Способ идентификации полипептидов и белков h.parasuis

Способ идентификации полипептидов и белков h.parasuis

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для определения перекрестно реагирующих молекул иммунологического действия, включающим перекрестно реагирующая антигенная детерминанта, в частности, для определения белков, включающих перекрестно реагирующая антигенная детерминанта, в частности, для определения белков, которые являются перекрестно реагирующими на основании серологических тестов, использующих последовательные иммунологические стимуляции животного, включая определение перекрестно реагирующих белков Н.parasuis. Также в изобретении предусматриваются композиции, вакцины и наборы, использующие молекулы, для диагностики и способов предупреждения или лечения заболевания, состояния или их симптомов, связанных с инфекционными агентами, в частности, инфекционными микроорганизмами, в частности, для предупреждения и лечения заболевания, нарушения, состояния или их симптомов, связанных с инфекцией, вызванной H.parasuis.

Предпосылки создания изобретения

Принцип вакцинации главным образом базируется на двух ключевых элементах иммунитета, а именно на специфичности и памяти. Для активации и дифференциации В-клеток в ответ на большинство антигенов необходимы различные сигналы, которые побуждают В-клетки к образованию либо клеток плазмы, секретирующих антитела, либо В-клеток памяти, готовых к опосредованию более быстрого ответа на вторичное воздействие антигена. Клетки памяти обеспечивают гораздо более сильный ответ иммунной системы при повторном контакте с антигенами. Этот вторичный ответ проявляется более быстро и является более эффективным по сравнению с первичным ответом. Однако из-за того, что антитела по своей природе являются высоко специфическими и ввиду разнообразия инфекционных агентов, все еще остается актуальной проблема получения антител, которые проявляют перекрестную реактивность с многочисленными различными типами патогенов.

Одним примером инфекционного агента, для которого сохраняется значительный стимул к образованию антител, которые проявляют перекрестную реактивность, является бактерией Haemophilus parasuis (H.parasuis), этиологический агент полисерозита и артрита свиней (болезни Глассера). H.parasuis является грамотрицательной, иногда инкапсулированной, неподвижной, плеоморфной бактерией, выделяемой из серозных экссудатов свиней, пораженных серозно-фибринозным плевритом, перикардитом, перитонитом, артритом и менингитом. Этот микроорганизм, который первоначально описан Glasser в 1910 году, вероятно, впервые выделен Schermer и Ehrlich в 1922 году, хотя предполагаемый организм первоначально был отнесен к Haemophilus suis. Однако в 1969 году Biberstein и White показали, что возбудитель Глассера нуждается только в никотинамидадениндинуклеотиде (НАД). Haemophilus suis, микроорганизм, нуждающийся и в железосодержащем порфирине, и в никотинамидадениндинуклеотиде (НАД), таким образом не играл коварную роль в этом заболевании, и новый организм, путем добавления приставки «para», был переименован в H.parasuis.

Характеристика Н.parasuis в значительной степени была получена за последние пять десятилетий. Bakos и др. использовали реакцию преципитации и идентифицировали четыре серовара, которые они обозначили A-D (Nordic Veterinary Medicine, 4, 1952, cc.241-255). Эти четыре серовара в 1986 году возросли до семи (J Clin Microbiol, 23, 1986, cc.1022-1025). Kielstein и др., Zentralbl Veterinarmed В, 38, 1991, cc.315-320, добавили еще шесть и, совместно с Rapp-Gabrielson, Am J Vet Res, 53, 1992, cc.659-664, еще пять других. В конечном счете, эта классификация была усовершенствована. Все серовары, включая пять с множественными обозначениями, охарактеризованы на основании реакции иммунодиффузии, выполненной со специфической сывороткой кролика. В результате появился список по меньшей мере из пятнадцати общепринятых в мире сероваров. К сожалению, существует также значительное число нетипируемых изолятов. Кроме того, в некоторых публикациях описаны серотипические профили Н.parasuis в определенных странах. Было сделано предположение, что в США, Германии, Японии, Испании, Канаде и Китае довольно распространены серотипы 4 и 5. Серотипы 5 и 13, согласно сообщениям, преобладают в Австралии и Дании.

