Ферментационная среда и способ получения рекомбинантных белков

Ферментационная среда и способ получения рекомбинантных белков

Реферат

Настоящее изобретение относится к применению амидов угольных кислот, таких как мочевина или ее производные, карбаматы, карбодиимиды и тиокарбамиды, в качестве азотных добавок в ферментационные среды для получения рекомбинантных белков, таких как Г-КСФ, стрептокиназа и липаза, с целью достижения повышенных уровней биоконверсии, посредством ферментации подходящих экспрессирующих организмов, таких как Е. coli, Streptomyces sp., Asp.ergillus sp., Rhizopus sp., Penillium sp. и Rhizomucor sp. Существенные аспекты изобретения, в частности, относятся к экспериментальному процессу ферментации с использованием оптимизированных параметров питательных сред, отвечающих за более высокий выход продукта в течение более коротких периодов образования.

Уровень техники

Экспрессирующие системы на основе дрожжей, таких как Pichia pastoris, обычно используют для экспрессии рекомбинантных белков, см. статью Cregg, J. M. et al., в Dev. Ind. Microbiol. 29:33-41; 1988. Экспрессирующая система Р. pastoris использует индуцируемый метанолом промотор алкогольоксидазы (AO1), который контролирует ген, который кодирует экспрессию алкогольоксидазы, фермента, который катализирует первую стадию метаболизма метанола (см. статью Cregg J. M. et al. в Bio/Technology 11:905-910; 1993). Р. pastoris обладает потенциалом высоких уровней экспрессии, эффективной секреции внеклеточного белка, посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, и роста до высоких значений густоты клеток на минимальной среде в биореакторных культурах.

Способ периодической ферментации с подпиткой с использованием Pichia pastoris описан в "Pichia fermentation Process Guidelines" (Руководство по процессу ферментации Pichia) фирмы Invitrogen Co. (San Diego, CA), далее его обозначают как контроль. Для получения рекомбинантных белков трансформированную Pichia pastoris выращивают до требуемой биомассы, соответствующей высокой густоте клеток, на глицерине в качестве источника углерода. Фазу образования продукта инициируют подпиткой метанолом, который служит индуктором и единственным источником углерода для культуры. Во время образования биомассы и фазы образования продукта аммиак, который служит источником азота, используют для контроля рН.

Несмотря на различные преимущества, даваемые дрожжевыми экспрессирующими системами, еще имеется необходимость в оптимизации испытывающей влияние питательных компонентов физико-химической среды для эффективной и максимальной продукции белка в биореакторах. Весьма необходимым является достижение высокой специфической продуктивности. Она может быть получена путем оптимизации исходного состава среды, стратегии подпитки метанолом и физико-химических параметров процесса. Имеются публикации, в которых сульфат аммония, фосфат аммония, диаммоний фосфат, нитрат калия, мочевину, кукурузный сироп, соевую муку, хлопковую муку, мелассы сахарного тростника и свеклы, пептоны, мучные гидролизаты и т.п. используют в качестве источника азота для выращивания бактерий, дрожжей и грибов. Использование различных источников углерода и азота для "роста" микроорганизмов представляет собой предшествующий уровень техники.

Однако оптимальная комбинация специально определенных источников углерода и азота для эффективной продукции рекомбинантных белков, пептидов и ферментов не раскрыта в литературе, соответствующей предшествующему уровню техники. Например, заявка WO/2007/005646 раскрывает продукцию этанола по сути путем культивирования рекомбинантных дрожжей на комплексной среде для роста, содержащей сложные углеводы, а также ряд более дешевых источников азота, таких как кукурузный сироп, кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат и мочевина. Кроме того, в данном способе не используют индуцируемый метанолом механизм для роста или продукции в отличие от разработанного в настоящем изобретении способа получения рекомбинантных белков. Аналогично патент США 4288554 описывает непрерывный способ ферментации только для роста не-ГМО (негенно-модифицированного) вида Candida с использованием мочевины в комбинации с другими источниками азота и основной солевой среды. В данном случае отсутствует какое-либо предположение или описание того, где мочевина может быть использована во время процесса ферментации (периодической, периодической с подпиткой, непрерывной) с использованием индуцируемой метанолом ГМО Pichia pastoris для эффективной продукции рекомбинантных белков и пептидов, например человеческого инсулина и его аналогов, или ферментов, подобных липазе.

