Лечение аутоиммунного заболевания путем модулирования активности аннексина-1 (липокортина-1)

Лечение аутоиммунного заболевания путем модулирования активности аннексина-1 (липокортина-1)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способам лечения заболеваний, опосредованных Т-клетками, путем модулирования активности Аннексина-1.

Аутоиммунные заболевания - это хронические приводящие к инвалидности патологии, вызванные неправильным функционированием иммунной системы. В большинстве случаев их причиной является неконтролируемый ответ Т-клеток на собственные антигены, презентированные в контексте молекул ГКГС антиген-презентирующих клеток (АПК). Было описано несколько факторов, вовлеченных в патогенез аутоиммунных заболеваний, в том числе факторы внешней среды, генетические и вирусные факторы, которые связаны с одной общей особенностью: гиперчувствительностью Т-клеток.

Глюкокортикоиды (ГК) часто применяют для лечения ряда хронических аутоиммунных заболеваний благодаря их способности одновременно блокировать как врожденный, так и приобретенный иммунный ответ. Исследования последних десяти лет, проведенные авторами настоящего изобретения и другими исследовательскими группами, показали, что некоторые из воспалительных эффектов, оказываемых ГК на врожденный иммунный ответ, опосредованы белком Аннексином-1 (Annexin-1, Anx-A1). Было показано, что этот белок осуществляет гомеостатическую регуляцию многих типов клеток, в том числе нейтрофилов, макрофагов и клеток эндотелия. Однако одним аспектом, которому не уделяли никакого внимания, является роль Anx-A1 в адаптивном иммунном ответе. Это вызывает удивление, с учетом того, что, как предполагается, Anx-A1 является одним из вторичных посредников фармакологического действия ГК.

Авторы данного изобретения ранее показали, что Anx-A1 играет гомеостатическую роль в Т-клетках, за счет модулировния интенсивности передачи сигналов рецептором Т-клеток (TCR) (D'Acquisto et al., Blood 109: 1095-1102, 2007).

Более того, авторы настоящего изобретения показали, что высокий уровень Anx-A1 снижает порог активации Т-клеток и способствует дифференцировке в клетки Th1, в то время как мыши, дефицитные по Anx-A1, демонстрируют нарушение активации Т-клеток и более интенсивную дифференцировку в клетки Th2 (D'Acquisto et al., Eur. J. Immunol. 37: 3131-3142, 2007).

В публикации WO 2005/027965 описано открытие механизма, за счет которого апоптотические нейтрофилы доставляют противовоспалительные сигналы к дендритным клеткам, а также идентифицированы антитела, которые препятствуют этому процессу. В частности, в публикации WO 2005/027965 Anx-1 идентифицирован в качестве сигнальной молекулы, которая предположительно экспрессируется апоптотическими нейтрофилами для подавления активации и созревания дендритных клеток. Как предполагается в публикации WO 2005/027965, антитела, называемые DAC5 (Detector of Apoptotic Cells Nr.5, Детектор Апоптотических Клеток 5), опознают и блокируют противовоспалительное действие Anx-A1, презентированного на поверхности апоптотических нейтрофилов, при фагоцитозе дендритными клетками. Таким образом, в публикации WO 2005/027965 говорится о возможности лечения различных заболеваний при помощи направленного воздействия на такие апоптотические клетки и их удаления за счет индукции воспалительного ответа, но в ней не обсуждается роль Anx-A1 в активации Т-клеток.

В публикации WO 2005/027965 заявлено, что аннексины экспрессируются на поверхности клеток, которые подвергаются апоптозу (например, см. стр.8, строки 6-7 и 29-30), и аннексины презентированы на поверхности таких клеток (например, см. стр.6, строки 10-11 и стр.8, строки 16-17). Однако в двух отдельных исследованиях (Maderna et al., J Immunol., 174: 3727-3733, 2005; Scannell et al., J Immunol., 178: 4595-4605, 2007) показано, что апоптотические клетки, включая нейтрофилы, вероятнее, секретируют аннексин-1, а не экспрессируют этот белок и презентируют его на поверхности клетки. Поскольку аннексин-1 секретируется клеткой, нельзя утверждать, что DAC5 распознает только апоптотические клетки, экспрессирующие этот белок на своей поверхности, так как указанные антитела будут также распознавать секретированный аннексин-1.

