Композиция для лечения инфекции вирусом гепатита в

Композиция для лечения инфекции вирусом гепатита в

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к иммуногенным композициям с компонентом(компонентами) вируса гепатита В (HBV), которые могут быть основаны на нуклеиновой кислоте или полипептиде. Указанные иммуногенные композиции могут быть использованы для стимуляции или повышения иммунного ответа на HBV с целью обеспечения защитного или терапевтического эффекта против HBV-инфекции и любого состояния или заболевания, вызванного или связанного с инфекцией HBV. Данное изобретение также относится к экспрессионному вектору для экспрессии такого HBV-компонента(ов) и его терапевтического или профилактического применения. Изобретение представляет особый интерес в области иммунотерапии и, в частности, для лечения пациентов, инфицированных HBV, особенно хронически инфицированных.

Уровень техники

Гепатит В является одной из основных проблем общественного здравоохранения с более чем 350 миллионами хронически инфицированных людей во всем мире, при этом от 20 до 40% имеют риск развития хронического заболевания печени, цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Несмотря на наличие эффективных профилактических вакцин, инфекция вирусом гепатита В (HBV) по-прежнему процветает в многих странах, даже в развитых, с оценкой 4,5 миллионов новых случаев заражения в год по всему миру. В отличие от рекомендации ВОЗ, по которой должна осуществляться всеобщая вакцинация, охват полным курсом профилактической вакцинации колеблется от 25% в Азии до 75-90% в Европе. В настоящее время гепатит В является десятой по счету причиной смертности (примерно 1 миллион смертей/год) и HBV-связанной карциномы печени, пятым среди наиболее распространенных раков. Географическое распространение HBV-инфекции неравномерно с распространенностью менее 1% в западных странах и более 10% в юго-восточных странах, большей части Африки и Экваториальной Южной Америки. В областях с высокой распространенностью хронических носителей HBV вертикальная передача от инфицированной матери новорожденному является наиболее частым способом заражения и почти всегда приводит к хроническому гепатиту (90% случаев). Этот показатель может быть снижен до 15% путем профилактической вакцинации инфицированных детей сразу после рождения. В западных странах заражение происходит чаще всего во взрослом возрасте путем горизонтальной передачи через жидкости организма, например через кровь, сперму, слюну, что приводит к острой и самостоятельно восстанавливающейся инфекции у 85% пациентов, но, тем не менее, к хронической инфекции в 15% случаев.

Вирус гепатита В (HBV) является членом Hepadnaviridae и в первую очередь поражает печень, реплицируясь в гепатоцитах. Инфекционные частицы являются так называемыми частицами Дейна размером 42-45 нм, которые состоят из внешней липопротеиновой оболочки, которая содержит три различных поверхностных белка (HBs), и внутреннего нуклеокапсида, основным структурным белком которого является сердцевинный белок (HBcAg). В нуклеокапсиде имеется одна копия генома HBV, связанная с вирусным полимеразным белком (Р). В дополнение к вирионам размером 42-45 нм кровь HBV-инфицированных пациентов содержит сферы размером 20 нм из HBsAg и липидов хозяина, которые выделяются из инфицированных клеток. Эти сферы численно превосходят вирионы с коэффициентом 10⁴-10⁶.

HBV-геном является релаксированной (открытой) кольцевой, частично двухцепочечной ДНК примерно с 3200 нуклеотидов, состоящей из минус-нити полной длины и более короткой плюс-нити. Он содержит четыре перекрывающиеся открытые рамки считывания (ORF), С, S, Р и X. ORF С кодирует сердцевинный белок (или HBcAg), белок длиной 183 аминокислоты, который составляет нуклеокапсид HBV, и второй белок, содержащийся в сыворотке крови больных во время репликации вируса, известный как HBcAg, который содержит М-концевое удлинение в области precore и часть HBcAg. С-конец сердцевинного белка очень прост и состоит из четырех Arg-богатых областей, которые, по прогнозам, связываются с нуклеиновыми кислотами, а также многочисленных сайтов фосфорилирования (состояние фосфорилирования сердцевины связано с конформационными изменениями в капсидной частице, как описано в Yu and Sommers, 1994, J. Virol. 68:29650. ORF S кодирует три поверхностных белка, которые имеют одинаковый С-конец, но различаются по N-концу в -связи с наличием трех старт-кодонов ATG в рамке считывания, которые разделяют ORF S на три области, S (226 аминокислот), preS2 (55 аминокислот) и preS1 (108 аминокислот), соответственно. Большой антигенный белок поверхности (L) продуцируется после инициации трансляции на первом старт-кодоне ATG и включает 389 аминокислотных остатков (preS1-preS2-S). Средний антигенный белок поверхности (М) получается при трансляции области S и области pre-S2 со второго старт-кодона ATG, в то время как малый антигенный белок поверхности из 226 аминокислот (S, также обозначаемый как HBsAg) получается при трансляции области S с третьего старт-кодона ATG. Поверхностные белки HBV являются гликопротеинами с углеводными боковыми цепями (гликанами), которые присоединяются путем N-гликозидных связей. ORF Р кодирует вирусную полимеразу, а ORF Х содержит белок, известный как белок X, который считается активатором транскрипции.

