Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus musculus вpm vd-8 - продуцент моноклонального антитела 3c6/a9 к антигену 200 kda возбудителя мелиоидоза

Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus musculus вpm vd-8 - продуцент моноклонального антитела 3c6/a9 к антигену 200 kda возбудителя мелиоидоза

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии получения гибридом-продуцентов моноклональных антител (МКА) заданной специфичности. Штамм-продуцент моноклональных антител к антигену 200 kDa назван Bpm Vd-8 (3С₆/А₉). Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-ОБОЛЕНСК» под номером Н-30.

Изобретение может быть использовано в иммунологических исследованиях при создании наборов реагентов для иммуноферментного выявления гликопротеина 200 kDa Burkholderia pseudomallei - возбудителя особо опасного заболевания человека.

Иммуноферментный анализ на сегодняшний день является одним из наиболее чувствительных иммунодиагностических тестов. Данный метод играет большую роль в диагностике инфекционных заболеваний, вызванных различными патогенами, в том числе и возбудителями особо опасных инфекций. В частности, рекомендовано его применение в качестве экспресс-метода в схеме лабораторного анализа при поиске возбудителя мелиоидоза [4].

Изготовление реагентов для иммуноферментного анализа на основе моноклонального сырья обеспечивает высокую чувствительность и специфичность теста [3]. Существенным преимуществом работы с МКА является наличие постоянного источника их получения - гибридомы-продуцента.

В последние годы сформировалось такое актуальное направление, как создание иммунодиагностических препаратов на основе МКА к гликопротеину 200 kDa В. pseudomallei. Это связано с тем фактом, что выявление вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза, а также его дифференциация от близкородственных микроорганизмов связана с присутствием в капсуле бактерий гликопротеина с м.м. 200 kDa [6, 7].

О возможностях получения и использования МКА к антигену 200 kDa ранее сообщали зарубежные исследователи [12, 13]. Ими были получены и апробированы в различных целях экспериментальные образцы моноклональных иммуноглобулинов. Данные о внедренных в практику препаратах для иммуноферментного анализа на основе этих антител отсутствуют.

Цель изобретения - получение штамма гибридомы-продуцента высокоспецифичных МКА, пригодных к применению в качестве одного из компонентов смеси антител первого порядка, адсорбируемых на твердой фазе при изготовлении тест-системы иммуноферментной для обнаружения гликопротеина 200 kDa В. pseudomallei в исследуемых пробах.

Получение гибридомы достигается гибридизацией двух типов клеток: спленоцитов инбредной мыши линии BALB/c, иммунизированной антигеном 200 kDa возбудителя мелиоидоза, и клеток мышиной миеломы.

Гибридома-продуцент МКА 3С₆/А₉ получена в результате слияния спленоцитов иммунной мыши линии BALB/c с клетками мышиной миеломы P3-X63.Ag8.653 в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ-4000) в качестве конъюгирующего агента, рассева взвеси клеток в лунки 96-луночных культуральных пластин, выращивания в селективных средах в течение трех недель с постепенным переходом на полную среду культивирования гибридных клеток, отбора первичного клона по показателю продукции специфических антител к антигену 200 kDa возбудителя мелиоидоза, его клонирования и реклонирования с использованием метода лимитирующих разведении. Штамм назван Bpm Vd-8 (3С₆/А₉), депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-ОБОЛЕНСК» под номером Н-30, обладает следующими характеристиками:

1. Стандартные условия выращивания in vitro. Клетки культивируют при 37°C в атмосфере 5-7% CO₂ и влажности 70-80%. Среда культивирования - RPMI-1640 с 15% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 mM L-глютамина,10 mM Hepes, 4 тМ пирувата натрия.

2. Культуральные свойства. Характер роста культуры полусуспензионный. Частота пассирования - 3-4 сут. Кратность рассева 1:4-1:8.