Кроме того, в публикации WO 2005/027965 указано, что совместная инкубация апоптотических нейтрофилов, экспрессирующих аннексин-1 на своей клеточной мембране, и дендритных клеток, активированных с помощью ЛПС, приводит к подавлению секреции TNF-α, и к увеличению уровня синтеза маркеров активации CD83, CD86 и HLA-DR, и что добавление DAC5 к этой культуре обращает ингибирующее действие аннексина-1, экспрессируемого апоптотическими нейтрофилами (стр.5, строка 31 до стр.6, строка 8). Данные авторов настоящего изобретения (Huggins et al., FASEB J. 2008, в печати) показывают, что дендритные клетки высвобождают Anx-A1 после стимуляции с помощью ЛПС и, таким образом, DAC5, описанные в публикации WO 2005/027965, должны связываться как с Anx-A1, находящимся на нейтрофилах, так и с аннексином-1, секретированным дендритными клетками. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что отсутствие аннексина-1 в дендритных клетках вызывает увеличение уровня экспрессии маркеров созревания/активации и продукцию провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL-1β и IL-12. Следовательно, антитела DAC5, описанные в публикации WO 2005/027965, должны влиять на созревание и активацию дендритных клеток и, таким образом, на дальнейшее модулирование иммунного ответа.

В поддержку этого, авторами настоящего изобретения было показано, что дендритные клетки Anx-А1^-/-, при совместном культивировании с наивными Т-клетками в смешанной лимфоцитарной реакции (СЛР), демонстрируют значительное уменьшение способности индуцировать как пролиферацию Т-клеток, так и продукцию IL-2 и IFN-γ. Таким образом, агенты, блокирующие функции Anx-A1 в дендритных клетках, должны уменьшать их способность стимулировать интенсивный иммунный ответ, опосредованный Т-клетками. Антитела, описываемые в публикации WO 2005/027965, таким образом, по-видимому, не подходят для лечения заболеваний, описанных в настоящей заявке на патент.

Настоящее изобретение предусматривает применение специфично связывающихся молекул, которые связываются с Аннексином-1 (Anx-A1), при лечении заболеваний, опосредованных Т-клетками.

Согласно первому аспекту изобретения предусмотрена специфично связывающаяся молекула, которая связывается с Аннексином-1 (Anx-A1) для применения в лечении заболеваний, опосредованных Т-клетками.

Авторами настоящего изобретения ранее было показано, что Anx-A1 изменяет интенсивность сигналинга от рецептора Т-клеток (TCR) и что высокий уровень Anx-A1 снижает порог активации Т-клеток и способствует дифференцировке в клетки Th1. В настоящее время авторы идентифицировали сигнальный путь, опосредованный аннексином, и следующий за ним сигнал, в качестве мишени для блокады с целью лечения заболеваний, опосредованных Т-клетками. Такие заболевания включают заболевания, при которых наблюдается аномальная активация Т-клеток, например, многие аутоиммунные заболевания, и заболевания, при которых желательно изменить дифференцировку Т-клеток в направлении Th1 вместо Th2.

В данном изобретении применяют специфично связывающуюся молекулу, которая связывается с Аннексином-1 (Anx-А1).

Аннексины - это группа кальций- и фосфолипид-связывающих клеточных белков, также известных как липокортины. Семейство аннексинов состоит из 13 членов, включая Аннексин А1, Аннексин А2 и Аннексин А5. Аннексин А-1, также известен как Аннексин-1, и в данной заявке обозначен "Anx-A1". Аннексин-1 (Anx-A1) представляет собой белок с молекулярной массой 37 кДа, который изначально был описан как посредник действия глюкокортикоидов. За последние несколько лет появились доказательства того, что Anx-A1 выполняет гомеостатическую функцию в приобретенном иммунном ответе, в частности, в Т-клетках, за счет изменения интенсивности сигналинга от Т-клеточного рецептора (TCR). Anx-A1 действует как эндогенный ингибитор воспаления в клетках врожденной иммунной системы in vivo. На Фигуре 1А представлена ленточная диаграмма трехмерной структуры Anx-A1.

