Композиция для инъекций, содержащая гидроксихлорохин, для местного применения при лечении рака

Композиция для инъекций, содержащая гидроксихлорохин, для местного применения при лечении рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к инъецируемому составу для местного применения, содержащему гидроксихлорохин в качестве действующего ингредиента, в котором состав должен вводиться непосредственно в раковые клетки, чтобы проявить противораковое воздействие.

Предпосылки создания изобретения

Как правило, опухоли - это заболевания, при которых аномальные клетки непрерывно размножаются, вмешиваясь в функции нормальных клеток. В соответствии с гистопатологическими и клиническими критериями опухоли делятся на злокачественные и доброкачественные, а так называемый рак относится к злокачественным опухолям.

Рак является основной причиной смерти в Корее, а также во всем мире. Причина развития рака или метод его лечения до сих пор не выяснены. Лечебные средства против рака, разработанные на сегодняшний день, отражают проблемы, связанные со смертельными побочными действиями, выражением устойчивости к лекарственному средству, разрушением лимфоцитов и костного мозга и т.д. во время их клинического использования. Таким образом, существует насущная необходимость в разработке новых противораковых средств, которые проявляют цитотоксическое действие, не влияя на нормальные клетки.

На сегодняшний день в теле человека обнаружено около 270 видов рака. Клеточные линии, которые, как сообщается, использовались в исследовании этих видов рака, включали клетки саркомы-180, клетки меланомы, клетки аденомы, клетки адено-карциномы, клетки асцитной опухоли Эрлиха и клетки карциномы Уокера. Среди этих клеток клетки саркомы-180 представляют собой клеточную линию опухоли, полученную из подмышечного ракового новообразования самца белой мыши, также известно, что саркома-180 может быть пересеяна в асциты, чтобы существовать как в солидной, так и в асцитной форме, и не имеет видовой специфичности при пересадке.

Между тем, гидроксихлорохин в настоящее время используется для профилактики и лечения ревматоидного артрита, хронической и системной красной волчанки, кожных заболеваний, связанных со светочувствительностью, и малярии. В последнее время были зафиксированы исследования гидроксихлорохина для подавления повреждений почек и безопасного удаления глиомы.

Корейский патент с регистрационным номером 10-0390332 предоставляет информацию о противораковом составе, который позволяет совместное введение такого противоракового средства, как доксорубицин или цисплатин, с гидроксихлорохином, хлорохином, примахином и т.п., который часто используется в качестве противомалярийного средства, уменьшая тем самым 50% ингибирующую концентрацию (IС₅₀) противоракового средства и подавляя устойчивость раковых клеток к лекарственному средству, вызванную противораковыми средствами. При этом противомалярийное средство, такое как гидроксихлорохин, используется в качестве вспомогательного вещества для подавления сопротивления раковых клеток противораковому средству с целью повышения противоракового воздействия противоракового средства, а противораковое средство проявляет свое воздействие посредством системного введения различными путями, такими как пероральный и парентеральный путь.

До настоящего времени не было известно, что гидроксихлорохин обладает противораковым воздействием. Таким образом, еще не сообщалось о противораковом средстве на основе гидроксихлорохина.

Техническая проблема

Задачей настоящего изобретения является использование гидроксихлорохина в качестве противоракового средства для местного применения. В частности, задачей настоящего изобретения является предоставление противоракового состава для местного применения, который проявляет цитотоксическое действие по отношению к раковым клеткам, не влияя на нормальные клетки, и который должен вводиться непосредственно в раковые клетки.

Техническое решение

Чтобы выполнить вышеупомянутую задачу, настоящее изобретение предоставляет инъецируемый противораковый состав для местного применения, содержащий гидроксихлорохин или его соль.

Противораковый состав настоящего изобретения может вводиться непосредственно в раковые клетки. Желательно, чтобы противораковый состав настоящего изобретения также содержал местный анестетик, такой как лидокаин, и/или антиоксидант, такой как рибофлавин.