3. Характеристика культивирования в организме сингенного животного: клетки гибридомы вводят внутрибрюшинно предварительно праймированным мышам линии BALB/c, по 2·10⁶ - 4·10⁶ клеток на мышь. Прививаемость гибридных клеток в брюшной полости достигает 88%. Асцит образуется через 2-6 недель.

4. Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 0,52 мкг/мл, в асцитической жидкости - 20-22 мг/мл. Объемы асцитической жидкости в среднем равны 3-3,5 мл.

5. Характеристика получаемого продукта. Антитела относятся к классу IgM. Они специфически взаимодействуют с антигеном 200 kDa возбудителя мелиоидоза. Специфичность взаимодействия определяют с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ТИФМ).

6. Способ криоконсервации. Для перевода клеток гибридомы-продуцента МКА 3С₆/А₉ в криоконсервированное состояние взвесь клеток гибридомы в количестве 4·10⁶ клеток в 1 мл защитной среды, состоящей из среды RPMI-1640 с 20% ЭТС и 7% диметилсульфоксида, переносят в пластиковые ампулы, которые помещают в аппарат для криоконсервирования биологического материала. Используют режим постепенного программируемого понижения температуры. Затем ампулы погружают в биохранилище с жидким азотом и хранят до момента использования. Размораживание клеток гибридомы осуществляют при 37°C на водяной бане в течение 2-3 минут. Жизнеспособность клеток после размораживания достигает 90% и более.

Пример 1. Получение штамма гибридомы-продуцента.

Получение штамма гибридомы-продуцента состоит из последовательных стадий по подготовке клеток-партнеров (В-лимфоцитов мыши линии BALB/c, иммунизированной антигеном 200 kDa, и клеток мышиной миеломы P3-X63.Ag8.653) к соматической гибридизации, последующего выращивания в селективных средах спленоцитов и клеток мышиной миеломы, клонирования методом предельных разведении и отбора моноклонов, секретирующих иммуноглобулины к эпитопам антигена, применяемого для стимуляции лимфоцитов.

Все манипуляции выполняют в ламинарном потоковом шкафу I класса защиты с горизонтальным потоком воздуха (тип ″защита продукта″).

1. Подготовка спленоцитов. Иммунизацию В-лимфоцитов мыши-донора, стимулированных антигеном 200 kDa В. pseudomallei, выполняют согласно схеме, описанной в Патенте на изобретение №2371196 от 27.10.2009. Антиген для иммунизации мышей получают методикой экстракции гликопротеина из клеток В. pseudomallei 100 по способу Фуллера в модификации Пивня Н.Н., заключающейся в изменении температурного режима экстрагирования биополимера: этап необходимо проводить при более мягких температурных условиях (экстракция при 20°C, вместо 150°C, рекомендованных Фуллером) [5].

2. Подготовка миеломных клеток. В качестве злокачественного партнера в опытах по гибридизации клеточных линий используют клетки одной из наиболее распространенных мышиных миеломных линий Р3-Х63-Ag 8.653.

К моменту гибридизации клетки миеломы должны находиться в экспоненциальной фазе роста. Это достигается последовательным выполнением следующих этапов: культивирование в среде с 8-азагуанином в течение 2 недель и в основной среде культивирования с 10% эмбриональной телячьей сыворотки в течение последующих 2 недель с регулярной сменой среды каждые 3 суток.

3. Гибридизация спленоцитов и клеток мышиной миеломы. Процедуру соматической гибридизации спленоцитов и клеток миеломы выполняют в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ) по следующей схеме:

- Взвесь иммунных спленоцитов (1·10⁸ клеток) и миеломных клеток (1·10⁷) центрифугируют при 800-1000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную среду декантируют.

