Микроматрица с микроканалами

Микроматрица с микроканалами

Реферат

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Изоляция клеток обычно является важной частью медицинских исследований, например, при скрининге и извлечении индивидуальных антителосекретирующих клеток. При определенных обстоятельствах исследователю в области медицины может потребоваться отделение индивидуальных клеток от суспензии, содержащей большое число клеток, для того чтобы выполнить дополнительные исследования. Один из методов включает применение микроматрицы, которая включает микроячейки. Суспензия клеток размещается на микроматрице, посредством чего обеспечивается возможность расположения небольшого числа клеток в индивидуальных микроячейках. При определенных обстоятельствах на микроматрице располагается подложка, чтобы способствовать изоляции клеток и обеспечить возможность образования печатной микроматрицы. Избыточная остаточная жидкость между микроматрицей и подложкой может приводить к недостоверным результатам.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В общем, в одном из аспектов, данное изобретение предоставляет микроматрицу, сформированную в плоской поверхности пластичной пластины, данная микроматрица включает множество групп микроячеек, включающих множество микроячеек, сформированных в плоской поверхности пластичной пластины, каждая микроячейка имеет такие размеры, чтобы содержать по меньшей мере единственную клетку, и множество микроканалов сформировано в плоской поверхности пластичной пластины, множество микроканалов сконфигурировано таким образом, что допускает переход жидкости из первой области микроматрицы во вторую область микроматрицы.

Примеры осуществления данного изобретения могут предусматривать одну или более из следующих характерных черт. Микроканалы включают первую и вторую группы микроканалов, при этом первая и вторая группы микроканалов образуют решетку и соединены с возможностью протекания текучей среды, при этом решетка определяет множество межлинейных областей. По меньшей мере одна группа микроячеек расположена в по меньшей мере одной из межлинейных областей. Конфигурация решетки микроканалов выбирается из группы, состоящей из квадратной и гексагональной конфигураций. Микроканалы сконфигурированы таким образом, что жидкость на плоской поверхности пластичной пластины удаляется из разделительной области через микроканалы, когда плоская поверхность пластичной пластины размещена в контакте с плоской поверхностью подложки, так что имеет место плотное прилегание между пластичной пластиной и подложкой.

Варианты осуществления данного изобретения могут также предусматривать одну или более из следующих характерных черт. Жидкость удаляется из разделительной области таким образом, что каждая из микроячеек удерживает достаточно жидкости, чтобы поддерживать содержащуюся в ней по меньшей мере одну клетку. Микроматрица также включает периферийный микроканал, соединенный с возможностью протекания текучей среды с микроканалами и расположенный вокруг групп микроячеек. В пластичной пластине сформировано сквозное отверстие, данное отверстие соединено с возможностью протекания текучей среды с микроканалами, конфигурация отверстия и микроканалов является такой, что отсасывание содержимого микроканалов может быть выполнено через данное отверстие. Каждая группа микроячеек включает по меньшей мере одну микроячейку, которая отличается от других микроячеек в данной группе микроячеек. Данная по меньшей мере одна отличающаяся микроячейка расположена в заданном месте в каждой группе микроячеек, так что ориентация группы микроячеек может быть определена визуально.

Примеры осуществления данного изобретения могут дополнительно предусматривать одну или более из следующих характерных черт. По меньшей мере одна отличающаяся микроячейка предоставляет информацию, которая может быть использована для определения расположения каждой группы микроячеек в микроматрице. Такой информацией является номер колонки и номер ряда. Отличающаяся микроячейка имеет форму, отличную от формы других микроячеек в группе микроячеек. Размер каждой группы микроячеек является по существу таким же, что и поле зрения камеры, используемой для визуального исследования группы микроячеек. Каждая из микроячеек соединена с возможностью протекания текучей среды с микроканалами. Каждая из микроячеек имеет по существу размер 50 мкм × 50 мкм × 50 мкм. Каждая межлинейная область включает шестнадцать групп микроячеек, расположенных в четыре колонки и четыре ряда. Микроканалы вытянуты к внешнему боковому краю пластичной пластины.