Настоящее изобретение преследует цель сделать возможным введение состава на основе гидроксихлорохина непосредственно в раковые клетки, проявляя тем самым противораковое воздействие. Состав для местного применения, содержащий гидроксихлорохин, вводится непосредственно в пораженный участок, чтобы инактивировать местные ткани, блокируя тем самым обмен веществ в местных тканях. Обмен веществ раковых клеток быстрее, чем у нормальных клеток, поэтому при блокировке обмена веществ раковых клеток гидроксихлорохином ткани раковых клеток инактивируются, что приведет к отмиранию тканей раковых клеток.

Желательное содержание гидроксихлорохина в составе настоящего изобретения составляет 5-25% (масса/объем) и 20-25% (масса/объем). Если содержание гидроксихлорохина менее 5% (масса/объем), он не проявит лечебного воздействия, а если содержание гидроксихлорохина более 25% (масса/объем), он может вызвать отмирание нормальных тканей, окружающих раковые клетки.

Согласно настоящему изобретению, в инъецируемом составе для местного применения местный анестетик служит для снятия боли во время применения путем введения состава непосредственно в раковые клетки. Предпочтительно в качестве местного анестетика использовать лидокаин в концентрации 1-2% (масса/объем). Антиоксидант также служит для стабилизации состава. В качестве антиоксиданта используется рибофлавин в концентрации 0,1-0,5% (масса/объем).

Также, принимая во внимание растворимость гидроксихлорохина в воде, можно использовать соль гидроксихлорохина. В частности, предпочтение отдается сульфату гидроксихлорохина.

Инъецируемый противораковый состав для местного применения согласно настоящему изобретению можно приготовить в соответствии с любым общепринятым методом приготовления инъецируемых препаратов.

Согласно настоящему изобретению, инъецируемый противораковый состав для местного применения предпочтительно вводить непосредственно в раковые клетки. Состав настоящего изобретения можно вводить повторно с интервалами 3-4 дня в течение нескольких недель, в зависимости от состояния пациента, или можно повторно вводить с интервалами 1-2 дня, в зависимости от размера и развития раковых клеток, в результате чего можно подавить распространение и обмен веществ раковых клеток, чтобы инактивировать раковые клетки за короткий срок.

Описание рисунков

РИС.1 - это графическая схема, представляющая результаты оценки воздействия состава настоящего изобретения на рост клеточной линии саркомы-180 по сравнению с контрольным препаратом с помощью анализа МТТ.

РИС.2 - это графическая схема, представляющая воздействие состава настоящего изобретения на дифференциацию клеточной линии саркомы-180 у белых беспородных мышей по сравнению с контрольным препаратом.

РИС.3 - это графическая схема, представляющая воздействие состава настоящего изобретения на рост солидного рака, вызванного клетками саркомы-180 у белых беспородных мышей.

РИС.4 - это графическая схема, представляющая воздействие состава настоящего изобретения на увеличение времени жизни белых беспородных мышей после введения асцитного ракового новообразования мышам посредством клеток саркомы-180.

Лучший вариант

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Следует понимать, однако, что эти примеры приведены в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Метод испытания

(1) Препараты для введения

Противораковый состав настоящего изобретения, который использовался в этом испытании, был подготовлен в качестве препарата для местного применения путем введения непосредственно в раковые клетки. В частности, гидроксихлорохин был добавлен в физиологический раствор для инъекций с концентрацией 20% (масса/объем), а 20% этанола в качестве растворителя было добавлено в концентрации 10-20% на основе объема полученного состава. Смесь была растворена путем нагрева на водяной бане. Затем туда добавили лидокаин и рибофлавин в количестве 2% (масса/объем) и 0,1% (масса/объем), соответственно, приготовив тем самым инъецируемый состав для местного применения.

Цисплатин, используемый в качестве положительного контрольного препарата, был приобретен у компании Sigma Со. (Сигма Ко) (США).

(2) Раковая клеточная линия

Раковой клеточной линией, используемой в настоящем примере, была саркома-180 (KCLB 4066), полученная из Корейского банка клеточных линий.

В качестве среды культивирования клеточной линии использовалась среда RPMI 1640, содержащая 10% эмбриональную бычью сыворотку (ЭБС), дополненную стрептомицином (100 мкл/мл) и пенициллином (100 мкл/мл).

Клеточная линия саркомы-180 была пересеяна в 5% СO₂ инкубатор при 37°С на 48 часов и использовалась во время испытания.