- К осадку клеток медленно (в течение 2 мин) добавляют 1 мл 50% раствора ПЭГ. Затем вносят 1, 2, 4 и 8 мл бессывороточной среды, по 2 минуты каждое внесение. Во время добавления реактивов центрифужный стакан непрерывно вращают. После завершения данной манипуляции клеточную суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость декантируют, осадок клеток ресуспендируют в 20 мл селективной НАТ-среды с 15% эмбриональной телячьей сыворотки. Суспензию вносят в лунки двух 96-луночных пластин с предварительно подготовленным слоем фидерных клеток. Все этапы последующего культивирования гибридных клеток, отбора растущих клонов, секретирующих специфические иммуноглобулины, клонирования, тиражирования культур и накопления МКА in vivo выполняют согласно традиционному протоколу [10].

Пример 2. Накопление МКА в препаративных количествах. Ампулу с клетками гибридомы достают из биохранилища с жидким азотом и быстро размораживают по общепринятой методике [10]. Далее выполняют проверку жизнеспособности клеток. Условия культивирования in vitro аналогичны описанным ранее. При последовательном выполнении этих условий продукция МКА 3С₆/А₉ восстанавливается до уровня 0,50-0,52 мкг/мл. Из образцов культуральной среды выделяют моноклональные иммуноглобулины.

Тиражирование клеток гибридомы in vivo в брюшной полости сингенного животного - наиболее эффективный способ накопления высоких концентраций МКА. Животным предварительно внутрибрюшинно вводят по 0,4 мл стерильного минерального масла, пристана - 2, 6, 10, 14-тетраметил-пентадекана или неполного адъюванта Фрейнда. Через 5-7 суток мышам внутрибрюшинно вводят по 2·10⁶ - 4·10⁶ клеток гибридомы. После накопления асцитической жидкости ее собирают. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость отделяют и используют для выделения антител методом сульфатного трехкратного переосаждения белка при 50% насыщении сульфата аммония. Рыхлый осадок центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 минут, надосадочную жидкость удаляют. Осадок растворяют в 0,01 М фосфатном буфере, диализуют до полного удаления ионов сульфата аммония. Полученный раствор моноклональных иммуноглобулинов стерилизуют методом мембранной фильтрации, ампулируют и хранят при минус 20°C до момента использования. Концентрацию белка в растворе МКА определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Пример 3. Метод скрининга антителопродукции гибридом. Антителопродукцию гибридом оценивают на этапах накопления клеток in vitro. Специфическую активность МКА определяют с помощью ТИФМ по общепринятой методике [1]. В лунки полистироловой пластины для иммуноферментного анализа вносят по 100 мкл раствора антигена (с концентрацией 10 мкг/мл по белку) в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ), pH 9,5. Пластину в течение ночи выдерживают при 4-8°C, затем трижды отмывают фосфатным буферным раствором с 0,05% твина-20 и блокируют свободные участки пластика 1% раствором нейтрального белка (бычьего сывороточного альбумина), внося на 30 минут в каждую лунку по 100 мкл этого раствора. Пластину вновь трижды отмывают. Затем на 1 ч при 37°C вносят в лунки пластины по 100 мкл различных разведении МКА, приготовленных на 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4, с 0,05% твина-20, с последующей трехкратной отмывкой и внесением антивидового конъюгата в рабочем разведении по 100 мкл. Конъюгат, являющийся коммерческим препаратом антител диагностических против IgG (H+L) белой мыши, меченных пероксидазой. Пластину инкубируют при 37°C в течение 1 ч, трижды отмывают. В завершение реакции на 15 мин в лунки вносят по 100 мкл смеси перекиси водорода с хромогеном. Пластину помещают в защищенное от света место. Реакцию останавливают стоп-реагентом. Результаты реакции регистрируют на планшетном фотометре при длине волны, соответствующей характеристике применяемого хромогена. МКА 3С₆/А₉, выделяемые из асцитической жидкости, активны в разведениях 1:10⁵-5:10⁵.

Средний объем асцитической жидкости, получаемый от одной мыши при культивировании гибридомы Bpm Vd-8 (3С₆/А₉) in vivo, - 3-3,5 мл, концентрация МКА - 20-22 мг/мл.

Пример 4. Подбор компонентов для экспериментальной тест-системы.