У человека существует 8 нуклеотидных последовательностей, кодирующих Anx-A1. Из них транслируются только четыре и, таким образом, существует четыре изоформы Anx-A1, обозначаемые как ANXA1-002, ANXA1-003, ANXA1-004 и ANXA1-006. Эти последовательности доступны на сайте Ensembl (www.ensembl.org) и обозначены как OTTHUMT00000052664 (ANXA1-002), OTTHUMT00000052665 (ANXA1-003), OTTHUMT00000052666 (ANXA1-004) и OTTHUMT00000052668 (ANXA1-006). Аминокислотная и нуклеотидная последовательности одной из изоформ человеческого Аннексина-1 (Anx-A1), ANXA1-003, показаны на Фигуре 2а. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности изоформ ANXA1-002, ANXA1-004 и ANXA1-006 приведены на Фигурах 2b, 2с и 2d, соответственно. Как можно видеть на Фигуре 2, изоформы ANXA1-002, ANXA1-004 и ANXA1-006 являются короткими сплайсированными вариантами ANXA 1-003 или вариантами ANXA 1-003 с небольшим числом аминокислотных замен.

В ряде исследований показано, что N-концевой пептид Anx-A1, называемый Ас.2-26, действует как биологически активный суррогат целого белка (см., напр., Lim et al., Proc Nati Acad Sci USA 95, 14535-9, 1998).

На Фигуре 1В схематично представлены повторы в составе аннексина и локализация такой биологически активной последовательности. Пептид Ас.2-26 представляет собой апетилированный пептид с последовательностью аминокислотных остатков 2-26 из полноразмерной аминокислотной последовательности Anx-A1, показанной на Фигуре 2. Последовательность пептида Ас.2-26 показана на Фигуре 1C.

Биологическое действие Anx-A1 и его производных N-концевых биологически активные пептидов опосредованы членами семейства рецепторов формильных пептидов (FPR, formyl peptide receptor). Anx-A1 оказывает контррегуляторное действие на экстравазацию нейтрофилов и врожденный иммунитет за счет непосредственного связывания и активации одного из членов этого семейства, белка, подобного рецептору формильных пептидов-1 (Formyl Peptide Receptor-Like-1, FPRL-1). Авторами настоящего изобретения ранее было обнаружено, что стимуляция Т-клеток в присутствии hrAnx-A1 повышает уровень активации Т-клеток за счет стимуляции FPRL-1 (D'Acquisto et al., Blood 109; 1095-1102, 2007).

В настоящем изобретении применяют специфично связывающуюся молекулу, которая связывается с Аннексином-1 (Anx-A1). Anx-A1, с которым связывается указанная специфично связывающаяся молекула в основном представляет собой Anx-A1 человека, имеющий полипептидную последовательность, приведенную на Фигуре 2а, или его вариант, или его фрагмент, как, например, одну из изоформ Anx-A1 человека, включающую полипептидную последовательность, показанную на Фигуре 2b, Фигуре 2с или Фигуре 2d. Фрагмент Anx-A1 человека, с которым связывается указанная специфично связывающаяся молекула, как правило представляет собой полипептид, имеющий последовательность, показанную на Фигуре 1C. Anx-A1, с которым связывается специфично связывающаяся молекула согласно настоящему изобретению, как правило кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной на Фигуре 2а

Используемый в настоящей заявке термин «вариант» относится к белкам, которые имеют сходные аминокислотные последовательности и/или которые сохраняют одинаковые функции. В частности, термин «вариант» охватывает белки или полипептиды, которые содержат одну и более аминокислотную вставку, делецию, замену и т.п. Аминокислотные замены как правило представляют собой консервативные замены, то есть замены одной аминокислоты на другую со сходными свойствами, таким образом, что в целом функционирование белка не подвергается значительным изменениям.

Так, аминокислоты глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин часто могут заменять друг друга (аминокислоты с алифатическими боковыми цепями). Среди возможных предпочтительны замены, при которых замещают друг друга глицин и аланин (поскольку они имеют относительно короткие боковые цепи) или валин, лейцин и изолейцин (они имеют большие алифатические боковые цепи, которые обладают свойством гидрофобности). Другими аминокислотами, которые часто могут заменять друг друга, являются фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты, содержащие ароматические боковые цепи); лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты с основными боковыми цепями); аспарагин и глутамин (аминокислоты, с кислыми боковыми цепями) и цистеин и метионин (аминокислоты с серосодержащими боковыми цепями).

Для аминокислот используются следующие трехбуквенные и однобуквенные обозначения: глицин (G или Gly), аланин (А или Ala), валин (V или Val), лейцин (L или Leu), изолейцин (I или Ile), пролин (Р или Pro), фенилаланин (F или Phe), тирозин (Y или Tyr), триптофан (W или Trp), лизин (K или Lys), аргинин (R или Arg), гистидин (Н или His), аспарагиновая кислота (D или Asp), глутаминовая кислота acid (E или Glu), аспарагин (N или Asn), глутамин (Q или Gln), цистеин (С или Cys), метионин (М или Met), серин (S или Ser) и треонин (Т или Thr). В случае, если аминокислотный остаток может представлять собой аспарагиновую кислоту или асапарагин, могут использоваться обозначения Asx или В. В случае, если аминокислотный остаток может представлять собой глутаминовую кислоту или глутамин, могут использоваться обозначения Glx или Z. Аспарагиновая кислота также подразумевает аспартат, а глутаминовая кислота - глутамат, если в тексте не обозначено иначе.