Неожиданно обнаружено, что использование описанной ферментационной среды, характеризующейся контролируемым добавлением некоторых богатых и легко растворимых источников азота, таких как мочевина, дополнительно в оптимизированных концентрациях относительно остаточных концентраций мочевины, а также остаточных концентраций аммиака, генерированных при гидролизе мочевины, дает повышенное образование продукта, продуктивность и, таким образом, уменьшенное время продукции.

Продукция рекомбинантных белков с использованием Е. coli давно известна, и экспрессирующая система хорошо изучена и понята. Экспрессирующую систему на основе Е. coli широко используют для получения таких молекул, как Г-КСФ (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), ГРЧ (человеческий гормон роста), стрептокиназа и многих других биологических продуктов. Для получения рекомбинантных белков трансформированную Е. coli выращивают до требуемой биомассы высокой густоты клеток на декстрозе в качестве источника углерода. Фазу образования продукта инициируют путем индукции с использованием требуемого индуктора и затем культуру только поддерживают с помощью минимального добавления питательных веществ до конца ферментации.

Многие годы культуры грибов используют для получения ценных биомолекул, например ферментов, и других полезных молекул. Грибные культуры, например Rhizopus, Aspergillus, Penicillium и т.п., используют в классической ферментации, предназначенной для получения широкого круга ферментов, например липаз, амилаз, декстраназ и т.п., которые используют в пищевой, текстильной, кожевенной и других подобных отраслях промышленности. Актиномицеты, известные как основные компоненты для получения антибиотиков, широко используют для получения ряда вторичных метаболитов, полезных для человека. Одним из ключевых свойств грибов и актиномицетов является свойство "биоконверсии", например гидроксилирования, эстерификации и т.п. Основное преимущество состоит в том, что биоконверсия специфична в отношении мишени, и можно получить продукты относительно высокой чистоты. Классическим примером является конверсия компактина в правастатин.

Методологические усовершенствования, известные в области техники, включают меры, относящиеся к технологии ферментации, такие как перемешивание или снабжение кислородом, либо модификацию, относящуюся к составу питательных сред, такую как модификация концентраций сахаров во время ферментации, изменения обработки по ходу процесса или изменения, относящиеся к природным свойствам самого микроорганизма и т.п.

Неожиданно обнаружено, что использование ферментационной среды, характеризующейся контролируемым добавлением некоторых богатых и легко растворимых источников азота, таких как мочевина, дает повышенную продуктивность и/или повышенный уровень биоконверсии и, таким образом, уменьшенное время продукции.

Раскрытие изобретения

Главной целью настоящего изобретения является получение ферментационной среды для продукции рекомбинантных белков, их производных или аналогов путем ферментации с использованием микроорганизмов.

Еще одной главной целью настоящего изобретения является разработка способа получения рекомбинантных продуктов, их производных или аналогов.

Еще одной главной целью настоящего изобретения является получение рекомбинантного белкового продукта.

