J=7,78 Гц, 1H, H-28а), 3,53 (c, 1H, H-286), 3,77 (д, J=7,78 Hz, 1H, H-19), 4,41-4,55 (м, 1H, H-3).

¹³С-ЯМР-спектр (CDCl₃, δ, м.д.): 9,34 (пропионил-CH₃), 13,48, 15,71, 16,53 (2C), 18,13, 21,00, 23,71 (пропионил-CH₂), 24,54, 26,26, 26,42 (2C), 27,94, 28,06, 28,81, 32,71, 33,84, 34,15, 36,25, 36,75, 37,18, 37,89, 38,58, 40,63, 40,72, 41,46, 46,82, 50,99, 55,57, 71,25 (C-28), 80,58 (C-3), 87,93 (C-19), 174,24 (C=O).

В ИК-спектре в вазелиновом масле АН-12 отсутствуют полосы поглощения в области 3387-3429, характерные для вторичной спиртовой гидроксильной группы исходного аллобетуленола, присутствуют полосы поглощения при 1730 см^-1, характерные для C=O-сложного эфира продукта ацилирования. В ПМР-спектре синтезированного соединения наблюдается квартет-сигнал протонов CH₂ пропионильной группы при 2,32 м.д., при этом сохраняются сигналы протонов скелета аллобетуленола. Под влиянием пропионильной группы сигнал протона у 3-го положения АН-12 имеет хим. сдвиг в более слабом поле (4,41-4,55 м.д.) по сравнению с таковыми исходного аллобетуленола (3,07-3,18 м.д.). ¹³C-ЯМР-спектр продукта показывает, что имеются дополнительные сигналы C=O (174,24 м.д.), CH₂ (23,71 м.д.) и CH₃ (9,34 м.д.), и количество углеродных атомов в молекуле равно 33, тем самым полностью подтверждается структура АН-12.

Таким образом, приведенные хроматографические и спектральные данные согласуются со структурой заявляемого соединения.

Пример 3. Оценка гуморального иммунного ответа (Титр антител к ЭБ)

В проведенном исследовании иммунизацию мышей осуществляли внутрибрюшинным введением модельного для иммунологических исследований антигена - эритроцитов барана (ЭБ) [Иммунотерапия: руководство. Под ред. P.M. Хаитова, Р.И. Атауллаханова. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. 672 с.].

На 7-е сутки после иммунизации в крови наблюдается максимум IgG, специфичным к вводимым эритроцитам. В соответствии с этим анализ титра антител в сыворотке крови проводили на 7-е сутки после иммунизации. Оценку осуществляли методом реакции гемагглютинации [Herzyk D.J., Bussiere J.L. Immunotoxicology strategies for pharmaceutical safety assessment // John Wiley & Sons - 2008].

Заявляемое соединение АН-12 вводили мышам с 1-7 сутки подкожно в дозах 0,1; 1; 10 и 50 мг/кг. Для удобства результаты исследования представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартильных размахов. Статистические различия определяли с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни, при p<0,05. Результаты проведенного исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1
Оценка гуморального иммунного ответа (титр антител к ЭБ (log2N)), N=10
Группа	Доза, мг/кг	№ животного / титр антител	Me (Q1;Q2)
1	2	3	4	5
контрольная группа (растворитель ДМСО)	-	6	6	6	6	6	6 (6; 6)
субстанция АН-12	0,1	6	6	6	6	7	6 (6; 6)
субстанция АН-12	1	6	6	7	6	7	6 (6; 7)
субстанция АН-12	10	7	8	7	8	8	8 (7; 8) *
субстанция АН-12	50	9	7	8	9	8	8 (8; 9) *
Примечание - * - отличия статистически значимы в сравнении с контрольной группой по непараметрическому U-критерию Манна-Уитни, при p<0.05

На 7-е сутки после иммунизации титр антител у контрольных животных, получавших растворитель ДМСО, был равен 6 (6; 6). Курсовое введение субстанции АН-12 в дозах 0,1; 1; 10 и 50 мг/кг приводит к дозозависимому увеличению титра антител в крови лабораторных животных, достигая максимума в дозе 50 мг/кг.

Поставленная реакция является главным показателем формирования гуморального иммунного ответа. Полученные результаты позволяют заключить, что АН-12 оказывает существенное влияние на гуморальный иммунный ответ.

Пример 4. Оценка клеточного иммунного ответа

Для оценки влияния АН-12 на клеточный иммунный ответ использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у мышей. Данный метод подразумевает подкожное введение животным антигена, как правило, эритроцитов барана, с целью активации иммунного ответа. При постановке реакции ГЗТ эритроциты барана вводили двукратно - для сенсибилизации и разрешения.

На стадии сенсибилизации происходит презентирование антигена и образование клона антигенспецифических Т-лимфоцитов-хелперов-1 (Т×1). Презентирование антигена посредством рецепторов МНС класса I осуществляют макрофаги, поглотившие и переработавшие вводимые на этой стадии эритроциты барана. Лимфоциты своими рецепторами взаимодействуют с MHCl и отвечают образованием Т-клеток памяти, несущих информацию об антигене.

На эффекторной стадии при повторной встрече с антигеном происходит взаимодействие Т-лимфоцитов памяти и макрофагов. Последующая за этим продукция различных провоспалительных цитокинов лимфоцитами и макрофагами вызывает дальнейшее привлечение клеток специфической и неспецифической защиты.

Таким образом, на стадии сенсибилизации эритроцитами барана происходит образование клона антигенспецифических Т-лимфоцитов, на стадии разрешения - продукция лимфоцитами провоспалительных цитокинов. Результаты проведенного исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2
Реакция гиперчувствительности замедленного типа у инбредных мышей при внутримышечном введении (M±m, n=10)
Препарат	Индекс реакции, %
Контроль	33,4±2,5
АН-120,1 мг/кг	36,8±2,9*
АН-12 1 мг/кг	23,3±2,2*
АН-12 10 мг/кг	18,4±1,3*
АН-12 50 мг/кг	14,5±1,1*
Примечание: * - статистически значимо отличается от контроля по t критерию Стьюдента при p<0.05

Курсовое подкожное введение мышам АН-12 в дозах 0,1; 1; 10 и 50 мг/кг приводило к дозозависимому снижению реакции ГЗТ. В дозе 50 мг/кг отек пораженной конечности был в 2,5 раза ниже, чем в контрольной группе.

Анализируя полученные данные, можно заключить, что в дозах 0,1, 1, 10 и 50 мг/кг АН-12 оказывает иммуномодулирующие свойства: стимулирует гуморальный иммунный ответ, в 8 раз увеличивая концентрацию антител в крови. При развитии Т-клеточного иммунного ответа в реакции гиперчувствительности замедленного типа заявленное средство обеспечивает снижение отека. Полученные данные могут служить основанием для применения АН-12 в качестве кандидата в лекарственные средства и перспективного иммуномодулирующего средства.

Иммуномодулирующее средство, включающее 3-O-пропионата аллобетуленола (19β,28-эпокси-18α-олеанан-3β-ил пропионат) в качестве активного вещества.