Для испытаний на животных клеточная линия саркомы-180 вводилась в брюшную полость белых беспородных мышей в концентрации 2×10⁷ клеток/мл. Приблизительно после 2 недель асциты были собраны и центрифугированы при 2000 оборотов в минуту, а осадок был два раза промыт, а затем помечен синим трипсином 0,4%, тем самым было получено 2×107⁷ клеток/мл.

(3) Испытания на животных

Белые беспородные мыши в возрасте 5 недель были приобретены и акклиматизировались в течение 1 недели перед использованием в испытании. Животных держали при температуре 22±2°С и относительной влажности 50% 12 часов при свете /12 часов в темноте.

Пример 1: Измерение цитотоксичности в отношении саркомы-180

Чтобы оценить воздействие состава настоящего изобретения на цитотоксичность, использовался анализ МТТ. Анализ МТТ является лабораторным методом испытаний для измерения жизнеспособности клеток, и может рассматриваться как стандартный колориметрический анализ. При помощи анализа МТТ можно точно измерить распространение и количество живых клеток, он является неотъемлемой процедурой в области бионауки, в частности в области биологии опухолей.

Перед проведением испытаний на живых организмах, таких как испытания на животных, для обнаружения воздействия для разработки новых противораковых препаратов или изучения чувствительности к существующим противораковым препаратам, необходимо провести процесс вне организма, объективно демонстрирующий, что препарат замедляет рост опухоли.

Клеточную линию саркомы-180, доведенную до концентрации клеток 1×10⁵ клеток/мл добавили в каждую лунку 96-луночной плашки и культивировали в 5% СО₂ инкубаторе при 37°С в течение 24 часов. После 24 часов культивирования состав изобретения, разведенный до 8 концентраций от 1,0 мкл до 0 мкл, был добавлен в каждую лунку. При этом цисплатин также разбавили подобным образом и добавили в каждую лунку.

Затем клетки культивировали в 5% СO₂ инкубаторе при 37°С в течение 24 часов, и добавили 50 мкл реагента МТТ с концентрацией 2 мг/мл. Затем клетки выдержали в инкубаторе при 37°С в течение 4 часов.

Клеточную культуру центрифугировали, чтобы удалить надосадочную жидкость, и добавляли 200 мкл ДМСО в каждую лунку, чтобы растворить окрашенный МТТ осадок, после того как значение OD₅₄₀ было измерено с помощью считывающего устройства иммуноферментного анализа при длине волны 540 нм.

50% ингибирующая концентрация (IС₅₀) была определена как концентрация препарата, что привело к 50% жизнеспособности клеток, а значение IC₅₀ использовалось как показатель противоракового воздействия препарата.

РИС.1 - графическая схема, показывающая результаты оценки воздействия состава настоящего изобретения на рост клеточной линии саркомы-180 по сравнению с контрольным препаратом с помощью анализа ММТ.

Состав настоящего изобретения был добавлен в суспензию клеточной линии саркомы - 180 с концентрацией клеток 2×10⁷ клеток/мл, а затем ее противораковое действие сравнили с контрольным препаратом цисплатином. В результате, как можно увидеть на РИС.1, значение IC₅₀ состава изобретения было показано при 0,01 мкл или менее.

Другими словами, значение IC₅₀ состава изобретения в отношении саркомы-180, определенное анализом МТТ на живых организмах, было приблизительно в 10 раз ниже, чем у цисплатина, указывая на то, что состав настоящего изобретения имеет превосходное цитотоксическое воздействие.

Пример 2: Ингибирующее воздействие на дифференциацию раковых клеток

Чтобы пронаблюдать за противораковым действием состава настоящего изобретения у белых беспородных мышей, мышам были привиты клетки саркомы-180, и проведена оценка воздействия состава настоящего изобретения на дифференциацию клеток саркомы-180.

В частности, как показано в таблице 1 ниже, животные, приспособившиеся к условиям содержания, были поделены в итоге на 6 групп (Г1-Г6), каждая из которых состояла из 12 животных. В таблице 1 показано создание опытных групп и концентрация препарата.