Соответственно, настоящее изобретение относится к ферментационной среде, предназначенной для получения рекомбинантных белков, их производных и их аналогов путем ферментации с использованием микроорганизмов, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты; способу получения рекомбинантных белковых продуктов, их производных или их аналогов, который предусматривает размножение индуцируемого или неиндуцируемого микроорганизма, экспрессирующего белок в ферментационной среде, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

Настоящее изобретение относится к ферментационной среде для получения рекомбинантных белков, их производных и их аналогов путем ферментации с использованием микроорганизмов, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислоты выбран из группы, включающей мочевину или ее производные, такие как диметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетилфенилмочевина, изопропилиденмочевина, фенилмочевина, или их комбинацию.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислоты представляет собой мочевину.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислоты добавляют в форме жидкости, спрея, порошка или гранул.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения остаточная концентрация амида угольной кислоты составляет до 10 г/л.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения повышено потребление фосфата.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизм выбран из группы, содержащей E.coli, Streptomyces sp., Aspergillus sp., Rhizopus sp., Penillium sp. и Rhizomucor sp.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантных белковых продуктов, их производных или их аналогов, который предусматривает размножение индуцируемого или неиндуцируемого экспрессирующего белок микроорганизма в ферментационной среде, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислоты выбран из группы, включающей мочевину или ее производные, такие как диметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетилфенилмочевина, изопропилиденмочевина, фенилмочевина, или их комбинацию.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислоты представляет собой мочевину.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученный рекомбинантный белковый продукт представляет собой Г-КСФ.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученный рекомбинантный продукт представляет собой стрептокиназу.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения белковый продукт представляет собой липазу.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения уровень подпитки метанолом составляет до 20 г/л бульона в час.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученный максимальный титр продукта превышает 0,1 г/л.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислоты выбран из группы, включающей мочевину или ее производные, такие как диметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетилфенилмочевина, изопропилиденмочевина, фенилмочевина, или их комбинацию.

Изобретение предусматривает композицию питательных веществ, предназначенную для применения при разработке ферментационной среды, причем композиция содержит азотные компоненты, такие как амиды угольной кислоты, например мочевину и вышеупомянутые родственные формы или производные, вместе с одним или более других компонентов ферментационной среды, которые специально оптимизированы для получения повышенного выхода рекомбинантных белков за сокращенные периоды времени образования.

Неожиданно обнаружено, что использование определенной ферментационной среды с добавлением ряда азотсодержащих источников, таких как амиды угольной кислоты, например мочевины, и родственных форм или производных в специфических концентрациях не действует на рост дрожжевых клеток и не способствует повышению продуктивности.

Дополнительный азотный компонент, например мочевину, можно добавить в форме жидкости, спрея, порошка или гранул.

Основная проблема изобретения состоит в том факте, что на продуктивность способа ферментации рекомбинантного белка с помощью микроорганизма сильно влияет содержание мочевины в среде для культивирования. Вследствие этого выход продукта значительно повышается, особенно при сокращенных периодах времени ферментации, при добавлении азотного компонента, такого как мочевина, в среду для культивирования.

Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения добавление мочевины в ферментационную среду повышает уровень потребления ключевого ингредиента "фосфата", который, в свою очередь, повышает продуктивность. Обнаружено, что чем быстрее происходит потребление фосфата, тем короче время цикла ферментации и, следовательно, выше продуктивность. Таким образом впервые показан метаболизм мочевины наряду с фосфатом, который повышает уровень экспрессии белка или пептида, не воздействуя на профиль роста и сокращает время ферментации.

Согласно другому аспекту изобретения добавление мочевины обеспечивает повышенный уровень выделения продукта в конце ферментации при любом рН.

Таким образом, настоящее изобретение дает повышенные выходы белкового продукта, сокращенное время цикла продукции, улучшенное использованием питательных веществ, вводимых в процесс, и в целом снижает капитальные затраты и себестоимость производства.

Подходящий микробный штамм для промышленного способа ферментации с использованием химически определенной среды может представлять собой штамм дикого типа, продуцирующий ценное соединение, представляющее интерес, при условии, что указанный штамм дикого типа имеет хорошие характеристики роста.