Указанная выше последовательность белка также может содержать делеции или вставки аминокислот. Так, например, аминокислоты, удаление которых не оказывает значительного влияния на активность белка или по меньшей мере не уничтожает указанную активность, могут быть делетированы. Такие делеции могут быть выгодны, в случае если они уменьшают общую длину и молекулярный вес полипептида при сохранении его активности. Это может позволить уменьшить количество белка, необходимого для конкретной цели - например, могут быть уменьшены размеры доз.

Также могут осуществляться вставки аминокислот в последовательность химерного белка. Это может быть сделано для изменения свойств указанного вещества (например, облегчения его идентификации, очистки или экспрессии).

Также вышеописанная последовательность может содержать аминокислотные замены, которые можно осуществлять для изменения свойств белка (например, для облегчения его определения, очистки или экспрессии). Аминокислотные замены можно осуществлять с использованием любой подходящей техники, например, с помощью направленного мутагенеза или твердофазного синтеза.

Необходимо учитывать, что аминокислотные замены или вставки в рамках данного изобретения можно осуществлять с применением как природных, так и неприродных аминокислот. Вне зависимости от того, используется ли природная или неприродная аминокислота, предпочтительно присутствие только L-аминокислот.

Для сравнения аминокислотных последовательностей можно использовать такую программу, как CLUSTAL. Эта программа сравнивает аминокислотные последовательности и находит оптимальное выравнивание за счет внедрения пропусков в любую из последовательностей при необходимости. Возможно рассчитать идентичность или сходство (идентичность, а также сохранение типа аминокислоты) для оптимального выравнивания. Такие программы, как BLASTx, выравнивают наиболее длинный участок со сходными последовательностями и оценивают уровень идентичности. Таким образом, можно сравнить найденные области со сходными последовательностями, каждая из которых имеет свой уровень идентичности. В данном изобретении рассмотрены оба типа анализа идентичности.

Варианты белков и полипептидов, описанные в настоящей заявке, должны сохранять функцию исходного белка или полипептида. В качестве альтернативы или в добавление к сохранению функции исходного белка или полипептида, варианты белков или полипептидов, описанные в настоящей заявке, обычно имеют по меньшей мере 60% идентичности (как говорилось выше) с белками или полипептидами, описанными в настоящей заявке, в частности, с полипептидными последовательностями, показанными на Фигуре 1C или Фигуре 2. В большинстве случаев варианты, применяемые в настоящем изобретении, имеют по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 99% идентичности с белками или полипептидами, описанными в настоящей заявке, в частности, с полипептидными последовательностями, показанными на Фигуре 1C или Фигуре 2.

Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей определяется при помощи выравнивания последовательностей с целью оптимального сравнения (например, в первую последовательность можно ввести пропуски для лучшего сравнения с другой последовательностью) и для сравнения аминокислотных остатков или нуклеотидов в позициях, соотносящихся друг с другом. «Наилучшее выравнивание» - это такое выравнивание двух последовательностей, которое приводит к максимальному проценту идентичности. Процент идентичности определяется как число одинаковых аминокислотных или нуклеотидных остатков в сравниваемых последовательностях (т.е. % идентичности = число идентичных позиций/общее число позиций × 100).