После входа вирионов в гепатоциты через неизвестные пока рецепторы нуклеокапсиды переносят геномную ДНК HBV в ядро, где релаксированная кольцевая ДНК превращается в ковалентно замкнутую кольцевую ДНК (кзкДНК, cccDNA). кзкДНК функционирует в качестве матрицы для транскрипции четырех вирусных РНК, которые переносятся в цитоплазму и используются как мРНК для трансляции HBV-белков. Самая длинная (прегеномная) РНК также функционирует как матрица для репликации HBV, которая происходит в нуклеокапсидах в цитоплазме. Некоторые из ДНК HBV и содержащие полимеразу капсиды затем переносятся в ядро, где они высвобождают вновь образованную релаксированную кольцевую ДНК для формирования дополнительной кзкДНК. Со временем полужизни больше, чем у гепатоцитов, кзкDNA отвечает за сохранение HBV. Другие капсиды окружаются оболочкой путем почкования в эндоплазматический ретикулум и секретируются после прохождения через комплекс Гольджи.

Большое число докпинических и клинических исследований подчеркивают важность CD4+ и CD8+ Т-клеточных иммунных реакций для эффективного противовирусного ответа (Ferrari et al., 1990, J ImmuL 145:3442; Penna et al., 1996, J Clin Invest, 98:1185; Penna et al., 1997, Hepatology, 25:1022). Т.е. у пациентов, естественным образом поправившихся после гепатита В, установлены полиспецифичные и замедленные ответы, опосредованные Т-хелперами (T_H) и цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), которые легко обнаруживаются в периферической крови. При распознавании вирусных пептидов CTL приобретают способность или вылечить HBV-инфицированные клетки через нецитопатическое цитокин-опосредованное ингибирование репликации HBV и/или убить их через пути, опосредованные перфорин-Fas-лигандом и ФНОα. И эффекторные функции, наблюдаемые при разрешении острого гепатита В, и этот ответ Т-клеток 1 типа (Th1) сохраняюся и после клинического восстановления. Оно часто совпадает с повышением уровней сывороточной аланинаминотрансферазы (АЛТ) и с появлением HBcAg-специфических IgM и IgG. Антитела анти-НВе и анти-HBs появляются позже и указывают на благоприятный исход инфекции. HBsAg-специфические антитела являются нейтрализующими, опосредуют иммунитет и сохраняются после клинического выздоровления на всю жизнь. Тем не менее, хроническая HBV-инфекция редко разрешается иммунной системой. Когда это происходит, вирусный клиренс связан с повышенной активностью CTL и повышенными уровнями АЛТ, вызванными разрушением инфицированных гепатоцитов иммунной системой. Тем не менее, подавляющее большинство хронически инфицированных пациентов демонстрируют слабый и временный CD4+ и CD8+ Т-клеточный иммунный ответ, который-антигенно ограничен и неэффективен в плане выведения вирусной инфекции, хотя отдельные HBV-специфичные Т-клеточные клоны были выделены из биоптата печени. Причина этого изменения эффекторных функций клеточного иммунного ответа при хроническом гепатите В в настоящее время не известна. Тем не менее, было показано, что функциональные Т-клеточные ответы могут быть частично восстановлены у некоторых пациентов при вирусной нагрузке ниже порога в 10⁶ МЕ/мл (Webster et al., 2004, J. Virol. 78:5707). Эти данные явно обнадеживают и подчеркивают необходимость иммуномодуляторных стратегий, способных индуцировать эффективный Т-клеточный ответ.