Вирулентные факторы Н.parasuis не определены. По большей части вирулентность связывают с серотипом, поскольку некоторые серотипы соответствуют более высокой заболеваемости и смертности. Сообщалось, что при внутрибрюшинной инфекции серотипы 1, 5, 10, 12, 13 и 14 вызывают высокую заболеваемость и смертность в течение 4 суток. Поэтому, эти штаммы считаются высоковирулентными. Три серотипа (т.е., 2, 4 и 15) проявляли средние уровни вирулентности, вызывая полисерозит без летальности. Оставшиеся серотипы считаются авирулентными, поскольку у пораженных свиней не обнаруживалось клинического проявления болезни.

Делались попытки определить специфические факторы вирулентности Н.parasuis. Поскольку этот вид является членом семейства Pasteurellaceae, предполагалось, что некоторые кандидаты могли бы включать капсулы, фимбрии, липополисахариды (ЛПС) и белки наружной мембраны (БНМ). Однако в настоящее время выявлено мало корреляций между этими признаками у H.parasuis и вирулентностью. Инкапсулированные штаммы распространены в носовых полостях, как здоровых свиней, так и животных с клиническим проявлением заболевания. Важность ЛПС отчасти была развеяна сообщениями, говорящими об отсутствии значительного различия в продукции ЛПС между вирулентными и авирулентными серотипами и показывающими, что представители, содержащие и ЛПС, и БНМ стимулировали ответы только к БНМ.

Показано, что БНМ генерируют сильный гуморальный ответ, и из этой категории были предложены кандидаты в качестве защитных иммуногенов. Известны и могут быть связаны с вирулентностью два основных профиля БНМ. Большинство вирулентных серотипов характеризуются вторым профилем, в котором преобладает белок с молекулярной массой 37 кДа. Авирулентные серотипы показывают множественные полосы, с интенсивными полосами, характерными для белков с молекулярной массой между 23-40 кДА, а также для белка с молекулярной массой приблизительно 68 кДа.

Предложено несколько других белков, связанных с инфекциями Н.parasuis. Сообщалось о двух белках колонизации, обозначенных Р2 и Р5, оба из которых являются иммуногенными. Неожиданно было установлено, что Р2, по-видимому, различается в зависимости от вирулентности серотипа. В авирулентных серотипах он главным образом представлен в виде белка с молекулярной массой 55 кДа, а в вирулентных серотипах - с молекулярной массой 48 кДа. Этот белок показывает гомологию с белком Р2 Haemophilus influenzae. Также была идентифицирована и описана повышенная регуляция области TonB генома Н.parasuis. Эта область содержит несколько генов, которые реагируют на истощение железа в окружающей среде. В частности, был идентифицирован трансферрин-связывающий белок и показана его повышенная регуляция при ограничении содержания железа. Предполагалось, что при недоступности железа у хозяина такие гены могут быть важными для выживаемости патогена внутри хозяина.

Кроме того, используя поликлональное антитело, направленное против основного белка наружной мембраны (ОБНМ) с молекулярной массой 42 кДа у Pasturella multocida, обнаружен основной белок наружной мембраны с молекулярной массой 42 кДа. Анализ потенциально близкого белка (42 кДа) Haemophilus ducreyi, близкородственного вида, показал антигенный близость этого белка с OmpA. Этот класс термолабильных мембранных белков дополнительно исследован посредством разработки моноклональных антител против мембранных препаратов H.parasuis. В этом эксперименте использованы два моноклональных антитела, одно против БНМ с массой 35 кДа и второе против ЛПС. Сообщалось, что эти моноклональные антитела специфически реагируют с общими серотипами, и выдвинуто предположение об их потенциальной значимости в качестве диагностических средств или потенциальных мишеней вакцины.