Различные аспекты данного изобретения могут предоставлять одну или более из следующих возможностей. Большое число отдельных клеток может быть изолировано при использовании матрицы. Жидкость, захваченная между поверхностью матрицы и второй подложкой, может быть эффективно удалена. Ориентация группы микроячеек может быть определена визуально. Расположение микроячейки внутри матрицы может быть определено однозначным образом. Матрица может быть использована для печатной микроматрицы на подложке. Матрица может быть специализирована таким образом, что печатная микроматрица может быть оптимизирована для опроса конкретным прибором. Качество печатных микроматриц может быть улучшено по сравнению с технологиями известного уровня техники. Каждая микроячейка может быть герметизирована подложкой таким образом, что может быть определена субнанолитровая культура. Матрица может быть оптимизирована для ручной и/или автоматизированной микрообработки.

Эти и другие возможности данного изобретения наряду с самим изобретением будут лучше поняты из представленного ниже обзора чертежей, подробного описания и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой схему части матрицы, которая включает множество групп микроячеек и микроканалов.

Фиг.2 представляет собой вид поперечного сечения схемы матрицы, показанной на фиг.1, по линии I-I.

Фиг.3 представляет собой схему группы микроячеек.

Фиг.4 представляет собой схему части комбинации матрицы и подложки.

Фиг.5 представляет собой схему части матрицы, которая включает отверстие.

Фиг.6 представляет собой схему части матрицы, которая включает несколько отверстий.

Фиг.7 представляет собой схему части матрицы, которая включает множество групп микроячеек и микроканалов.

Фиг.8 представляет собой схему группы микроячеек, которая включает адресную информацию.

Фиг.9 представляет собой фотографию примера группы микроячеек.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Варианты осуществления данного изобретения предоставляют способы предоставления матрицы микроячеек, которые подразделены сеткой взаимосвязанных микроканалов. Плоская поверхность матрицы сконфигурирована для размещения при соприкосновении с плоской поверхностью подложки (например, стекла, пластика, металла, кремния, каучука), чтобы образовать конструкцию для применения, например, при обнаружении новых моноклональных антител. Матрица может быть расположена при конфигурации, обеспечивающей возможность эффективного удаления жидкости, захваченной между поверхностью матрицы и подложкой, к краям матрицы, когда матрица размещена при соприкосновении с подложкой. Матрица может быть расположена при квадратной или гексагональной конфигурации, при этом множество микроячеек расположено в пространствах между микроканалами. Микроканалы могут пересекать кольцо из каналов на краях матрицы и могут включать отверстия для обеспечения возможности отсасывания избыточной среды из системы. Кроме того, форма индивидуальных микроячеек может быть различной, чтобы кодировать место расположения индивидуальных групп микроячеек внутри матрицы. В пределах объема данного изобретения находятся другие варианты осуществления.

При обращении к фиг.1-2, показана часть матрицы 5. Предпочтительно, матрица 5 сформирована в конформной композиции, такой как пластичная пластина 10. Предпочтительно, пластичная пластина 10 образована с применением полидиметилсилоксана (PDMS), хотя могут быть использованы другие материалы. Например, пластичная пластина 10 может также быть сформирована при применении вариантов силикона, латекса, натурального каучука, гидрогелей (например, коллагена, полиакриламида) и/или других газопроницаемых биосовместимых материалов, предпочтительно имеющих модуль Юнга, сходный с PDMS.

Матрица 5 предпочтительно включает множество блоков 15 микроячеек и множество микроканалов 20. Микроканалы 20 обычно являются постоянными по ширине, составляющей 10-100 мкм, и разделены расстоянием 1-4 мм, хотя могут быть также использованы другие величины ширины и разделяющего расстояния. Предпочтительно, множество микроканалов 20 сконфигурированы таким образом, что образуют решетку микроканалов, которая определяет множество межлинейных областей, в которых могут быть расположены блоки 15 микроячеек. Например, микроканалы 20 могут быть сконфигурированы параллельно-перпендикулярным образом, чтобы образовать квадратную конфигурацию «город-улицы», хотя возможны другие конфигурации (например, микроканалы 20 могут быть сформированы при гексагональной конфигурации, чтобы образовать конфигурацию в виде сот). Размер матрицы 5 может изменяться в зависимости от вида применения. Например, размеры матрицы 5 могут быть подобраны таким образом, чтобы быть совместимыми с покровными стеклами 25 мм × 60 мм и стандартными предметными стеклами, используемыми для микроскопа.