Определение процента идентичности двух последовательностей может быть усовершенствовано за счет использования математического алгоритма, известного специалистам в данной области техники. Одним из примеров математического алгоритма для сравнения двух последовательностей является алгоритм Карлина и Альтшула (Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268), модифицированный Карлином и Альтшулом в 1993 (Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Программы NBLAST и XBLAST (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410) включают такой алгоритм. Для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеиновым кислотам данного изобретения, нуклеотидный поиск BLAST может осуществляться с помощью программы NBLAST, счет = 100, длина слова = 12. Для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам данного изобретения, поиск белков BLAST может осуществляться с помощь программы XBLAST, счет = 50, длина слова = 3. Для получения выравниваний с пропусками с целью сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано у Альтшула и др. (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). В качестве альтернативы может использоваться PSI-Blast для проведения повторного поиска, который выявляет отдаленные сходства между молекулами (Id.). При использовании программ BLAST, Gapped BLAST, и PSI-Blast, могут быть использованы параметры по умолчанию в соответствующих программах (например, XBLAST и NBLAST). См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Другим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Миерса и Миллера (Myers and Miller, CABIOS (1989)). Программа ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программ выравнивания последовательностей CGC, включает в себя такой алгоритм. Другие алгоритмы для анализа последовательностей, известные в данной области техники, включают ADVANCE ADAM как описано у Тореллиса и Роботти (Torellis и Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5); и FASTA, описанный у Пирсона и Липмана (Pearson и Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-8). В FASTA, параметр ktup представляет собой контрольную опцию, которая позволяет настраивать чувствительность и скорость поиска.

При использовании альтернативного подхода варианты могут представлять собой химерные белки, включающие компоненты, которые облегчают очистку, например за счет эффективного тэгирования (присоединения) нужного белка или полипептида. Иногда необходимо удаление «тэга», но в некоторых случаях возможно, что сам химерный белок сохраняет функциональность, достаточную для применения.

«Специфично связывающаяся молекула, которая связывается с Anx-A1» при использовании в настоящей заявке обозначает молекулу, которая связывается с Anx-A1 с большей афинностью, чем с другими молекулами, то есть молекула, которая специфично связывается с Anx-A1. Специфично связывающиеся молекулы, которые связываются с Anx-A1, включают антитела к Anx-A1 и аптамеры. Антитела к Anx-А, применяемые в настоящем изобретении, функционируют за счет блокирования активации Т-клеток и, таким образом, при введении, их можно применять для лечения заболеваний, опосредованных Т-клетками, причиной которых обычно является аберрантная активация Т-клеток.

Например, могут быть получены антитела к Anx-A1, направленные против Anx-A1 человека с аминокислотной последовательностью, показанной на Фигуре 2 (в большинстве случаев - с последовательностью, показанной на Фигуре 2а). В качестве альтернативы, антитела к Anx-A1 могут быть нацелены на определенный эпитоп или эпитопы человеческого Anx-A1 с аминокислотной последовательностью, показанной на Фигуре 2 (в большинстве случаев - с последовательностью, показанной на Фигуре 2а). В частности, антитела к Anx-A1 могут быть нацелены против N-концевого фрагмента Anx-A1, например, N-концевого фрагмента, содержащего по меньшей мере 188, 100, 50 или 25 аминокислотных остатков от N-конца аминокислотной последовательности, показанной на Фигуре 2а. В большинстве случаев, антитела к Anx-A1 для применения в данном изобретении представляют собой антитела против N-концевого фрагмента Anx-А, обозначаемого Ас2-26, который имеет последовательность, показанную на Фигуре 1C, или против фрагмента, состоящего по меньшей мере из 6 аминокислот из Ас2-26. Специфично связывающиеся молекулы, которые связываются с Anx-A1, включают, таким образом, антитела к Anx-A1, представляющие собой антитела против фрагмента Anx-A1 Ас2-26 с последовательностью, показанной на Фигуре 1C, или против фрагмента, включающего по меньшей мере 6 аминокислот из Ас2-26. В данном варианте реализации антитела к Anx-A1 получены против фрагмента последовательности, показанной на Фигуре 1C, которая является антигенной и способной к стимуляции продукции антител которые, при введении, можно применять для лечения заболеваний, опосредованных Т-клетками, причиной которых обычно является аберрантная активация Т-клеток.

Как говорилось выше, можно применять активный субфрагмент указанной последовательности, как было описано. Активные субфрагменты могут состоять из или включать фрагмент из по меньшей мере шести аминокислотных остатков (гексапептид) N-концевой части Anx-A1 называемой Ас2-26, с последовательностью, показанной на Фигуре 1C, включая одну или более последовательностей из:

Активные субфрагменты могут состоять из или включать фрагмент из по меньшей мере шести аминокислотных остатков (гексапептид) N-концевой части Anx-A1, называемой Ас2-26, с последовательностью, показанной на Фигуре 1C, например, фрагмент из по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23 или по меньшей мере 24 аминокислот из последовательности, представленной на Фигуре 1C.

Антитела к Anx-A1 включают моноклональные и поликлональные антитела. Обычно антитела к Anx-A1 являются моноклональными. Антитела к Anx-A1 могут быть коммерчески доступными, как, например, кроличьи поликлональные или мышиные моноклональные антитела. Обычно антитела к Anx-A1 гуманизированы, как детально описано ниже.