Другим мощным вирулентным фактором является нейраминидаза. Более 90% полевых изолятов, по-видимому, образуют нейраминидазу. Этот фермент поздно экспрессируется в ростовой фазе Н.parasuis и коррелирует и с воздействием на рецепторы, необходимые для колонизации, и с распадом муцина внутри хозяина.

Н.parasuis может инфицировать разнообразные места в организме хозяина. В результате клинические симптомы проявляются по-разному, в зависимости от места инфекции. Четырьмя первичными формами инфекции являются болезнь Глассера (фибринозный полисерозит), септицемия (без полисерозита), острый миозит (жевательной мышцы) и респираторное заболевание. Независимо от места инфекции или типа инфекции установлено, что симптомы инфекции Н.parasuis являются до некоторой степени общими. В большинстве случаев описываются повышенная температура, апатия и потеря аппетита. Другие описанные общие симптомы включают кашель, одышку, потерю массы тела, хромоту, отсутствие координации, цианоз и истощение.

Н.parasuis стал основной угрозой после освобождения большинства популяций животных от специфических патогенов (SPF - specific-pathogen-free). Отчасти благодаря развитию свиноводства, которое подразумевает отсутствие в стадах животных специфических патогенов, патоген Н.parasuis приобрел экономическую значимость. Обычно инфекция поражает не подвергнутых какому-либо воздействию животных, содержащихся в условиях, не отвечающих требованиям гигиены, или при плохом кормлении. Кроме того, вспышкам способствовали небезопасная транспортировка и объединение свиней разного возраста. Сочетание повышенного количества животных и относительной чистоты популяции свиней в таких стадах защищенных животных согласно сообщениям привело к повышению случаев заболевания, вызываемого Н.parasuis. Кроме того, обстоятельства усложняются тем фактом, что Н.parasuis существует в нескольких, специфических для регионов, серотипах. Сообщалось, что контакт с одним серотипом или вакцинация к одному серотипу необязательно предохраняют против инфекций, вызываемых другими серотипами. С учетом этого, в качестве контроля против распространения неизвестного серотипа была предложена разработка аутогенной вакцины. Отчасти из-за таких проблем и задержки между генерированием аутогенной вакцины и воздействием на свиней возникла потребность в вакцине, обеспечивающей перекрестную защиту, которая могла бы вводиться независимо от регионального преобладания серотипа.

При развитии клинических симптомов инфекции, вызванной Н.parasuis, в качестве неотложной меры предложено лечение антибиотиками. К сожалению, в связи с инвазивной природой патогена для эффективного лечения необходимы высокие дозы антибиотиков, что часто является непомерно затратным.

Были предприняты попытки контролирования проблемы через вакцинирование с использованием обеих вакцин: коммерческой и аутогенной. Разнообразие серотипов Н.parasuis усложняло режимы вакцинации, поскольку перекрестный иммунитет встречается редко. В соединении с нетипируемыми штаммами это изобилие антигенных профилей затрудняло разработку вакцины.

Предлагалась также защита путем вакцинации против гомологичного заражения. В трех исследованиях предполагалось, что убитая бактериальная вакцина могла бы защитить против гомологичного заражения, если она создана на основе известных серотипов и нетипизированных диких изолятов. Исследования проливают свет на использование аутовакцин для контролирования вспышек, чтобы уменьшить процент смертности.

Предлагалось использование вирулентных штаммов для защиты против гетерологичного заражения другими вирулентными штаммами. В одном исследовании сообщалось, что бивалентная вакцина, содержащая серотипы 4 и 5, предохраняла против серотипов 13 и 14. Однако в других исследованиях не удалось показать перекрестную защиту между серотипами 2 и 5.

Все же, другие исследователи предложили контролируемое воздействие на поросят низкими дозами живой вирулентной бактерии Н.parasuis. Однако, отчасти из-за повреждающих сопутствующих инфекций, вызванных другими патогенами, например вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV - porcine reproductive and respiratory syndrome virus), этот подход не был рекомендован в качестве функционального метода контроля.