В идеале, лечение хронического вирусного гепатита В прежде всего должно позволить ингибировать репликацию HBV до необратимого повреждения печени, таким образом, чтобы избавиться от вируса, предотвратить прогрессирование заболевания в цирроз или рак печени и улучшить выживаемость пациентов. Стандартное лечение хронического гепатита В включает пегилированный интерферон-альфа (IFNα) и нуклеозидные/нуклеотидные аналоги (NUC), такие как ламивудин, а в последнее время энтекавир, телбивудин, адефовир и тенофовир (EASL Clinical Practice Guidelines: management of chronic hepatitis B, 2009). IFNα является мощной противовирусной молекулой, приводящей к ингибированию репликации вируса, которая, тем не менее, вызывает серьезные побочные эффекты у 25-30% пациентов. NUC выступают в качестве конкурентных ингибиторов полимеразы HBV, направленных на подавление обратной транскрипции прегеномной РНК в минус-нить ДНК, а затем в двухцепочечную вирусную ДНК. Они ограничивают формирование новых вирионов, но неэффективны в устранении суперскрученной кзкДНК, скрытой в ядрах инфицированных гепатоцитов, которая является источником новых потомств вируса. Этим можно объяснить, почему эффективность NUC носит временный характер, и вирусная нагрузка возникает сразу после прекращения лечения, требуя оставлять пациентов на пожизненном лечении. Кроме того, долгосрочная эффективность также ограничена в связи с появлением устойчивых мутантов HBV (более 24% после одного года и примерно 66% после четырех лет лечения ламивудином, как описано в Leung et al., 2001, Hepatology 33:1527), хотя новые NUC (энтекавир, телбивудин и тенофовир) демонстрируют гораздо меньше случаев лекарственно-устойчивых мутантов HBV при увеличении подавления ДНК HBV. Тем не менее, данные по длительному лечению этими новыми лекарствами ограничены, и эта более высокая эффективность не коррелирует с существенно более высоким уровнем HBs-сероконверсии.

Помимо противовирусной терапии в настоящее время прикладываются усилия по разработке дополнительной терапии, направленной на улучшение иммунного ответа хозяина, особенно того, который опосредован цитотоксическими Т-лимфоцитами и хелперными Т-лимфоцитами. Подавляющее большинство существующих подходов иммунотерапии сосредоточено на применении поверхностного белка(белков) HBV, S, рге81 и/или preS2 (Smith et al., 1983, Nature 302:490; Luoeck et al., 1989, Proc. NatI Acad, Sci. USA 86:б7б3; Adkins et al., 1998, BioDrugs 10:137; Loirat et al., 2000, J. Immunol. 165:4748; Funuy-Ren et al. 2003, J. Med. Viral. 71:376; Kasaks et al., 2004, J. Gen, Viral. 85:2665; Xiangming Li et al., 2005, Intern. Irnrnunol. 17:1293; Mancini-Bourguine et al., 2006, Vaccine 24:4482; Vandepapeliere et al., 2007, Vaccine 25:8585). Обнадеживающие результаты были получены по меньшей мере по отношению к стимуляции иммунных ответов. Например, Mancini-Bourguine et al. (2006, Vaccine24:4482) сообщили об индукции и/или возвращении Т-клеточного ответа у хронически HBV-инфицированных пациентов, которым вводили ДНК-вакцину, кодирующую preS2-S, что является хорошим признаком того, что иммунная система все еще действует у этих пациентов.

HBcAg также используется как иммуноген (Yi-Ping Xing et al., 2005, World J, Gastro, 11:4583), также как и химерные HBcAg-капсиды, несущие чужеродные эпитопы на своей поверхности (WO 92/11368; WOOO/32625; Koletzki et al., 1997, J. Gen, Virol. 78:2049). Наиболее перспективной локализацией для вставки эпитопов с точки зрения иммуногенности, по-видимому, является место внешней петли, которое, по прогнозам, находится на поверхности HBcAg вблизи позиции 80 (Argos et al, 1988, 10 EMBO J. 7:819). Schodel et al. (1992, J. Virol. 66:106) и Borisova et al. (1993, J. Virol, 67:3696) смогли вставить эпитопы preSI и HBsAg в эту область и сообщили об успешной иммунизации химерными частицами.

Также были исследованы претенденты на многовалентные вакцины, нацеленные одновременно на несколько HBV-антигенов. Примечательно, было показано, что полиэпитопная ДНК-вакцина, кодирующая гибридный полипептид множества эпитопов цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и хелперных Т-лимфоцитов (HTL), присутствующих в оболочечном, сердцевинном и полимеразном белках, вызывает многочисленные CTL- и HTL-ответы на доклинических мышиных моделях (Depla et al, 2008, J. Virol. 82:435). Некоторые вакцинные составы на основе смеси ДНК-плазмид, кодирующих HBsAg, HBcAg и HBV-полимеразу, были разработаны (WO 2005/056051; WO 2008/020656) и показали специфический анти-HBV клеточный и гуморальный ответ на трансгенной мышиной модели хронического гепатита В (Спае Young Kirn et al., 2008, Exp.Mol. Medicine 40:669). Фаза I клинических испытаний была начата в Южной Корее на носителях HBV в комбинации с лечением ламивудином (Yang et al., 2006, Gene Ther. 13:1110).