Кроме того, подходящий микробный штамм для промышленного способа ферментации с использованием химически определенной среды может представлять собой штамм, который получают и/или усовершенствуют тем, что родительский штамм, представляющий интерес, подвергают классической мутагенной обработке или трансформации рекомбинантный ДНК, также при условии, что полученный в результате мутант или трансформированный микробный штамм имеет хорошие характеристики роста на химически определенной среде. Таким образом от характеристик роста родительского штамма на химически определенной среде будет зависеть, будут ли полученные в результате мутант или трансформированные штаммы иметь улучшенные или подобные характеристики роста на химически определенной среде по сравнению с характеристиками родительского штамма.

Как должен понимать компетентный специалист в области техники, оптимальная концентрация добавок амида угольной кислоты будет варьировать от клона к клону, хотя во всех случаях конечным результатом является получение более высокого титра за меньшее время.

Термин "ферментационные среды" или "ферментационная среда" относится к окружающей среде, в которой проводят ферментацию, который включает ферментационные субстраты и другое сырье, используемое ферментирующими микроорганизмами для образования специфического лекарственного продукта.

"Азотные компоненты" представляют собой субстраты, сырье или компоненты, которые являются источников ассимилируемого азота в ферментационной среде.

Согласно важному аспекту изобретения предпочтительным азотным компонентом в ферментационной среде являются амиды угольной кислоты, такие как мочевина. Они могут включать соединения, содержащие N-CO-N или родственные группы. Настоящее изобретение предусматривает использование производных мочевины, таких как диметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетил-N-фенилмочевина, изопропилиденмочевина, N-фенилмочевина и т.п., или их комбинаций.

Используемый термин "эффективное количество" представляет собой такое количество мочевины или ее производных, введение которого согласно изобретению в ферментационную среду приводит к образованию существенного количества/выхода белка, кроме того, за сокращенные периоды времени без воздействия на рост культуры микроорганизма.

Термин "ферментирующий организм" относится к любому микроорганизму, подходящему для использования в требуемом ферментационном процессе. Примеры ферментирующих организмов включают грибные организмы, такие как дрожжи. Примерами ферментирующих организмов являются Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp.,Saccharomycescerevisiae, Kluyveromyces sp. или Hansenula polymorpha.

Изобретение также может подойти для экспрессии любого рекомбинантного пептида с использованием индуцируемых метанолом видов грибов, но не ограничено рекомбинантно экспрессирующимися пептидами, белками, инсулином, предшественниками инсулина, инсулиновыми производными или аналогами инсулина.

Термин "рекомбинантный", как используют в данном контексте для описания белка или полипептида, означает полипептид, продуцируемый путем экспрессии рекомбинантного полинуклеотида. Термин "рекомбинантный", как используют в данном контексте в отношении клеток, означает клетки, которые могут быть или были использованы в качестве реципиентов для рекомбинантных векторов или другой перенесенной ДНК, и включает потомство исходной клетки, которая была трансфицирована. Следует иметь в виду, что потомство одной родительской клетки может быть не полностью идентичными по морфологии или по комплементу геномной либо общей ДНК исходному родительскому организму вследствие случайной или направленной мутации.

Термин 'полипептид', 'белок', 'пептид' относится к полимеру аминокислот и не относится к специфической длине продукта; таким образом, пептиды, олигопептиды и белки включены в определение полипептида. Данный термин также не относится к постэкспрессионным модификациям полипептида или исключает их, хотя химические или постэкспрессионные модификации данных полипептидов могут быть включены или исключены в качестве специфических вариантов осуществления. В одном варианте осуществления молекула представляет собой полипептид или его родственные аналоги либо их производные. Предпочтительно, когда полипептид представляет собой циклический пептид. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления полипептид представляет собой нециклический пептид. В еще одном предпочтительном варианте осуществления полипептид выбран из группы, содержащей эксендин, эптифибатид, атосибан, ферменты, такие как липаза, карбоксипептидаза и т.п.

Инсулин представляет собой полипептид из 51 аминокислоты, которые распределены между двумя цепями аминокислот: А-цепь из 21 аминокислоты и В-цепь из 30 аминокислот. Цепи соединены друг с другом 2 дисульфидными мостиками. Это определение включает использование не только природных инсулинов, но также инсулиновых производных и аналогов. Соединение инсулина может, например, представлять собой соединение инсулина млекопитающего, такое как человеческий инсулин, или производные либо аналоги соединения инсулина.