Поскольку эффективность доступных в настоящее время способов контроля различных болезнетворных инфекций ограничена, что отчасти происходит из-за разнообразия болезнетворных агентов, например, Н.parasuis, необходимы эффективные способы и композиции для лечения и предупреждения инфекций, в особенности необходимо идентифицировать белки, которые проявляют перекрестную реактивность и могут позволить разработать эффективные вакцины, в частности для лечения и предупреждения инфекции, вызываемой Н.parasuis.

Краткое описание изобретения

В одном из объектов настоящего изобретения предусмотрен способ определения молекулы, включающей перекрестно реагирующую антигенную детерминанту. Способ включает контактирование по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой. По меньшей мере одно антитело получают от животного, последовательно подвергаемого воздействию первого иммунологического стимула, вызываемого первой иммуногенной композицией, включающей первую антигенную детерминанту, и затем второго иммунологического стимула, вызываемого второй иммуногенной композицией, включающей вторую антигенную детерминанту. Связывание по меньшей мере одного антитела с первой и второй антигенной детерминантой свидетельствует о перекрестной реактивности, тем самым, определяя молекулу.

В другом объекте настоящего изобретения предусматривают способ определения молекулы, включающей перекрестно реагирующую антигенную детерминанту; указанный способ включает:

а) активацию В-клеток памяти у животного для образования по меньшей мере одного антитела, причем активация включает иммунологическое стимулирование животного молекулой, чтобы вызвать иммунологический ответ, который активирует В-клетки памяти, и

б) контактирование по меньшей мере одного антитела со второй молекулой, причем связывание по меньшей мере одного антитела с молекулой и второй молекулой определяет молекулу.

Другие объекты настоящего изобретения предусматривают выделенный полипептид. Полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

ELANAI	(SEQ ID NO:1),
TVLAEKQEII	(SEQ ID NO:2),
APAKGSTIEAGIAYPIST	(SEQ ID NO:3),
MKNLISI	(SEQ ID NO:4),
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT	(SEQ ID NO:5).

Кроме того, выделенный полипептид включает перекрестно реагирующую антигенную детерминант, присутствующую в белке, экспрессируемом по меньшей мере двумя серотипами Н.parasuis.

Некоторые объекты настоящего изобретения предусматривают выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

ELANAI	(SEQ ID NO:1),
TVLAEKQEII	(SEQ ID NO:2),
APAKGSTIEAGIAYPIST	(SEQ ID NO:3),
MKNLISI	(SEQ ID NO:4),
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT	(SEQ ID NO:5),

причем выделенный полипептид также включает перекрестно реагирующую антигенную детерминанту и экспрессируется серотипом 5 Н.parasuis.

В одном из объектов настоящего изобретения предусматривают вакцину, включающую профилактически или терапевтически эффективное количество выделенного полипептида и фармацевтически приемлемые растворитель, носитель или эксципиент. Полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

ELANAI	(SEQ ID NO:1),
TVLAEKQEII	(SEQ ID NO:2),
APAKGSTIEAGIAYPIST	(SEQ ID NO:3),
MKNLISI	(SEQ ID NO:4),
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT	(SEQ ID NO:5).

Кроме того, выделенный полипептид включает перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, присутствующую в белке, экспрессируемом по меньшей мере двумя серотипами Н.parasuis.

В другом объекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или предупреждения заболевания, состояния или их симптомов, связанных с инфицированием животного Н.parasuis. Способ включает введение эффективного количества вакцины, включающей профилактически или терапевтически эффективное количество выделенного полипептида и фармацевтически приемлемые растворитель, носитель или эксципиент. Полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

ELANAI	(SEQ ID NO:1),
TVLAEKQEII	(SEQ ID NO:2),
APAKGSTIEAGIAYPIST	(SEQ ID NO:3),
MKNLISI	(SEQ ID NO:4),
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT	(SEQ ID NO:5).