Соответственно, все еще существует необходимость в альтернативных иммунотерапевтических подходах для индукции иммунного ответа более мощным и эффективным образом, особенно клеточно-опосредованного иммунного ответа, у лиц, нуждающихся в этом, например у пациентов, хронически инфицированных HBV. Кроме того, существует необходимость обеспечения композицией на основе вектора, способного экспрессировать HBV-антиген стабильным и устойчивым образом.

Эта техническая задача решается путем предоставления воплощений, определенных в формуле изобретения.

Другие и дополнительные аспекты, особенности и преимущества данного изобретения станут понятны из последующего описания предпочтительных воплощений изобретения. Эти воплощения приведены для раскрытия изобретения.

Сущность изобретения

Соответственно, в первом аспекте данное изобретение предусматривает иммуногенную композицию, включающую по меньшей мере один полипептид или нуклеиновокислотную молекулу, кодирующую указанный по меньшей мере один полипептид, где указанный по меньшей мере один полипептид выбран из группы, состоящей из:

(i) полимеразной части, включающей по меньшей мере 450 аминокислотных остатков полимеразного белка, полученного из первого вируса HBV;

(ii) сердцевинной части, включающей по меньшей мере 100 аминокислотных остатков сердцевинного белка, полученного из второго вируса HBV; и

(iii) оболочечной части, включающей один или более иммуногенный домен от 15 до 100 последовательных аминокислотных остатков белка HBsAg, полученного из третьего вируса HBV; или

любой комбинации указанных полимеразной части, сердцевинной части, оболочечной части, указанной нуклеиновокислотной молекулы, кодирующей указанную полимеразную часть, указанной нуклеиновокислотной молекулы, кодирующей указанную сердцевинную часть, и/или указанной нуклеиновокислотной молекулы, кодирующей указанную оболочечную часть.

Определения

Используемые в данное заявке термины в единственном числе применяются в значении «по меньшей мере один», «по меньшей мере первый», «один или более» или «множество» упоминаемых соединений или этапов, если контекст ясно не указывает иное. Например, термин «клетка» включает множество клеток, содержащихся в их смеси.

Термин «и/или», используемый в данном документе, включает значение «и», «или» или «все или любые комбинации элементов, связанных с указанным термином».

Термины «примерно» или «приблизительно», используемые в данном документе, означают в пределах 10%, предпочтительно в пределах 8% и более предпочтительно в пределах 5% данного значения.

Используемые в данной заявке для обозначения продуктов, композиций и способов термины «содержащий» (и его любые формы, в т.ч. «содержит» или «содержат»), «имеющий» (и его любые формы, в т.ч. «имеет» или «имеют»), «включающий» (и его любые формы, в т.ч. «включает» и «включают») или «состоящий из» (и его любые формы, в т.ч. «состоит из» или «состоят из») не являются ограничивающими и не исключают дополнительные, не упоминаемые элементы или этапы способа. Выражение «содержащий по существу» будет означать исключение других компонентов или этапов любого существенного значения. Таким образом, композиция, состоящая преимущественно из упоминаемых компонентов, не будет исключать следы контаминантов и фармацевтически приемлемых носителей. Выражение «состоящий из» будет означать исключение более чем следовых элементов других компонентов или этапов. Например, полипептид «состоит из» аминокислотной последовательности, когда полипептид не содержит никаких аминокислот не упоминаемой аминокислотной последовательности. Полипептид «состоит по существу» из аминокислотной последовательности, когда такая аминокислотная последовательность присутствует в конечном итоге только с несколькими дополнительными аминокислотными остатками. Полипептид «содержит» аминокислотную последовательность, когда аминокислотная последовательность является по меньшей мере частью конечной аминокислотной последовательности полипептида. Такой полипептид может иметь от нескольких до нескольких сотен дополнительных аминокислотных остатков.

Термины «аминокислоты», «остатки» и «аминокислотные остатки» являются синонимами и охватывают природные аминокислоты, а также аналоги аминокислот (например, неприродные, синтетические и модифицированные аминокислоты, в том числе D- или L-оптические изомеры).

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислотных остатков, которые состоят из девяти или более аминокислот, связанных посредством пептидных связей. Полимер может быть линейным, разветвленным или циклическим, может включать природные аминокислоты и/или аминокислотные аналоги и может быть прерван не аминокислотами. В качестве общего указания, если аминокислотный полимер длинный (например, более 50 аминокислотных остатков), то предпочтительно его называть полипептидом или белком, а если его длина 50 аминокислот или меньше, он называется «пептидом».