Моноклональные антитела можно получать с помощью гибридом. Обычно их получают за счет слияния клеток миеломы и клеток селезенки, которые производят необходимые антитела, с получением бессмертной линии клеток. Для получения моноклональных антител для применения в соответствии с настоящим изобретением можно применять широко известную методику Kohler & Milstein (Nature 256: 495-497 (1975)) или варианты, разработанные впоследствии на базе этой методики.

Поликлональные антитела могут быть получены за счет стимуляции их продукции в подходящем животном-хозяине (например, мышь, крыса, морская свинка, кролик, овца, коза или обезьяна) при помощи инъекций Anx-A1 или его варианта или фрагмента. Если это необходимо, также вместе с белком Anx-A1 назначается адъювант. Хорошо известные адъюванты включают адъювант Фрейнда (полный или неполный) и гидроксид алюминия. Антитела могут быть в последствие очищены за счет их связывания с Anx-A1.

Технологии для получения моноклональных и поликлональных антител, которые связываются с определенным полипептидом/белком, в настоящее время хорошо разработаны в данной области техники; они описаны в общеизвестных учебниках по иммунологии, например, во втором издании учебника «Иммунология» Ройта и др. (Roitt et al. Immunology second edition (1989), Churchill Livingstone, London).

В дополнение к целым антителам, настоящее изобретение включает их производные, которые способны к связыванию с Anx-A1, как описано в настоящей заявке. Таким образом, настоящее изобретение включает фрагменты антител и синтетические конструкции. Примеры фрагментов антител и синтетических конструкций даны Дугаллом и соавторами (Dougall et al. Trends BiotechnoL, 12: 372-379 (1994).

Фрагменты антител включают, например, фрагменты Fab, F(ab')₂ и Fv. Фрагменты Fab описаны Ройтом с соавторами (Roitt et al [supra]). Фрагменты Fv могут быть модифицированы для получения синтетической конструкции, известной как одноцепочечная молекула Fv (single chain Fv, scFv). Она включает пептидный линкер, ковалентно соединяющий области вариабельной тяжелой цепи и вариабельной легкой цепи, который придает молекуле стабильность. Линкер может состоять из 1-20 аминокислот, как, например, из 1, 2, 3 или 4 аминокислот, 5, 10 или 15 аминокислот, или же других подходящих промежуточных значений в интервале от 1 до 20. Пептидный линкер может быть образован из любых в целом подходящих аминокислотных остатков, таких как глицин и/или серин. Одним из примеров пригодного линкера является Gly₄Ser. Также можно применять мультимеры из таких линкеров, как, например, димер, тример, тетрамер или пентамер, т.е. (Gly₄Ser)₂, (GlySer)₃, (Gly₄Ser)₄ или (Gly₄Ser)₅. Однако в других вариантах реализации пептидный линкер отсутствует, и домен V_L связан с доменом V_H через пептидную связь.

Специфично связывающаяся молекула может быть аналогом вариабельного одноцепочечного фрагмента (scFv). Например, scFv может быть связан с другими специфично связывающимися молекулами (например, другие фрагменты антител: scFvs, Fab и химерные антитела IgG (напр., с каркасными участками человеческого происхождения)). cFv может быть связан с другими scFv, формируя таким образом мультимер, который представляет собой мультиспецифичный связывающийся белок, например, димер, тример или тетрамер. Биспецифичные scFv иногда называют дитела, триспецифичные - тритела и тетраспецифичные - тетратела.

scFv может быть получен с помощью любой подходящей методики с применением стандартных химических или молекулярно-биологических способов. В одном из вариантов реализации изобретения аналоги моноклональных антител могут быть получены как scFv из библиотеки нативных человеческих антител фагового дисплея (McCafferty et at. Nature 348, 552-554 (1990); и как описано в международной публикации 92/01047).

Можно применять другие синтетические конструкции, включая пептиды из гипервариабельного участка (Complementarity Determining Region, CDR). Они представляют собой синтетические пептиды, состоящие из детерминант, связывающих антиген. Также можно применять пептидные миметики. Эти молекулы представляют собой конформационно ограниченные органические кольца, которые имитируют структуру петли CDR и включают боковые цепи, взаимодействующие с антигеном.