Кроме того, выделенный полипептид включает перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, присутствующую в белке, экспрессируемом по меньшей мере двумя серотипами Н.parasuis,

Другие объекты в соответствии с настоящим изобретением предусматриваются композиции, способы и наборы для диагностики.

Преимущества и выгоды настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области из приводимого описания.

Подробное описание изобретения

Различные объекты и варианты осуществления настоящего изобретения, предусмотренные на основании настоящего изобретения, включают идентификацию молекул, которые могут обеспечить перекрестно реагирующие антитела, которые распознают антигенно близкие молекулы, и которые поэтому могут использоваться в вакцинах, диагностических средствах и способах лечения или предупреждения широкого ряда состояний или заболеваний, включая те, которые связаны с инфекционными агентами, например, но ими перечень не ограничивается, бактериями, вирусами и др. Новый описываемый в настоящем изобретении подход использует хозяина для идентификации перекрестно реагирующих молекул, применяя модель ступенчатой иммунологической стимуляции, в которой хозяина последовательно стимулируют, например, одним серотипом Н.parasuis, дают восстановиться, затем стимулируют другим серотипом.

I. Определения.

Понятие «молекула», если не оговаривается иное, включает полипептиды и белки, включая, например, гликопротеины и липопротеиды, полисахариды, включая, например, липополисахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагменты.

Понятие «иммуноген» или «иммуногенный» относится к молекуле, которая вызывает специфический иммунный ответ.

Понятие «антигенная детерминанта» в контексте настоящего изобретения относится к первичной, вторичной, третичной или четвертичной структуре молекулы (например, полипептида), распознаваемой В-клетками (т.е. В-лимфоцитами) и антителами, секретируемыми В-клетками.

Понятие «перекрестно реагирующая антигенная детерминанта» в контексте настоящего изобретения относится к способности антигенной детерминанты, присутствующей на двух или нескольких молекулах (например, вариантах бактериального белка), связываться одним и тем же антителом. Кроме того, следует учитывать, что две или несколько молекул, включающие антигенную детерминанту, способную связываться одним и тем же антителом, могут представлять: одну и ту же молекулу или ее фрагмент, варианты друг друга или различные молекулы. Например, белки (например, варианты бактериального белка), включающие антигенную детерминанту, способную связываться одним и тем же антителом, могут иметь одинаковую или разную первичную аминокислотную последовательность, однако каждый из белков включает антигенную детерминанту (т.е., «перекрестно реагирует»), который может связываться одним и тем же антителом.

Понятие «перекрестно реагирующее антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, способному к связыванию с перекрестно реагирующей антигенной детерминантой.

Понятие «лечение» в контексте настоящего изобретения относится к улучшению или излечиванию заболевания, расстройства, состояния или симптомов заболевания, расстройства или состояния.

Понятие «предупреждение» означает остановку или торможение заболевания, расстройства, состояния или симптомов заболевания, расстройства или состояния.

II. Определение перекрестной реактивности.

В одной задаче настоящее изобретение предусматривает способ определения молекулы, включающей перекрестно реагирующая антигенная детерминанта. Способ включает контактирование по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой, причем по меньшей мере одно антитело получают от животного, последовательно подвергаемого воздействию первой иммунологической стимуляции, вызываемой первой иммуногенной композицией, включающей первую антигенную детерминанту, и последующей второй иммунологической стимуляции, вызываемой второй иммуногенной композицией, включающей вторую антигенную детерминанту, причем связывание по меньшей мере одного антитела с первой и второй антигенной детерминантой свидетельствует о перекрестной реактивности и таким образом определяет молекулу.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения первая иммуногенная композиция дополнительно включает первый полипептид, содержащий первую антигенную детерминанту, причем вторая иммуногенная композиция дополнительно включает второй полипептид, содержащий вторую антигенную детерминанту, причем первый полипептид экспрессируется первым микроорганизмом, а второй полипептид экспрессируется вторым микроорганизмом, причем первый и второй микроорганизмы отличаются тем, что являются различными серотипами одного и того же вида. В другом варианте осуществления настоящего изобретения первый и второй микроорганизмы являются бактериями. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения бактериями является Н.parasuis.