Экспериментальную тест-систему, предназначенную для обнаружения антигенов, конструируют по типу сэндвич-варианта ТИФМ по следующей схеме: АТ(1)+АГ+ИПК.

В качестве АТ(1), антител первого порядка, которые в процессе анализа адсорбируют на твердой фазе, апробируют несколько вариантов антител или их смесей:

1. индивидуальные образцы МКА к антигену 200 kDa В. pseudomallei 100;

2. композиции МКА.

Растворы индивидуальных образцов МКА или их смесей, предварительно разведенные в 0,05 М КББ, pH 9,5, наносят на твердую фазу в концентрациях от 10 до 50 мкг/мл по белку.

Вторым компонентом тест-системы является АГ - это стандартный образец антигена 200 kDa, с соотношением белка и полисахаридов 1:6.

ИПК на основе МКА к антигену 200 kDa, используемый для детекции иммуноферментной реакции, выбирают по показателям активности в ТИФМ из ряда конъюгатов [11].

Установлено, что индивидуальные образцы МКА не обеспечивают необходимой чувствительности метода. Повышение чувствительности тест-системы достигают при использовании для сенсибилизации твердой фазы композиций МКА. МКА для этих смесей подбирали, варьируя на подложке композиции из двух и более МКА. Выбор МКА для смесей осуществляют после получения данных о конкурентных взаимоотношениях различных вариантов антител, а также после определения величин констант аффинности.

Для определения эпитопной направленности каждого конкретного МКА, а также выяснения характера взаимоотношений пар МКА с антигеном 200 kDa В. pseudomallei 100 используют методику, предложенную Friguet В. с соавторами в 1983 г. [9]. Учитывают, что значение индекса аддитивности более 50% свидетельствует об аддитивном связывании пар МКА, то есть об их разной эпитопной направленности, а значение менее 20-30% отражает конкурентные взаимоотношения антител, составляющих определенную пару.

Аффинность моноклональных антител, характеризующую прочность связывания активных центров молекулы антитела с определенным участком реакционно способной группы антигена, определяют по методу Beatty J.D. [8].

Использование смеси МКА, направленных против различных эпитопов на антигене 200 kDa и обладающих высоким уровнем аффинности, способствует более прочному захвату искомого антигена.

В качестве антител первого порядка, сорбируемых на твердой фазе, наиболее эффективной является смесь МКА 3С₆+5С₂+2А₆, выполняющая функцию «захвата» антигена 200 kDa возбудителя мелиоидоза. Индексы аддитивности пар МКА 3С₆ и 5С₂, 3С₆ и 2А₆, 5С₂ и 2А₆ имеют значения 100%, 72% и 100% соответственно. Константы аффинности МКА 3С₆, 5С₂, 2А₆ составляют 9·10⁵, 2·10⁸, 8·10⁷ М^-1 соответственно. Подробные сведения о выполнении этого раздела были опубликованы ранее [2]. Оптимальная белковая нагрузка смеси МКА на пластины - 20 мкг/мл.

В таблице 1 представлены данные о результатах подбора компонентов для наиболее чувствительного варианта экспериментальной тест-системы, свидетельствующие о том, что наиболее эффективной композицией МКА на подложке является 3С₆+5С₂+2А₆, а оптимальная основа для изготовления ИПК - 5C₂/F₁₀/C₉.

Пример 5. Подтверждение заявленных полезных свойств МКА 3С₆/А₉ в ИФА.

Для подтверждения полезных свойств МКА 3С₆/А₉ в составе моноклональных реагентов для захвата антигена 200 kDa возбудителя мелиоидоза изучают их специфическую активность в ТИФМ. В качестве контрольного антигена используют формамидный экстракт Burkholderia pseudomallei 100.