Синтетические конструкции включают химерные молекулы. Так, в группу, антител, применяемых в настоящем изобретении, входят гуманизированные антитела или их производные. Способы гуманизации антител хорошо известны в данной области техники. Антитело может быть гуманизировано за счет модификации его аминокислотной последовательности. Примером гуманизированного антитела являются антитела, имеющие каркасные области человеческого происхождения и гипервариабельные участки от грызунов (например, мышиные). Способы продукции химерных антител описаны, например, Моррисоном и др. (Morrison et al, PNAS, 81: 6851-6855 (1984) и Такеда и др. (Takeda et al. Nature, 314: 452-454 (1985). Гуманизация может осуществляться, например, так, как описано Джонсом и др. (Jones et al. Nature, 321: 522-525, 1986) Верхоэном и др; (Verhoeyen et al. Science, 239; 1534-1536); Ричманом и др. (Riechmann et al. Nature 332: 323-327, 1988). Способы уменьшения иммуногенности специфично связывающихся молекул в настоящем изобретении могут включать пришивание CDR на каркасную часть подходящего антитела или ремоделирование остатков вариабельной поверхности, например, за счет сайт-направленного мутагенеза и других часто используемых технологий молекулярной биологии. (Roguska et al. Protein Eng. 9 895-904 (1996)).

Другие применимые методы включают идентификацию возможных эпитопов для Т-клеток внутри молекулы и их последующее удаление, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза (деиммунизация). Если необходимо, может быть проведена гуманизация участков CDR или окружающей их каркасной последовательности.

Синтетические конструкции также включают молекулы, включающие дополнительную часть, которая придает молекуле некоторые желаемые особенности в дополнение к возможности связывания с антигеном. Например, такой частью может быть метка (например, флуоресцентная или радиоактивная метка). Или же это может быть фармакологически активное вещество.

Настоящее изобретение связано с применением специфично связывающейся молекулы, которая связывается с Anx-A1, для лечения заболеваний, опосредованных Т-клетками.

Настоящее изобретение можно применять для лечения широкого круга заболеваний, опосредованных Т-клетками. В данном контексте, «заболевание, опосредованное Т-клетками» означает любое заболевание или состояние, при котором Т-клетки принимают участие в патогенезе или в развитии заболевания или патологического состояния. Заболевания, опосредованные Т-клетками, обычно вызываются аберрантной активацией Т-клеток. Соответственно, такие заболевания можно лечить, предотвращая активацию Т-клеток за счет блокирования активности Anx-A1. В большинстве случаев, заболевания, опосредованные Т-клетками, лечение которых предлагается в настоящем изобретении, - это заболевания, в которых участвуют клетки Th1.

Заболевания, опосредованные Т-клетками, включают (но не ограничены перечисленными) заболевание «трансплантат против хозяина», отторжение трансплантата, атеросклероз, ВИЧ и/или СПИД, псориаз и некоторые аутоиммунные заболевания. Аутоиммунные заболевания, которые можно лечить с помощью настоящего изобретения, включают ревматоидный артрит (РА), рассеянный склероз (PC), системную красную волчанку (СКВ), болезнь Аддисона, болезнь Грейвса (базедову болезнь), склеродермию, полимиозит, некоторые формы сахарного диабета (например, ювенильный диабет), аутоиммунный увеоретинит, язвенный колит, обыкновенную пузырчатку, воспалительную болезнь кишечника и аутоиммунный тиреоидит. Наиболее распространенные заболевания, опосредованные Т-клетками - это ревматоидный артрит, рассеянный склероз, системная красная волчанка или атеросклероз.

Типичное заболевание, опосредованное Т-клетками - это ревматоидный артрит. Считается, что при ревматоидном артрите (РА) Т-клетки распознают и взаимодействуют с антиген-презентирующими клетками в синовиальной оболочке. Будучи активированными, эти клетки продуцируют цитокины и эффекторные молекулы; эта последовательная, расширяющаяся продукция цитокинов составляет «цитокиновый каскад», который приводит к активации макрофагов и индукции воспалительного процесса, итогом которого является деградация и резорбция хрящей и костей. С течением времени может происходить эрозия костей, разрушение хряща и полная потеря целостности сустава. В конечном счете могут быть поражены многие системы органов.

В другом варианте реализации типичным заболеванием, опосредованным Т-клетками, является атеросклероз. Воспаление играет ключевую роль в заболевании коронарной артерии и других проявлениях атеросклероза. Клетки иммунитета управляют ранними атеросклеротическими повреждениями; их эффекторные молекулы ускоряют развитие повреждений, а активация воспаления может вызвать острые коронарные синдромы. Приобретенный иммунитет также тесно связан с атерогенезом, поскольку было показано, что он взаимодействует с метаболическими факторами риска, вызывая, распространяя и активируя повреждения в артериальном дереве.