В контексте данного изобретения термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновокислотная молекула», «полинуклеотид» и «нуклеотидная последовательность» используются как синонимы и обозначают полимер любой длины или полидезоксирибонуклеотидной (ДНК) (например, кДНК, геномной ДНК, плазмид, векторов, вирусных геномов, выделенных ДНК, зондов, праймеров и любой их смеси) или полирибонуклеотидной (РНК) молекул (например, мРНК антисмысловой РНК) или смешанной полирибо-полидезоксирибонуклеотидной молекулы. Они охватывают одно- или двухцепочечные, линейные или кольцевые, природные или синтетические полинуклеотиды. Кроме того, полинуклеотид может содержать неприродные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги (см. US 5525711, US 4711955 или ЕРА 302175 в качестве примеров модификаций), и может быть прерван ненуклеотидными компонентами. При наличии изменений в нуклеотиде они могут быть сделаны до или после полимеризации.

Используемый в данном документе термин «иммуногенная композиция» относится к составу, который содержит 1, 2, 3, 4 или более компонентов, описанных далее (например, полимеразную часть, сердцевинную часть, оболочечную часть, нуклеиновокислотную молекулу, кодирующую полимеразную часть, нуклеиновокислотную молекулу, кодирующую сердцевинную часть, и/или нуклеиновокислотную молекулу, кодирующую оболочечную часть), и, возможно, другие компоненты (например, адъювант, носитель, разбавитель и т.д.). Иммуногенная композиция данного изобретения, как правило, находится в форме, которая может быть введена в организм хозяина и индуцирует защитный или терапевтический иммунный ответ, достаточный, чтобы индуцировать или стимулировать анти-HBV-иммунитет, давая терапевтические преимущества, такие как профилактика HBV-инфекции, сокращение и/или улучшение по меньшей мере одного состояния, вызванного или связанного с HBV-инфекцией (например, снижение вирусной нагрузки, уменьшение или отдаление риска поражения печени, такого как цирроз или рак печени, улучшение качества жизни и т.д.), и/или уменьшение сывороточных уровней HBcAg, HBsAg или обоих, и/или индукция сероконверсии HBe, сероконверсии HBs или обеих, и/или повышение эффективности других подходов к лечению и профилактике HBV. После введения в организм хозяина иммуногенная композиция данного изобретения может вызвать иммунный ответ, в том числе, но не ограничиваясь этим, продукцию антител и/или цитокинов и/или активацию цитотоксических Т-клеток, В-, Т-лимфоцитов, антиген-представляющих клеток, хелперных Т-клеток, дендритных клеток, NK-клеток, что приводит к развитию врожденного иммунного ответа и/или специфического гуморального и/или клеточного иммунного ответа по меньшей мере против одного антигена/эпитопа HBV.

Понятие «иммуногенный домен» относится к структурной части белка HBV, которая может быть связана антителом или Т-клеточным рецептором. Как правило, такой иммуногенный домен содержит один или более В- и/или Т-эпитоп(ы), в частности. CTL или T_H или оба эпитопа участвуют в распознавании конкретным антителом, или, в контексте МНС (главный комплекс гистосовместимости), Т-клеточным рецептором. Понятие «эпитоп» соответствует минимальному пептидному мотиву (как правило, набору из 9-11 аминокислотных остатков), которые вместе образуют сайт, распознаваемый антителом, Т-клеточным рецептором или HLA-молекулой. Такие остатки могут быть последовательными (линейный эпитоп) или непоследовательными (конформационный эпитоп, который включает остатки, не расположенные в непосредственной близости друг к другу). Распознавание Т-клеточного эпитопа Т-клеткой, как правило, происходит через механизм, в котором Т-клетки распознают пептидные фрагменты антигенов, которые связаны с молекулами МНС 1 класса или II класса, экспрессированными на антиген-представляющих клетках.

Используемые в данном документе понятия «HBV» и «вирус гепатита В» являются взаимозаменяемыми и относятся к любому члену семейства Hepadnaviridae (см., например, Ganem and Schneider in Hepadnaviridae (2001) "The viruses and their replication" (pp2923-2969), Knipe DM et al., eds. Fields Virology, 4th ed. 5 Philadelphia, Lippineott Williams & Wilkins, или последующие издания). Обширные филогенетические анализы привели к классификации вирусов гепатита В на 8 основных генотипов (от А до Н), которые демонстрируют расхождения в последовательности по меньшей мере 8%. Различные генотипы HBV демонстрируют различное географическое распределение и могут отображать симптомы и/или клинические результаты гетерогенных заболеваний. Разнообразные HBV были классифицированы на девять различных подтипов (ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+ и adqr-) в связи с HBsAg-связанной серологией (см. обзор Marrsum-AI Mahtab et. al., 2008, Hepatobiliary Panerease Dis Int 5:457; Schaeffer, 2007, World Gastroenterol. 7:14; Norder et al., 1993, J. Gen Virol.74:1341). Каждый генотип и серотип охватывает различные штаммы и изоляты HBV. Изолят соответствует конкретному вирусу, выделенному из определенного источника HBV (например, из образца от пациента или из другого биологического резервуара HBV), в то время как штамм охватывает различные изоляты, которые очень близки друг к другу с точки зрения геномных последовательностей.