Диагностическую конструкцию выполняют по схеме прямого твердофазного двухстадийного ТИФМ разновидности сэндвич согласно следующей схеме. Первый этап - подготовка планшета (планшет Costar medium binding для иммуноферментного анализа) с иммобилизованной на поверхности лунок смесью МКА 3С₆+5С₂+2А₆, осуществляющих «захват» антигена 200 kDa возбудителя мелиоидоза. Второй этап - внесение в лунки планшета образца антигена и формирование иммунного комплекса. Третий этап - внесение в лунки планшета конъюгата МКА-пероксидаза хрена на основе 5C₂/F₁₀/C₉ для выявления образовавшихся иммунных комплексов антител с антигеном 200 kDa возбудителя мелиоидоза.

Визуализацию результатов анализа осуществляют после добавления к образовавшимся иммунным комплексам раствора хромогена ортофенилен-диамина с последующей фиксацией окраски раствором серной кислоты. Регистрацию результатов реакции выполняют на планшетном фотометре в единицах ОП.

Постановку реакции проводят по следующей методике.

На первой стадии ИФА на твердой фазе адсорбируют смесь из трех МКА 3C₆+5C₂+2A₆, разведенную на 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, pH 9,5, до концентрации 10 мкг/мл (по белку). В лунки пластины вносят по 100 мкл раствора смеси антител, затем пластину помещают в холодильник на 16-18 ч. Утром ее трижды отмывают фосфатно-солевым раствором с 0,05% твина 20. Свободные участки поверхности пластика блокируют 1% БСА, разведенном на КББ, в течение 30 мин при 37°C. По истечении этого срока пластины вновь трижды отмывают от несвязавшихся компонентов реакции. На всех этапах реакции объем последовательно вносимых в лунки ингредиентов составляет 100 мкл.

В подготовленные для работы пластины, нагруженные смесью МКА, вносят формамидный экстракт В. pseudomallei 100, содержащий антиген 200 kDa возбудителя мелиоидоза (1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 и т.д.), разведенный в фосфатно-солевом растворе. Время контакта антигена и смеси антител составляет 1 ч при 37°C. После очередного отмывания пластин в них вносят иммунопероксидазный конъюгат на основе МКА 5C₂/F₁₀/C₉ в рабочем разведении 1/160. Пластины инкубируют при 37°C в течение 1 ч, вручную отмывают несвязавшиеся компоненты реакции и на заключительном этапе для выявления ферментной метки в пластины вносят субстратную смесь: ортофенилендиамин, разведенный в 0,15 М натрий-цитратном буфере pH 5,0, в раствор которого непосредственно перед применением добавляют перекись водорода до концентрации 0,006%. Через 15-20 мин реакцию останавливают с помощью стоп-реагента (1 М HCl - по 100 мкл в лунку). Интенсивность изменения цвета реагентной смеси коррелирует с концентрацией антигена в исследуемом образце.

Результаты использования данной тест-системы, свидетельствующие об эффективности обнаружения антигена 200 kDa В. pseudomallei в пробах водорастворимых антигенов, изолированных из обеззараженных ацетоном и высушенных микробных клеток буркхольдерий различных видов, представлены в таблице 2.

Таким образом, перечисленные выше свойства гибридомы-продуцента МКА 3С₆/А₉ позволили сделать следующее заключение. Штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus (авторское название клеточной линии Bpm Vd-8) предназначен для получения моноклонального антитела 3С₆/А₉, пригодного для применения в качестве компонента смеси антител, выполняющих функцию захвата антигена в тест-системе иммуноферментной моноклональной для обнаружения гликопротеина 200 kDa В. pseudomallei в различных пробах.

Источники информации

1. Антитела. Методы. Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэтти. - М.: Мир, 1991. - 384 с., ил.

2. Булатова Т.В. Применение моноклональных антител к гликопротеину 200 kDa возбудителя мелиоидоза для конструирования экспериментальной тест-системы иммуноферментной моноклональной // Применение моноклональных антител к гликопротеину 200 kDa возбудителя мелиоидоза для конструирования экспериментальной тест-системы иммуноферментной моноклональной: Материалы науч.-практ. конф., 26-28 сент. 2013 г., г. Новосибирск: 2013. - С.120-123.