Таким образом, представляемый способ включает две или несколько последовательных иммунологических стимуляций животного, включая время восстановления между стимуляциями. Затем после последней стимуляции от животного получают по меньшей мере одно антитело, например, путем отбора у животного лимфатических узлов и/или другой богатой клетками памяти ткани, содержащих по меньшей мере одно антитело. Без ссылки на какую-либо теорию высказано предположение, что путем отбора лимфатических узлов и/или другой богатой клетками памяти ткани, можно собрать В-клетки памяти, генерируемые первой стимуляцией, после их активации в ответ на последующую стимуляцию. Активированные В-клетки памяти ответственны за просветление первой антигенной детерминанты, вызывающего первую стимуляцию, и антитела, которые они вырабатывают в ответ на последующую стимуляцию, вызываемую второй антигенной детерминантой, можно исследовать на их перекрестную реактивность с первой и второй антигенной детерминантой, определяя таким образом их соответствующие перекрестно реагирующие молекулы.

К соответствующим животным, пригодным для использования в этом способе, относятся, но ими не ограничиваются, свиньи (например, поросята), коровы, овцы, морские свинки, кролики, мыши, крысы, козы и лошади. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения животное представляет извлеченное кесаревым сечением лишенное молозива животное. В другом варианте осуществления настоящего изобретения животное является свиньей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рожденным через кесарево сечение лишенным молозива животным является поросенок. В других вариантах осуществления настоящего изобретения возраст животного составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 недель.

Животное можно подвергать воздействию первой и второй иммунологической стимуляции каким-либо способом, при условии, что при первой стимуляции генерируются В-клетки памяти и активируются в ответ на последующую стимуляцию животного второй антигенной детерминантой. Предпочтительно, антиген содержится в иммуногенной композиции. Например, первая иммуногенная композиция, включающая первая антигенная детерминанта, и вторая иммуногенная композиция, включающая вторую антигенную детерминанту, могут вводиться животному каким-либо соответствующим способом введения, известным в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, внутривенное, внутриартериальное, внутримышечное, подкожное, внутрикожное, чрескожное, пероральное и интраназальное введения.

Другие способы воздействия иммунологическим стимулом в рамках настоящего изобретения также включают вакцинации и естественное воздействие иммуногеном (например, инфекционным агентом). Таким образом, иммунологическая стимуляция также может включать стимуляцию, вызываемую естественным контактом животного с антигенной детерминантой, например, через контакт животного с инфекционным агентом (например, бактериями, вирусами, паразитами). Таким образом, например, первая иммунологическая стимуляция может быть стимуляцией, вызываемой естественным инфицированием животного штаммом бактерии, принадлежащим к первому серотипу, после которой следует вторая стимуляция, включающая внутриносовое введение второй иммуногенной композиции со вторым серотипом (например, второй антигенной детерминантой) штамма.

Иммуногенная композиция, включающая антиген, необязательно дополнительно может включать буфер и/или дополнительно включать другие компоненты, которые помогают достигнуть желаемого иммунологического эффекта и/или минимизировать побочные эффекты, оказываемые на животное, которое получает иммунологический стимул.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения первая и вторая иммуногенная композиция включают пептонный буфер или физиологический раствор. В другом варианте осуществления первая и вторая иммуногенные композиции включают пептонный буфер, причем первая иммуногенная композиция дополнительно включает первую бактерию, причем вторая иммуногенная композиция включает вторую бактерию, причем первая и вторая бактерии принадлежат к различным серотипам одного и того же вида.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения вторую иммунологическую стимуляцию вводят животному по меньшей мере примерно спустя 1 неделю после первой стимуляции животного, например, примерно от 1 недели до примерно 1 года, примерно от 2 недель до примерно 10 месяцев, примерно от 3 недель до примерно 8 месяцев, примерно от 1 месяца до примерно 6 месяцев и примерно от 2 месяцев до 4 месяцев после первой иммунологической стимуляции.