[Таблица 1]
Группа	Доза	Количество животных
Г 1	N (нормальная группа)	0	12
Г 2	С (контрольная группа)	0	12
Г 3	L (группа, принимавшая малую дозу)	16,6 мкл/кг веса	12
Г 4	М (группа, принимавшая среднюю дозу)	83,3 мкл/кг веса	12
Г 5	Н (группа, принимавшая большую дозу)	166,6 мкл/кг веса	12
Г 6	Cis (цисплатин)	20 мг/м2	12

Клеточная суспензия саркомы-180 с концентрацией клеток 2×10⁷ клеток/мл была пересажена путем подкожного введения в паховую область всех групп за исключением нормальной группы, вызывая тем самым солидный рак. Состав настоящего изобретения был установлен на малую дозу (16,6 мкл/кг веса), среднюю дозу (83,3 мкл/кг веса) и большую дозу (166,6 мкл/кг веса), каждая доза состава вводилась мышам с 3-дневным интервалом в течение 6 недель сразу после стимулирования асцитного рака, в то же время оценивалось воздействие состава изобретения на прививку и дифференциацию раковых клеточных линий и сравнивались с теми же показателями цисплатина.

В последний день испытания животные прошли биопсию, и у ряда животных, у которых клетки саркомы-180 стабильно росли, эти клетки были измерены и использовались в качестве противоракового индекса. Это же испытание было проведено два раза, результаты двух измерений усреднялись.

РИС.2 - это графическая схема, показывающая воздействие состава настоящего изобретения на дифференциацию клеточной линии саркомы-180 у белых беспородных мышей по сравнению с контрольным препаратом. На РИС.2, L: малая доза состава изобретения; М: средняя доза состава изобретения; Н: большая доза состава изобретения; cis: цисплатин; N: нормальная группа; и С: контрольная группа.

Как описывалось выше, после завершения испытания, наличие или отсутствие раковых клеток в паховой области определялось с помощью биопсии. В результате, как видно на РИС.2, раковые клетки наблюдались у 9,5 животных в группе, принимавшей малую дозу, у 7,5 животных в группах, принимавших среднюю и большую дозу, и у 4,5 животных для контрольного препарата цисплатина.

Другими словами, ингибирующее воздействие состава настоящего изобретения на дифференциацию раковых клеток было несколько выше, чем в контрольной группе, но не выше, чем в группе цисплатина.

Считается, что причиной того, что эффективность состава настоящего изобретения была разной для живых организмов и вне организмов в том, что длина диффузии гидроксихлорохина была ограничена, потому что гидроксихлорохин не растворяется при комнатной температуре.

Тестовый пример 3: Противораковое действие на солидный рак

Чтобы пронаблюдать противораковую активность состава настоящего изобретения у белых беспородных мышей, белым беспородным мышам ввели клетки саркомы-180 для индукции солидного рака, после чего была произведена оценка воздействия инъецируемого состава на смерть клеток саркомы-180.

Согласно Таблице 2 ниже, животные, приспособившиеся к жилищным условиям, были разделены на 4 группы (Г1-Г4), каждая из которых состояла из 10 животных. Таблица 2 ниже показывает определение тестовых групп и концентрацию лекарства.

[Таблица 2]
Группа	Доза	Количество животных
Г1	Контрольная группа	0	10
Г2	Группа, получающая слабую дозу	83 мкл/кг веса	10
ГЗ	Группа, получающая среднюю дозу	166 мкл/кг веса	10
Г4	Группа, получающая сильную дозу	415 мкл/кг веса	10

Взвесь отмытых клеток саркомы-180 с концентрацией клеток 2×10⁷ клеток/мкл была трансплантирована посредством подкожного впрыскивания в паховую область всем группам, в связи с этим получивших солидный рак. Состав настоящего изобретения установлен в дозах, указанных в Таблице 2, каждая доза состава вводилась мышам дважды в неделю с 3-дневным интервалом в течение 6 недель через 1 неделю после трансплантации линии раковых клеток, когда наблюдалась степень индукции солидного рака.

В последний день испытания посредством биопсии был проведен визуальный осмотр, вес опухолевых клеток был измерен и использован в качестве противоракового показателя.