Инсулиновые производные представляют собой производные природных инсулинов, а именно человеческого инсулина или инсулинов животных, которые отличаются от соответствующего в других отношениях идентичного природного инсулина заменой по меньшей мере одного при родного остатка аминокислоты и/или введением по меньшей мере одного остатка аминокислоты и/или органического остатка. Следует иметь в виду, что термин инсулин определяет полипептид, состоящий из В- и А-цепи. Инсулиновое производное может быть по меньшей мере на 60% гомологичным природному инсулину. Инсулиновое производное может быть даже в большей степени гомологичным, например по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 90% гомологичным природному инсулину. Как правило, инсулиновые производные имеют несколько модифицированное действие по сравнению с человеческим инсулином.

При получении инсулина и инсулиновых производных посредством генетической инженерии предшественника инсулина часто экспрессируют "проинсулин", содержащий В-, С- и А-цепи. Данный проинсулин можно превратить в инсулин или инсулиновое производное путем ферментного или химического удаления С-цепи после соответствующей и правильной укладки и образования дисульфидных мостиков. Проинсулиновое производное может быть по меньшей мере на 60% гомологичным по В- и А-цепи природному проинсулину. Однако связывающий С-пептид может быть выбран как полностью отличающийся от любого известного С-пептида. Проинсулиновое производное может быть даже в большей степени гомологичным, например по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 90% гомологичным природному проинсулину.

Рекомбинантный продукт инсулина представляет собой IN-105.

Полученный в результате лекарственный продукт специфически относится к молекуле IN-105. IN-105 представляет собой молекулу инсулина, конъюгированную по 6-аминокислоте лизину в положении В29 В-цепи инсулина с амфифильным олигомером структурной формулы СН₃О-(C₄H₂O)₃-СН₂-СН₂-СООН. Молекула может быть моноконъюгированной по А1, В1 и В29, диконъюгированной по различным комбинациям А1, В1 и В29 или триконъюгированной по различным комбинациям А1, В1 и В29.

Согласно другому аспекту изобретения рекомбинантный белок, полученный путем ферментации с использованием ферментационной среды, соответствующей настоящему изобретению, представляет собой циклический или нециклический пептид.

Согласно другому аспекту изобретения рекомбинантный белок, полученный путем ферментации с использованием ферментационной среды, соответствующей настоящему изобретению, представляет собой фермент.

Протокол ферментации может включать три фазы: загрузки, подпитки (необязательно) и фазу индукции метанолом.

Согласно наиболее существенному аспекту изобретения ферментационная среда, используемая в контексте данного изобретения, включает следующие компоненты. Кроме того, включен способ приготовления среды.

Состав среды:

Компоненты	Количество (г/л)
CaSO4*2H2O	0,93
MgSO4*7H2O	29,8
K2SO4	36,4
КОН	4,13
Глицерин	40
H3PO4 (плотность-1,7)	22,95
Мочевина	6,0

Отдельные компоненты растворяют в минимальном объеме воды в вышеуказанной последовательности и стерилизуют при 121°С в течение 1 часа. Раствор микроэлементов и D-биотина (предварительно стерилизованного фильтрацией) асептически добавляют в среду, каждый со скоростью 4,35 мл/л среды (плотность раствора микроэлементов составляет 1,05, а D-биотина - 1,0). Состав раствора микроэлементов:

Компоненты (соли)	Количество (г/л)
Сульфат меди, CuSO4*5H2O	6,0
Йодид натрия, Nal	0,08
Сульфат марганца, MnSO4*H2O	3,0
Молибдат натрия, Na2MoO4*2H2O	0,20
Борная кислота, H3BO3	0,02
Хлорид кобальта, CoCl2*6H2O	0,50
Хлорид цинка, ZnCl2	20,0
Сульфат двухвалентного железа, FeSO4*7H2O	65,0
Серная кислота, H2SO4	5,0 мл

Все соли растворяют одну за другой в питьевой воде и стерилизуют фильтрацией через устройство для стерилизации фильтрацией.