Таким образом, настоящее изобретение базируется на иммунологической памяти. Соответственно способ дополнительно предусматривает получение биологического образца от животного после второй иммунологической стимуляции, причем биологический образец включает клетки памяти, вырабатывающие антитело. Биологический образец может принадлежать к какому-либо соответствующему типу. Биологический образец может происходить из тканей, органов, крови, лимфы или лимфоузлов животного. Биологический образец также можно отбирать из инфицированного участка, или области поражения, или области, близкой к инфицированному участку или области поражения, например, в лимфоузлах. Предпочтительно биологический образец получают путем отбора лимфоузлов животного и/или других тканей с высоким содержанием клеток памяти, которые предоставляют В-клетки памяти.

Обычно биологический образец отбирают у животного после второй иммунологической стимуляции. Время, в течение которого отбирают образец, может варьировать в зависимости от множества факторов, включая конкретное животное, иммуногенную композицию, какие-либо предполагаемые стадии после отбора образца (например, последующие условия культивирования) и т.д., и может предварительно определяться стандартными экспериментами. Предпочтительно биологический образец отбирают у животного после второй стимуляции в то время, когда происходит достаточная активация клеток памяти. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биологический образец отбирают у животного примерно спустя 24 ч после второй иммунологической стимуляции, например, примерно через 1-14 суток, примерно через 2-12 суток, примерно через 4-10 суток и примерно через 6-8 суток после последней иммунологической стимуляции.

После отбора у животного биологического образца клетки памяти, образующие антитела, которые присутствуют в биологическом образце можно подвергнуть дополнительной обработке, чтобы получить по меньшей мере одно антитело. В одном варианте осуществления настоящего изобретения после отбора у животного биологического образца, клетки памяти, образующие антитела, которые присутствуют в биологическом образце, культивируют in vitro. Культивирование in vitro клеток памяти, образующих антитела можно проводить с проведением или без проведения предварительных этапов по разделению субпопуляций клеток. Методы культивирования известны в данной области.

Супернатант культуры может включать антитела, секретируемые клетками памяти во время культивирования in vitro, поэтому получение по меньшей мере одного антитела можно осуществлять путем сбора супернатанта культуральной среды. Антитела, образуемые культивируемыми клетками, также можно высвобождать из культивируемых клеток, например, путем лизиса клеток В-памяти для высвобождения по меньшей мере одного антитела.

Выработку и/или секрецию in vitro по меньшей мере одного антитела активированными клетками памяти в культуральной среде можно повысить путем добавления в клеточную культуру реагентов, которые способствуют клеточной пролиферации и/или повышают продукцию и/или секрецию антител. Такие реагенты сами по себе или в комбинации включают цитокины, например, но ими не ограничиваясь, интерлейкины, например, IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 к 8, колониестимулирующие факторы, интерфероны и какие-либо другие факторы, которые могут обладать усиливающим действием на активацию, пролиферацию и/или продукцию и/или секрецию антител у В-клеток. Например, клеточная активация может включать добавление к культуральной среде активирующего агента, включая, но ими не ограничиваясь, митогены, и факторы, образуемые лейкоцитами, или их синтетические аналоги или их комбинации. Необязательно в культуральную среду включают антимикробные агенты.

Супернатант клеточной культуры, включающий по меньшей мере одно антитело, можно непосредственно использовать для определения связывания по меньшей мере одного антитела с первой и второй антигенными детерминантами. Иначе говоря, по меньшей мере одно антитело можно просто использовать в форме супернатанта, полученного из культуральной среды.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения от животного можно получить биологический образец и содержащиеся в нем В-лимфоциты сделать бессмертными (иммортализировать) и/или клонировать. В данной области известны сливающиеся клетки, которые способны к иммортализации В-лимфоцитов. Методы, используемые для слияния, включают соединение В-лимфоцитов со сливающейся клеткой в присутствии фузогена, например, неионного детергента, в течение времени, достаточного для осуществления слияния, с последующей селекцией полученной гибридомы с помощью маркеров, присутствующих в сливающейся клетке. Затем клетки подвергают серийному разведению, чтобы получить клоны, свободные от контаминирующих клеток, таким образом, получая композицию гомогенных антител. Затем гибридомы можно размножить в культуре или ввести в животное-хозяина, например, мышь и крысу, для получения богатой антителами асцитной жидкости.