В данной области, особенно в Genbank, было описано большое число HBV, подходящих для применения в контексте данного изобретения. Типичные HBV генотипа А включают, но не ограничиваясь ими, изолят HB-J1444AF и штамм НВ-JI444A (регистрационный номер АР 007263). Типичные HBV генотипа В включают, но не ограничиваясь ими, клон pJDW233 (регистрационный номер D00329), изолят HBV/14611 (регистрационный номер AF 121243), HBV-B1, выявленный в 2001 году Нои et al. (регистрационный номер GenBank AF282917.1), штамм HBV Whutj-37 (регистрационный номер GenBank AY 2933309.1), выявленный Zhang et al. (2005, Arch. Virol. 150, 721-741), китайский штамм HBV GDH1, выявленный Не et al. (регистрационный номер GenBank AY 766463.1), и изолят HBV 57-1 подтипа adw, выявленный Jiang et al. (регистрационный номер GenBank AYS 18556.1). Типичные HBV генотипа С включают, но не ограничиваясь ими, изолят AH-1-ON980424 (регистрационный номер АВ 113879), штамм НСС-3-ТТ (регистрационный номер АВ 113877), изолят HBV SWT3.3, выявленный Fang et al. (регистрационный номер GenBank EU 916241.1), изолят HBV H85, выявленный Zhu et al. (регистрационный номер GenBank AY 306136.1), штамм HBV C1248, выявленный Tu et al. (регистрационный номер GenBank DQ 975272.1), изолят HBV CHN-H155 (регистрационный номер GenBank DQ 478901.1), выявленный Wang et al. (2007, j. Viral Hepat 14, 426-434) и изолят HBV GZ28-1, выявленный Zhou et al. (регистрационный номер GenBank EF 688062). Типичные HBV генотипа D включают, но не ограничиваясь ими, изолят КАМСНАТКА27 (регистрационный номер АВ 188243), ALTAY36 (регистрационный номер АВ 188245) и Y07587, описанный Stoll-Becker et al. (1997, J. ViroL 71:5399) и доступный в Genbank под регистрационным номером Y07587, а также изолят HBV, описанный под регистрационным номером АВ 267090. Типичные HBV генотипа Е включают, но не ограничиваясь ими, изолят HB-JI411F и штамм HB-JI411 (регистрационный номер АР 007262). Типичные HBV генотипа F включают, но не ограничиваясь ими, изоляты HBV-BL597 (регистрационный номер АВ 214516) и HBV-BL592 (регистрационный номер АВ 166850). Типичные HBV генотипа G включают, но не ограничиваясь ими, изолят HB-JI444GF и штамм HB-J1444G (регистрационный номер АР 007264). Типичные HBV генотипа Н включают, но не ограничиваясь ими, изолят HBV ST0404 (регистрационный номер АВ 298362) и изолят HB-JI260F и штамм HB-JI260 (регистрационный номер АР 007261). Тем не менее, данное изобретение не ограничивается этими типичными HBV. Действительно, нуклеотидные и аминокислотные последовательности могут варьировать в различных изолятах и генотипах HBV, и эта природная генетическая изменчивость входит в рамки изобретения, как и неприродные модификации, такие как описаны ниже.