Приготовление раствора биотина:

D-биотин

0,2 г/л

Биотин растворяют в питьевой воде и стерилизуют фильтрацией через устройство для стерилизации фильтрацией.

Подпитка дрожжевым экстрактом и соевым пептоном:

Кроме того, подпитку дрожжевым экстрактом и соевым пептоном также вводят во время ферментации. Ее следует готовить следующим образом:

Компоненты	Концентрация (г/л)
Соевый пептон	100
Дрожжевой экстракт	50

Компоненты растворяют и с помощью питьевой воды получают необходимый объем. Затем раствор стерилизуют при 121°-123°С в течение 90 мин. Плотность подпитки соевым пептоном составляет приблизительно 1,05.

Подпитка метанолом:

12,0 мл раствора микроэлементов, 12 мл растворов D-биотина и 40 г мочевины добавляют на литр метанола перед введением подпитки.

Способ ферментации:

Способ ферментации включает фазу роста клеток в загрузке, необязательную фазу подпитки глицерином загрузки и фазу индукции метанолом.

Фаза роста клеток в загрузке

Мониторирование и контроль загрузки

Параметры продукции ферментера задают исходно и контролируют следующим образом:

Температура:	30°±2°С
рН:	5±0,2
DO:	>10%
Время проведения:	22-24 час.

Фаза индукции метанола (ФИМ)

Подпитку метанолом начинают сразу после окончания фазы загрузки. Метанол стерилизуют (в режиме загрузки) путем фильтрации с использованием коммерчески доступного стерилизующего фильтра.

В начале ФИМ, рН подводят до значения 4,0±0,1 или 6,0±0,1 или 6,3±0,1 в зависимости от экспрессии белка в среду (варьирует от продукта к продукту, а также от клона к клону) и температуру доводят до приблизительно 18-24°С (варьирует от продукта к продукту, а также от клона к клону).

Одновременно другую подпитку, подпитку дрожжевым экстрактом и соевым пептоном также начинают в ферментере со скоростью 0,4 г/л/час исходного объема.

Мониторирование и контроль ФИМ

Температура:	18-30°С (варьирует от продукта к продукту, а также от клона к клону)
рН:	3,0-7,0
DO:	>1% (используют для контроля концентрации метанола в бульоне)
Время проведения:	5-8 дней (варьирует от клона к клону)
Анализ рН:	1-9,5 (в зависимости от типа белка)

Согласно другому аспекту изобретения посевной материал готовят путем культивирования лиофилизированной глицериновой исходной культуры на минимальной глицериновой среде (МГС). Основные ферментационные среды, полученные из "Control Pichia process guidelines" (Руководство по контролю процессов с использованием Pichia), содержат ортофосфорную кислоту, дегидратированный сульфат кальция, сульфат калия, сульфат магния гептагидрат, гидроксид калия, глицерин, микроэлементы и D-биотин. Питательная среда для культивирования должна содержать также известные соединения в маленьких или следовых количествах, которые обычно вводят в ферментационную среду для культивирования, такие как водорастворимые соединения Са, Mg, Mn, Fe, K, Со, Cu, Zn, В, Мо, Br и I. Могут также присутствовать другие микроэлементы. Раствор микроэлементов, соответствующий настоящему изобретению, в частности, включает сульфат меди пентагидрат, йодид натрия, сульфат марганца моногидрат, молибдат натрия дигидрат, борную кислоту, хлорид кобальта гексагидрат, хлорид цинка, сульфат двухвалентного железа гептагидрат. Хотя концентрация каждого ингредиента среды специально оптимизирована для каждого продукта, ниже приводят контрольные среды.