3. Лабораторная диагностика мелиоидоза (МУ 4.2.2787-10.4.2) / Демина Ю.В., Пакскина Н.Д., Илюхин В.И., Алексеев В.В., Храпова Н.П. и др. // Изданы ФЦГиЭ. - 2011.

4. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство / Под редакцией академика РАМН Г.Г. Онищенко, академика РАМН В.В. Кутырева. Изд. 2-е, переработанное и дополненное. - М.: ЗАО «Шико», 2013. - 560 с.

5. Пивень Н.Н., Смирнова В.И. Выделение, очистка и химический состав поверхностного полисахаридного антигенного комплекса возбудителя мелиоидоза // Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей. Вып.4 / Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт, 1990. - С.111-117.

6. Храпова Н.П., Пивень Н.Н., Корсакова И.И. и др. Перспективы создания диагностических средств индикации и идентификации вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза // Матер. науч.-практич. конф. «Соврем. аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (21-22.03.07). - Ставрополь, 2007. - 4.1. - С.155-156.

7. Anuntagool N., Panichakul Т., Aramsri P., Sirsinha S. Shedding of lipopolysac-charide and 200-kDa surface antigen during the in vitro growth of virulent Ara- and avirulent Ara+ Burkholderia pseudomallei II Acta Tropica. - 2000. - V.74. - P.221-228.

8. Beatty J.D., Beatty B.C., Vlahos W.G. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay // J. Immunol. Methods. - 1987; V.100. - P.173-179.

9. Friguet В., Djavadi-Ohaniance L., Pages J. et al. A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognize the same antigenic site. Application to hybridomas specific for the 2 subunit of Esche-richia coli tryptophan synthase // J. Immunol. Methods. - 1983. - V.60. - P.351-358.

10. Goding J.W. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice// Academic Press Inc.: London, 315 p.

11. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - V.22, №12. - P.1084-1091.

12. Recent developments in laboratory diagnosis of melioidosis / Sirisinha S., Anuntagool N., Dharakul T. et al. // Acta Tropica. - 2000. - №74. - P.235-245.

13. Relationship between antigenicity and pathogenicity for Burkholderia pseudo-mallei and Burkholderia mallei revealed by a large panel of mouse MAbs / Zou N., Tsai S., Feng S.H. et al. // Hybridoma (Larchmt). - 2008. - №27 (4). - 231-240.

Таблица 1
Сравнение чувствительности экспериментальной иммуноферментной тест-системы при использовании двух вариантов
Антиген	Минимальная выявляемая концентрация антигена
3С6+5С2+2А6 20 мкг/мл	6А11+6Е7+Ppm II 20 мкг/мл
ИПК 5С2	ИПК 5С2
Формамидный экстракт В. pseudomallei 100 (положительный контроль)	42 мкг/мл	42 мкг/мл
Автоклавированные взвеси В. pseudomallei (м.к. в мл):
В. pseudomallei 100	105	107
В. pseudomallei 112	105 и менее	108
В. pseudomallei С-141	105 и менее	-

Таблица 2
Применение экспериментальной тест-системы для выявления антигена-мишени
Исследуемый образец	Количество исследуемых проб	Показатель выявляемости антигена
количество положительных результатов	относительный показатель выявляемости, %
ВСЭ В. pseudomallei	17	11	71
ВСЭ В. mallei	3	1	33
ВСЭ гетерологичных штаммов	9	1	11
Примечание - ВСЭ - водно-солевой экстракт антигена

Штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus Bpm Vd-8, депонированный в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-ОБОЛЕНСК» под номером Н-30, являющийся продуцентом моноклонального антитела 3С₆/А₉ к гликопротеину 200 kDa возбудителя мелиоидоза, пригодного к применению в качестве одного из компонентов смеси антител первого порядка, адсорбируемых на твердой фазе и осуществляющих функцию захвата антигена, в составе тест-системы иммуноферментной, предназначенной для обнаружения этого антигена в пробах водорастворимых антигенов патогенных буркхольдерий.