Используемое в данном документе понятие «нативный белок HBV» относится к белку, полипептиду или пептиду (например, полимеразному белку, сердцевинному белку или HBsAg, и т.д.), которые можно найти, выделить, получить из источника HBV в природе, в отличие от искусственно модифицированных или измененных человеком в лабораторных условиях. Таким образом, этот термин будет включать природные белки, полипептиды или пептиды HBV, если не указано иное. Такими природными источниками являются биологические образцы (например, крови, плазмы, сыворотки крови, спермы, слюны, срезов тканей, биопсии и т.д.), взятые у субъекта, инфицированного или подвергшегося воздействию HBV, культивируемые клетки (например, HepG2.2.15, HuH6-C15 (Sureau et al., 1986, Cell 47:37; Sells et al., 1987, Proc. Nail. Acad. Sci. 84(4): 1005); HuH7.TA61 или HuH7.TA62 (Sun et al., 2006, J Hepatol. 45(5):636), культуры тканей, а также рекомбинантные материалы. Рекомбинантные материалы включают, но не ограничиваясь ими, изоляты HBV (например, имеющиеся в депозитных учреждениях), геном HBV, библиотеки геномной РНК или кДНК, плазмиды, содержащие геном HBV или его фрагмент(ы), или любой вектор, используемый в данной области для включения таких элементов.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие различные белки HBV, можно найти в специализированных банках данных (например, упомянутых выше) и в литературе (см. например, Valenzuela et al., 1980, The nucleotide sequence of the hepatitis В viral genome and the identification of the major viral genes (pp57~7G) в "Animal Vims Genetics"; eds B. Fields, et al.; Academic Press Inc., New-York and Vaudin et al., 1988, J. Gen, ViroL 69:1383). Типичные примеры природных полимеразного, сердцевинного и HBsAg-полипептидов приведены в SEQ ID №1-3, соответственно (SEQ ID №1 предусматривает аминокислотную последовательность нативного полимеразного белка изолята HBV Y07587, SEQ ID №2 предусматривает аминокислотную последовательность нативного сердцевинного белка изолята HBV Y07587, a SEQ ID №3 предусматривает аминокислотную последовательность нативного оболочечного белка (HBsAg) изолята HBV Y07587). Нуклеотидные последовательности, кодирующие нативный полимеразный, сердцевинный и HBsAg из HBV Y07587, показаны с иллюстративной целью в SEQ ID №4, 5 и 6, соответственно. Тем не менее, как уже говорилось выше, HBV-белки не ограничиваются этими типичными последовательностями, и генетические вариации входят в рамки изобретения.

Используемый в данном документе термин «часть» (например полимеразная, сердцевинная и/или оболочечная части) относится к белку, полипептиду или пептиду, который получен из нативного белка, полипептида или пептида HBV после того, как он был искусственно модифицирован или изменен человеком в лаборатории, как описано в данном документе. Термин «модифицированный» включает удаление, замену или добавление одного или более нуклеотидного/аминокислотного остатка(ов), любую комбинацию этих возможностей (например, дегенерацию нативной нуклеотидной последовательности для уменьшения гомологии между последовательностями HBV, кодируемыми композицией изобретения, введение соответствующих сайтов рестрикции), а также неприродные механизмы (например, слияние двух или более белков, полипептидов и пептидов HBV или части/частей). Когда предусмотрено несколько модификаций, они могут касаться последовательных остатков и/или непоследовательных остатков. Модификация (модификации) может быть получена разными способами, известными специалистам в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез (например, с помощью системы мутагенеза in vitro Sculptor™ от Amersharn, Лес-Улис, Франция), ПЦР-мутагенез, перемешивание ДНК и синтетические химические методики (например, дающие синтетические нуклеиновокислотные молекулы). Модификация(и), предусмотренная данным изобретением, включает молчащие модификации, которые не изменяют аминокислотную последовательность закодированных полипептидов HBV, а также модификации, которые будут транслироваться в закодированный полипептид, образуя модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с соответствующей нативной. Термин «образует» (или образующий») используется для определения первоначального источника молекулы, но не предназначен для ограничения способа, посредством которого делают молекулу, который может быть, например, химическим синтезом или рекомбинантным средством.

Предпочтительно каждая из частей HBV, используемых в данном изобретении, сохраняет высокую степень идентичности аминокислотной последовательности с соответствующим нативным белком HBV, с белком полной длины или с его частью (частями). Процент идентичности двух полипептидов зависит от числа одинаковых позиций, общих для последовательностей, с учетом ряда пробелов, которые должны быть введены для оптимального выравнивания, и длины каждого пробела. Для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей в данной области доступны различные компьютерные программы и математические алгоритмы, такие как, например, программа Blast (например, Altschul et al., 1997, Nucleic Acid Res. 25:3389; Altschul et al., 2005, FEES J, 5 272:5101), доступная в NCBI. То же самое может быть применено для нуклеотидных последовательностей. Программы для определения гомологии нуклеотидных последовательностей также доступны в специализированной базе данных (Genbank или Wisconsin Sequence Analysis Package), например программы BESTFIT, FASTA и GAP.

Например, в дополнение к модификациям, описанным ниже (например, сниженной ферментативной активности и т.д.), любая или все части HBV, содержащиеся или кодирующиеся композицией изобретения, могут быть модифицированы таким образом, чтобы представлять конкретный генотип, и, следовательно, включают аминокислотную последовательность, соответствующую консенсусной или неконсенсусной последовательности, которая обычно определяется после выравнивания последовательностей различных полипептидов HBV определенного генотипа.

Термин «комбинация», используемый в данном документе, относится к любой комбинации по меньшей мере двух компонентов, содержащихся или кодирующихся иммуногенной композицией изобретения и любой возможной компоновкой различных компонентов с определенным предпочтением 2 или 3 из указанных компонентов. Он охватывает смесь двух или более полипептидов, смесь двух или более нуклеиновокислотных молекул/векторов, смесь одного или более полипептида(ов) и одной или более нуклеиновокислотной молекулы/вектора, а также слияние двух или более нуклеиновокислотных молекул, так чтобы получить единую полипептидную цепь, несущую две или более части HBV (например, неприродная компоновка).