Контрольные среды

Ферментационная основная солевая среда

На 1 литр смешивают следующие ингредиенты:

Фосфорная кислота	85% (26,7 мл)
Сульфат кальция	0,93 г
Сульфат калия	18,2 г
Сульфат магния-7H2O	14,9 г
Гидроксид калия	4,13 г
Глицерин	40,0 г
Вода	до 1 литра

Добавляют в ферментер с водой до соответствующего объема и стерилизуют.

Микроэлементы РТМ1

Смешивают следующие ингредиенты:

Сульфат меди 5H2O	6,0 г
Йодид натрия	0,08 г
Сульфат марганца-Н2О	3,0 г
Молибдат натрия-2H2O	0,2 г
Борная кислота	0,02 г
Хлорид кобальта	0,5 г
Хлорид цинка	20,0 г
Сульфат двухвалентного железа-7H2O	65,0 г
Биотин	0,2 г
Серная кислота	5,0 мл
Вода	до конечного объема 1 л

Фильтруют, стерилизуют и хранят при комнатой температуре.

При смешивании данных ингредиентов может появиться мутный осадок. Среды можно профильтровать, стерилизовать и использовать.

В дополнение к вышеописанной контрольной среде включают мочевину в различных концентрациях.

Согласно еще одному аспекту изобретения образование биомассы во время фазы роста в загрузке происходит до тех пор, пока в исходной среде присутствует глицерин. Кроме того, образование биомассы не является важным фактором, и его осуществляют только в немногих случаях.

Согласно следующему аспекту изобретения после достижения требуемой биомассы культуру индуцируют постоянной подпиткой метанолом и мочевиной. Во время подпитки метанолом проводят также подпитку дрожжевым экстрактом и раствором пептона.

Согласно еще одному аспекту скорость подпитки метанолом составляет до 20 г/л/час. Как понимает любой компетентный специалист, оптимизация скорости подпитки для дальнейшего повышения уровней продукции предусмотрена настоящим изобретением.

Наряду с этим изобретение будет теперь описано в связи с некоторыми предпочтительными вариантами осуществления в следующих примерах, чтобы можно было полнее понять и оценить его аспекты. Ограничить изобретение данными конкретными вариантами осуществления не предусматривают. Напротив, предполагают покрыть все альтернативные варианты, модификации и эквивалентные решения, поскольку они могут быть включены в объем изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения. Таким образом, следующие примеры, которые включают предпочтительные варианты осуществления, будут служить для иллюстрации практической реализации данного изобретения, причем следует иметь в виду, что показанные подробности приведены только в качестве примера и с целью иллюстративного обсуждения предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения и присутствуют для представления материала, который считают наиболее полезным и легко понимаемым описанием способов ферментации, а также принципов и концептуальных аспектов изобретения.

Изобретение предусматривает питательную композицию, предназначенную для использования при приготовлении ферментационной среды, причем композиция содержит азотные компоненты, такие как карбамиды, например мочевину и родственные формы или производные, например карбаматы, карбодиимиды, тиокарбамиды, вместе с одним или более других компонентов ферментационных сред, которые специально оптимизированы с целью получения повышенных выходов продукта за сокращенные периоды времени продукции.

Таким образом, изобретение делает возможным получение повышенных выходов рекомбинантных белковых продуктов, например таких, как инсулин, гларгин IN 105, эксендин, липаза и карбоксипептидаза во время процесса ферментации (периодического, периодического с подпиткой, непрерывного) с использованием индуцируемой метанолом ГМО Pichia pastoris, обеспечиваемые добавлением мочевины без воздействия на рост дрожжевых клеток.

Согласно одному аспекту изобретения азотный компонент, который специфически воздействует на выходы и время продукции, представляет собой амиды угольной кислоты, такие как мочевина и ее производные и вышеупомянутые родственные соединения.

Согласно другому аспекту изобретения предпочтительные дрожжи для использования в качестве организма-продуцента включают, например, Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp.или Hansenula polymorpha.