При желании по меньшей мере одно антитело можно подвергнуть процедурам очистки и/или разделения. Например, можно использовать методы, которые, например, используются для очистки иммуноглобулинов от сыворотки или плазмы, например, абсорбцию, осаждение сульфатом аммония, фракционирование каприловой кислотой, ионообменную хроматографию, или связывание и элюирование из иммобилизованного белка G или белка А. Также в зависимости от структуры или применения по меньшей мере одно антитело также можно соединить с пригодным носителем, например, с носителем для аффинной хроматографии.

Соответственно, например, раствор, содержащий по меньшей мере одно антитело, может также содержать по меньшей мере одно нежелаемое неспецифическое антитело, присутствие которого нежелательно во время этапа контактирования по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой. Соответственно при необходимости нежелательное антитело можно удалить из раствора, включающего по меньшей мере одно антитело, путем абсорбции различными реагентами, включая, например, яичный желток, порошок ткани, суспензии микроорганизмов и т.д. Для абсорбции также можно использовать предиммунную сыворотку, полученную от животного. В качестве иллюстрации в другом примере раствор, включающий по меньшей мере одно антитело, продуцируемое в ответ на стимулирование одним видом бактерии, можно инкубировать, например, с экстрагированной детергентом клеточной суспензией бактерии другого вида, после чего отцентрифугировать и собрать супернатант, включающий по меньшей мере одно антитело. Абсорбцию можно проводить более одного раза, чтобы минимизировать неспецифическое связывание, обусловленное посторонними антителами.

В соответствии с настоящим изобретением способ для определения молекулы, включающей перекрестно реагирующая антигенная детерминанта, включает контактирование по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой. Молекулу определяют по связыванию по меньшей мере одного антитела с первой и второй антигенной детерминантами. Контактирование можно проводить с использованием метода или комбинации методов, которые известны в данной области. В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает определение, связывается или нет по меньшей мере одно антитело с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой. Типичные методы, которые можно использовать отдельно или в комбинации включают, но ими не ограничиваются, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, радиоиммуноанализ, фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) и иммунофлуоресцентный анализ. Такие методы особо предпочтительны, если молекула, включающая антигенную детерминанту, является белком. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, в котором первый и второй белки включают, соответственно, первую и вторю антигенню детерминанты, контактирование включает использование метода вестерн-блоттинга для определения связывания по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой.

Например, если определяемая молекула является белком, первую композицию, включающую первый белок, имеющий первую антигенную детерминанту, и вторую композицию, включающую второй белок, имеющий вторю антигенную детерминанту, каждую можно в отдельности смешать со стандартным буферным раствором и подвергнуть электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS/PAGE), затем перенести на нитроцеллюлозную, нейлоновую или другие мембраны до контактирования по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой. Затем связывание по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой можно визуализировать, например, путем добавления вторичного антитела, которое может быть помечено и отобрано в соответствии с источником (т.е. животным) по меньшей мере одного антитела. Затем можно провести сравнительный анализ обнаруживаемых полос, соответствующих первому и второму белку, чтобы выявить связывание по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой, причем связывание по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой указывает на то, что по меньшей мере одно антитело перекрестно реагирует с первой и второй антигенными детерминантами. Соответственно, первая и вторая антигенные детерминанты являются перекрестно реагирующими, таким образом определяющими молекулы (т.е. белки), которые затем можно охарактеризовать, используя известные в данной области методы.

В качестве при