Две мышиные модели с гиперхолестеринемией и быстрым развитием атеросклероза, мыши АроЕ^-/- и мыши-нокауты по рецептору липопротеинов низкой плотности (LDLR^-/-), оказались полезными в изучении атеросклероза, поскольку в них воспроизводится клеточный состав участков повреждений у человека, в частности - по содержанию Т-лимфоцитов. Рекрутинг лимфоцитов увеличен в артериях мышей АроЕ^-/-, склонных к атеросклерозу, даже до начала патологии.

Присутствие Т-лимфоцитов имеет функциональные последствия, так же, как и их полное отсутствие сокращает формирование повреждений при умеренной гиперхолестеринемии. Хелперные клетки CD4+1 типа, секретирующие IFN-γ (Th1), являются преобладающим типом Т-клеток, обнаруживаемых в бляшках, и эти Т-клетки оказывают проатерогенное действие и дестабилизацию бляшек.

В настоящее время авторами данного изобретения обнаружено, что Anx-A1 экспрессируется и в человеческих, и в мышиных атеросклеротических бляшках, и что в мышиной модели существует корреляция между экспрессией Anx-A1 и МС.

В другом варианте реализации в качестве заболевания, опосредованного Т-клетками, выступает системная красная волчанка (СКВ). Авторами данного изобретения в настоящее время обнаружено, что мРНК и белок Anx-A1 экспрессируются в Т-клетках больных СКВ на более высоком уровне, чем в Т-клетках от здоровых добровольцев.

Настоящее изобретение можно также применять в связи со способностью Anx-A1 стимулировать дифференцировку клеток Th1, например, для ограничения неконтролируемых защитных клеточных (Th1) ответов, направленных против внутриклеточных патогенов и для лечения внеклеточных инфекций (ответ Th2) за счет подавления дифференцировки Th1 и стимуляции дифференцировки Th2.

Специфично связывающуюся молекулу, которая связывается с Anx-A1, для применения обычно смешивают с фармакологически подходящим носителем, эксципиентом, вспомогательным веществом, адъювантом и/или разбавителем. Настоящее изобретение таким образом включает фармакологический препарат, содержащий специфично связывающуюся молекулу, которая связывается с Аннексином-1 (Anx-A1), для применения при лечении заболевания, опосредованного Т-клетками. Фармакологический препарат включает специфично связывающуюся молекулу, которая связывается с Аннексином-1 (Anx-A1) и подходящий по фармакологическим параметрам носитель, эксципиент, несущую основу, адъювант и/или разбавитель. Такие составы могут быть приготовлены с помощью способов, известных в области фармакологии, например, за счет смешивания активного ингредиента с носителем, эксципиентом, вспомогательным веществом, адъювантом и/или разбавителем в стерильных условиях.

Подходящие носители, вспомогательные вещества, адъюванты и/или разбавители широко известны в данной области техники и включают минеральные соли, минеральные соли с фосфатным буфером (ФСБ), карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ), декстрозу, липосомы, поливиниловый спирт, фармакологически чистый крахмал, маннитол, лактозу, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу (и другие сахара), карбонат магния, желатин, масло, спирт, детергенты, эмульгаторы или воду (предпочтительно стерильную). Специфично связывающаяся молекула, которая связывается с Anx-A1, может находиться в составе жидкого препарата, который в целом будет состоять из суспензии или раствора специфично связывающейся молекулы, которая связывается с Anx-A1 в подходящем водном или неводном жидком носителе, например, в воде, этаноле, глицерине, полиэтиленгликоле (ПЭГ) или масле.

Обычно, если специфично связывающаяся молекула, которая связывается с Anx-A1 представляет собой антитело, это антитело ПЭГилировано, т.е. ковалентно присоединено к полиэтиленгликолю. Обычно это уменьшает иммуногенность и увеличивает период полужизни указанного антитела.

Специфично связывающаяся молекула, которая связывается с Anx-A1, может быть назначена отдельно или вместе с другим агентом.

Специфично связывающаяся молекула, которая связывается с Anx-A, предназначенная для применения в данном изобретении, обычно вводят объекту в терапевтически эффективном количестве. Терапевтически эффективное количество - это количество, эффективное для улучшения состояния, устранения или предотвращения одного или более симптома заболевания, опосредованн