При обращении также к фиг.3, каждый из блоков 15 микроячеек предпочтительно включает множество групп 25 микроячеек в конфигурации четыре-на-четыре, которая может улучшать адгезию на границе раздела матрицы 5 и подложки 40, хотя возможны другие конфигурации. Предпочтительно, каждая из групп 25 микроячеек имеет такие размеры, что они оптимизированы для совмещения с полем зрения, предоставляемым прибором с зарядовой связью (ПЗС), используемым в типичных коммерческих камерах (например, 1360×1024 пикселей). Размер блоков 15 микроячеек может также быть оптимизирован для уменьшения искажения, когда матрица 5 объединена с подложкой 40. Например, микроканалы 20 могут функционировать как разделительные буферы между блоками 15 микроячеек посредством обеспечения, например, снижения механических напряжений. При испытаниях было найдено, что конфигурация четыре-на-четыре блоков 15 микроячеек уменьшала искажение при определенных обстоятельствах (например, отпечаток микрорельефа от одного из блоков 15 микроячеек искажен, в то время как отпечатки от окружающих блоков 15 микроячеек являются удовлетворительными). Кроме того, несмотря на то, что блоки 15 микроячеек были описаны как включающие множество групп 25 микроячеек, матрица 5 может быть сконфигурирована таким образом, что каждый из блоков 15 микроячеек включает единственную группу микроячеек. Фотография примера группы микроячеек, которая включает изолированные клетки, показана на фиг.9. Кроме того, хотя фиг.1 показывает конфигурацию 32×64 для группы 25 микроячеек, возможны другие размеры (например, размер отпечатка планшета с 96 ячейками).

Каждая из групп 25 микроячеек включает множество кубических микроячеек 30, расположенных при прямоугольной конфигурации 5×7, при расстоянии между микроячейками 100 мкм. Микроячейки 30 предпочтительно являются кубическими и имеют такие размеры, чтобы минимизировать число размещаемых клеток на микроячейку, наряду с тем, что облегчается извлечение клеток из микроячеек посредством ручной микрообработки (например, 50 мкм × 50 мкм × 50 мкм). Например, микроячейки 30 могут иметь такие размеры, что достигается средняя плотность клеток в 1-3 клетки, когда суспензия, содержащая клетки, размещается на матрице 5. Квадратная форма микроячеек может также способствовать определению качества печатной микроматрицы визуальным образом (например, форма может облегчить различение положительных элементов от артефактов). Несмотря на вышеуказанное, микроячейки 30 могут быть сконфигурированы при других формах, размерах и разделяющих расстояниях. Кроме того, группы 25 микроячеек могут иметь другие размеры (например, другое число микроячеек) и формы (например, прямоугольную, гексагональную, треугольную и т.п.).

Каждая из групп 25 микроячеек может быть сконфигурирована таким образом, что ориентация любой данной группы 25 микроячеек может быть определена с первого взгляда. В одном из методов одна или несколько заданных микроячеек 30 в каждой из групп 25 микроячеек имеет другую форму и/или сконфигурирована несколько иным образом. Например, верхняя левая микроячейка (например, микроячейка 35) в каждой группе 25 микроячеек может быть в форме ромба (по отношению к остальным микроячейкам 35, при виде сверху). Таким образом, исследователь может определить ориентацию группы 25 микроячеек для визуального определения места расположения ромбовидной микроячейки. Другие методы также могут быть использованы для обозначения ориентации групп 25 микроячеек (например, применение других форм микроячеек).

Матрица 5 предпочтительно изготавливается с применением мягких литографических методов формирования микрорельефа. Например, матрица 5 может быть изготовлена литьем и/или формованием (например, литьем под давлением, формованием, литьевым прессованием, компрессионным формованием и т.п.) биосовместимого эластомера (например, PDMS) с применением мастер-формы, которая включает поверхность с топологическим рисунком. Рисунок на мастер-форме может быть перенесен на сформованный каучук в виде барельефа. Предпочтительно, мастер-форма представляет собой кремниевую подложку, поддерживающую рисунок из фоторезиста, который сформирован с применением стандартного оборудования для фотолитографии, которое обычно можно найти в чистых помещениях в большинстве университетов и/или центров нанообработки. Примеры центров с таким оборудованием включают Stanford Microfluidics Foundry, KNI Microfluidic Foundry и Harvard Center for Nanoscale Systems. Другие методы и/или оборудование также могут быть использованы для изготовления матрицы 5.