Настоящее изобретение демонстрирует использование амидов угольной кислоты, таких как мочевина или ее производные карбаматы, кабодиимиды и тиокарбамиды, в качестве азотных добавок в ферментационные среды для получения белков с целью достижения повышенных уровней биоконверсии при использовании Е. coli, Actinomycetes и грибных культур. Существенные аспекты изобретения, в частности, относятся к экспериментальному процессу ферментации с использованием оптимизированных параметров питательных сред, отвечающих за повышенную продуктивность. Принцип настоящего изобретения можно применить для продукции широкого круга белков и вторичных метаболитов посредством ферментации подходящего экспрессирующего организма.

Изобретение предусматривает питательную композицию, предназначенную для использования при приготовлении ферментационной среды, причем композиция содержит азотные компоненты, такие как карбамиды, например мочевину и родственные формы или производные, например карбаматы, кабодиимиды и тиокарбамиды, вместе с одним или более других компонентов ферментационной среды, которые специально оптимизированы с целью получения повышенных выходов продукта за сокращенные периоды времени продукции.

Таким образом, изобретение делает возможным получение повышенных выходов белковых продуктов, таких как Г-КСФ, стрептокиназа, ГРЧ и др., во время процесса ферментации (периодической, периодической с подпиткой, непрерывной) с использованием индуцируемой метанолом ГМО Pichia pastoris при использовании индуцируемой E.coli, осуществляемое посредством добавления мочевины без воздействия на рост дрожжевых клеток.

Также возможно повысить уровень биоконверсии для получения повышенных выходов продуктов, например способ ферментации правастатина (периодической, периодической с подпиткой, непрерывной) с использованием актиномицетов и/или грибных культур

Данное изобретение, кроме того, повышает уровень продукции ферментов, например липазы, амилаз, целлюлаз, в периодических или периодических с подпиткой процессах при использовании грибных культур.

Согласно одному аспекту изобретения азотным компонентом, который специфически воздействует на выходы и время продукции, являются амиды угольной кислоты, например мочевина или ее производные и вышеупомянутые родственные соединения.

Согласно другому аспекту изобретения предпочтительными микроорганизмами являются штаммы семейства Enterobacteriaceae, предпочтительно, когда для использования в качестве организма-продуцента включают, но без ограничения перечисленным Е. coli.

Согласно другому аспекту изобретения предпочтительными микроорганизмами являются штаммы актиномицетов и/или семейства грибов, включая, но без ограничения Streptomyces sp., Actinoplanes sp., Aspergillus sp., Rhizopus sp. и Penicillium sp.

Другие объекты, свойства, преимущества и аспекты настоящего изобретения будут очевидны для компетентных специалистов из следующего описания. Однако следует иметь в виду, что следующее описание и специфические примеры, несмотря на то что они показывают предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведены только в качестве иллюстрации. Различные изменения и модификации, входящие в сущность и объем раскрытого изобретения, легко станут очевидными для компетентных специалистов в области техники из прочтения следующего описания и из прочтения других разделов настоящего описания.

Изобретение предусматривает питательную композицию, предназначенную для использования при приготовлении ферментационной среды, причем композиция содержит азотные компоненты, такие как амиды угольной кислоты, например мочевину и родственные формы или вышеописанные производные, вместе с одним или более других компонентов ферментационных сред, которые специально оптимизированы с целью получения требуемого белкового продукта или вторичных метаболитов.

Неожиданно обнаружено, что использование определенной ферментационной среды с добавлением ряда азотсодержащих источников, таких как амиды угольной кислоты (например, мочевину и родственные формы или производные), в специфических концентрациях не воздействует на рост ферментирующего организма, но способствует повышению продуктивности.

Дополнительный азотный компонент, например мочевину, можно добавить в форме жидкости, спрея, порошка или гранул.

Подходящий микробный штамм для промышленного способа ферментации может представлять собой любой штамм дикого типа, продуцирующий ценное соединение, представляющее инте