РИС.3 представляет собой графическую схему, показывающую воздействие состава настоящего изобретения на рост солидного рака, индуцированного клетками саркомы-180 у белых беспородных мышей. На РИС.3, Г1: контрольная группа; Г2: введено 83 мкл/кг веса инъецируемого состава (20% гидроксихлорохин); Г3: введено 166 мкл/кг веса инъецируемого состава; и Г4: введено 415 мкл/кг веса инъецируемого состава.

В результате, как можно увидеть по РИС.3, средняя масса опухолевых клеток составила 4,81±1,69 г в контрольной группе, которой не вводилось лекарство, в группе Г2 - 4,16±1,68 г (вводился инъецируемый состав (20% гидроксихлорохина)), в группе Г3 - 3,92±1,00 г, и 3,31+0,72 г в группе Г4, указывая на то, что состав настоящего изобретения сокращал вес солидного рака в зависимости от дозировки.

Тестовый пример 4: Наблюдение противоракового действия на асцитный рак

У мышей с асцитным раком, индуцированным трансплантацией клеток саркомы-180, оценивалось противораковое действие состава настоящего изобретения и воздействие состава на увеличение времени жизни мышей.

Согласно Таблице 3 ниже, животные, приспособившиеся к жилищным условиям, были разделены на 3 группы (Г1-Г3), каждая из которых состояла из 10 животных.

Таблица 3 ниже показывает образование тестовых групп и концентрацию лекарства.

[Таблица 3]
Группа	Доза	Количество животных
Г1	Контрольная группа	0	10
Г2	Группа, получающая среднюю дозу	166 мкл/кг веса	10
Г3	Группа, получающая сильную дозу	830 мкл/кг веса	10

Взвесь отмытых клеток саркомы-180 с концентрацией клеток 2×10⁷ клеток/мкл была введена в брюшную полость всех групп для индукции асцитного рака. Состав настоящего изобретения установлен в дозах, указанных в Таблице 3, и каждая доза состава вводилась животным с 3-дневным интервалом в течение 6 недель после индукции асцитного рака, тогда как производились наблюдения за смертностью животных, которая сравнивалась со смертностью в группе, которой вводился цисплатин.

РИС.4 представляет собой графическую схему, показывающую воздействие состава настоящего изобретения на продолжительность жизни белых беспородных мышей после индукции асцитного рака у белых беспородных мышей клетками саркомы-180. На Рис.4, Г1: контрольная группа; Г2: введено 166 мкл/кг веса инъецируемого состава (20% гидроксихлорохина); и Г3: введено 830 мкл/кг веса инъецируемого состава.

Смертность животных от асцитного рака исследовалась до последнего дня (42 день) испытания. В результате в контрольной группе мертвые животные начали появляться с 9 дня, и на 21 день около половины животных были мертвы, на 42 день выжило одно животное, но полагают, что выжившее животное не было заражено асцитным раком, или степень индукции асцитного рака у этого животного была недостаточной.

В группе Г2 мертвые животные начали появляться на 13 день, чуть позже, чем в контрольной группе, на 26 день половина животных погибли, но по состоянию на последний день исследования выжило 3 животных. Тем не менее в группе Г3 все животные были мертвы в первый день после введения лекарства. Эти результаты предполагают, что состав настоящего изобретения способствует продлению длительности жизни животных с асцитным раком.

Промышленная применимость

Как описано выше, инъекционный лекарственный состав для местного применения с гидроксихлорохином, в соответствии с настоящим изобретением, показывает значение IC₅₀ против клеток саркомы-180, что примерно в 10 раз ниже, чем у цисплатина, что было определено лабораторным МТТ-тестом, с предположением, что состав настоящего изобретения обладает превосходным цитотоксическим действием. Также состав настоящего изобретения показывает дозозависимое воздействие на солидный рак, индуцированный клетками саркомы-80 в организме. В дополнение к этому, состав настоящего изобретения обладает воздействием на продление длительности жизни пациентов с асцитным раком, индуцированным клетками саркомы-80.

1. Инъекционный лекарственный противораковый состав для введения непосредственно в раковые клетки, включающий 5-25% (мас./об.) гидроксихлорохина или сульфата гидроксихлорохина, лидокаин в концентрации 1-2% (мас./об.), рибофлавин в концентрации 0.1-0.5% (мас./об.) и физиологический раствор.

2. Состав по п.1, в котором содержание гидроксихлорохина составляет 20% (масса/объем).