В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция изобретения содержит комбинацию по меньшей мере двух из указанных полимеразной части, сердцевинной части, оболочечной части или по меньшей мере двух из указанных нуклеиновокислотной молекулы, кодирующей указанную полимеразную часть, нуклеиновокислотной молекулы, кодирующей указанную сердцевинную часть, и/или нуклеиновокислотной молекулы, кодирующей указанную оболочечную часть. Особенно предпочтительная композиция изобретения выбрана из группы, состоящей из (i) композиции, содержащей комбинацию полимеразной части и сердцевинной части, определенных в данном документе, или комбинацию нуклеиновокислотных молекул, кодирующих указанную полимеразную часть и указанную сердцевинную часть; (ii) композиции, содержащей комбинацию сердцевинной части и оболочечной части, определенных в данном документе, или комбинацию нуклеиновокислотных молекул, кодирующих указанную сердцевинную часть и указанную оболочечную часть; (iii) композиции, содержащей комбинацию полимеразной части, сердцевинной части и оболочечной части, определенных в данном документе, или комбинацию нуклеиновокислотных молекул, кодирующих указанную полимеразную часть, указанную сердцевинную часть и указанную оболочечную часть.

Термины «слияние» или «гибридный белок», используемые в данном документе, относятся к комбинации друг с другом по меньшей мере двух полипептидов (или их фрагментов) в одну полипептидную цепь. Предпочтительно слияние различных полипептидов осуществляется с помощью генетических средств, т.е. путем слияния в рамке считывания нуклеотидных последовательностей, кодирующих каждый из указанных полипептидов. Под выражением «слиты в рамке считывания» подразумевается, что экспрессия слитых кодирующих последовательностей дает один белок без какого-либо терминатора трансляции между каждым из слитых полипептидов. Слияние может быть прямым (т.е. без каких-либо дополнительных аминокислотных остатков между ними), либо через линкер. Наличие линкера может способствовать правильному формированию, сворачиванию и/или функционированию гибридного белка. Данное изобретение не ограничивается формой, размером или количеством используемых линкерных последовательностей, и на стыке между слитыми полипептидами может быть вставлено множество копий линкерной последовательности. Подходящие линкеры в соответствии с изобретением имеют от 3 до 30 аминокислот в длину и состоят из повторов аминокислотных остатков, таких как глицин, серин, треонин, аспарагин, аланин и/или пролин (см., например, Wiederrecht et al., 1988, Cell 54, 841; Aumailly et al., 1990 FEBS Lett. 262, 82; и Dekker et al., 1993, Nature 362, 852), например, линкер Ser-Gly-Ser или Gly-Ser-Gly-Ser-GIy.

Используемый в данном документе термин «гетерологичная гидрофобная последовательность» относится к пептиду гидрофобной природы (который содержит большое количество остатков гидрофобных аминокислот, таких как остатки Val, Leu, lie, Met, Phe, Tyr и Trp). Понятие «гетерологичный» относится к последовательности, чужеродной для нативного белка, полипептида или пептида HBV, из которой получают выбранную часть HBV. Это может быть пептид, чужеродный вирусу HBV (например, пептид из вируса кори или вируса бешенства), или пептид из HBV-вируса, но в позиции, в которой он обычно не встречается в вирусном геноме. Гетерологичная гидрофобная последовательность может быть слита в рамке считывания на N-конце, на С-конце или в пределах части HBV, и может играть роль, среди прочего, в переносе полипептида, облегчении продукции или очистки полипептида, удлинении периода полувыведения. Подходящие гетерологичные гидрофобные последовательности в соответствии с изобретением имеют от 15 до 100 аминокислот в длину и содержат высоко гидрофобный домен.

Термин «вектор», используемый в данном документе, относится и к экспрессионным, и к неэкспрессионным векторам, и включает вирусные, а также невирусные векторы, в том числе внехромосомные векторы (например, многокопийные плазмиды) и интегрирующие векторы, предназначенные для включения их в принимающую хромосому(ы). Особенно важными в контексте данного изобретения являются векторы для переноса нуклеиновокислотных(ой) молекул(ы) в вирусный геном (так называемые векторы для переноса), векторы для применения в иммунотерапии (т.е. которые способны доставлять нуклеиновокислотные молекулы в организм хозяина), а также экспрессионные векторы для применения в различных экспрессионных системах или в организме хозяина.

Используемый в данном документе термин «вирусный вектор» охватывает векторную ДНК, а также вирусные ч