При обращении к фиг.4, матрица 5 может быть сконфигурирована для применения при формировании отпечатка микрорельефа, при котором матрица 5 микроячеек 30 загружается клетками посредством размещения суспензии, содержащей клетки, на матрице 5 и обеспечения возможности оседания клеток из суспензии в индивидуальные микроячейки 30. Матрица 5 может быть сконфигурирована для размещения при соприкосновении с подложкой 40 (например, предметным стеклом), которая была соответственно функционализирована, чтобы связывать антитела, выделенные из клеток. В течение некоторого периода инкубации (например, 10-60 минут) антитела, выделенные из каждой клетки, предпочтительно удерживаются на поверхности подложки 40, обычно приводя к образованию протеиновой микроматрицы на подложке 40, где каждое пятно на матрице соответствует микроячейке 30 в матрице 5.

Матрица 5 сконфигурирована таким образом, что она создает конформное плотное прилегание к подложке 40, когда плоские поверхности каждой из них соприкасаются одна с другой (например, поверхности 45 и 50, соответственно). Например, конфигурация матрицы 5 может быть такой, что, когда матрица 5 размещена при соприкосновении с подложкой 40, жидкость, захваченная между поверхностью матрицы 5 и поверхностью подложки 40, может эффективно удаляться к краям матрицы 5. Таким образом, конфигурация матрицы 5 обеспечивает возможность удаления жидкости из разделительной области (например, области 55) и обеспечивает возможность уплотнения двух поверхностей. Кроме того, при применении описанной конфигурации матрицы 5 каждая из микроячеек предпочтительно содержит достаточно жидкости, после того как уплотнение было достигнуто между матрицей 5 и подложкой 40, так что отсутствует повреждение и/или гибель любых содержащихся в ней клеток (например, каждая микроячейка может быть уплотнена, чтобы определить субнанолитровую культуру). Избыточная жидкость может быть отсосана в несколько мест, например, в которых каждый из микроканалов 20 оставляет матрицу 5 (например, область 50). Кроме того, матрица 5 может быть сконфигурирована для применения с крепежными деталями таким образом, что матрица 5 и подложка 40 скреплены, и давление может быть приложено, чтобы способствовать уплотнению микроячеек 30.

Конфигурация микроканалов 20 может различаться, и возможна одна или более опций отсасывания содержимого. Например, могут быть предусмотрены отверстия для отсасывания содержимого, чтобы собирать избыточную жидкость, которая была удалена из разделительной области (например, матрицы и подложки), когда конформное уплотнение достигается и/или было достигнуто между матрицей и подложкой.

Например, при обращении к фиг.5 и 6, показана матрица 105. В матрице 105 конфигурация микроканалов 20 отличается от той, что описана по отношению к матрице 5. Например, микроканалы 20 не вытянуты к внешним краям матрицы 105. Напротив, микроканалы 20 соединены с возможностью протекания текучей среды с внешним микроканалом 110, который образует внешний периметр вокруг блоков 15 микроячеек. Внешний микроканал 110 может быть шире (например, 0,5-5 мм шириной), чем микроканалы 20 (например, как показано на фиг.5), хотя возможны другие ширины микроканала 110 (например, как показано на фиг.6). С микроканалом 110 может быть соединено отверстие 115. Предпочтительно отверстие 115 представляет собой сквозное отверстие, которое было сформировано в пластичной пластине 10. При применении отверстия 115 избыточная жидкость может быть отсосана из матрицы 105. В качестве альтернативы, отверстие 115 и/или микроканалы 20 могут быть использованы в качестве резервуара для сбора избыточной жидкости, которая была удалена из разделительной области, посредством чего снижается или даже устраняется потребность в отсасывании содержимого.

Отверстие 115 может быть расположено в одном или более местах на матрице 105. Например, при обращении к фиг.5, отверстие 115 может быть позиционировано с внешней стороны от внешнего микроканала 110 и соединено с возможностью протекания текучей среды с внешним микроканалом 110 посредством соединительного микроканала 120. При обращении к фиг.6, несколько отверстий 115 может быть расположено в соответствии с внешним микроканалом 110. Также возможны другие конфигурации отверстия 115 (например, отверстие, размещенное в соответствии с одним или несколькими микроканалами 20).

При обращении к фиг.7, матрица 5 может также включать дополнительные микроканалы 125, которые могут связывать каждую из групп 25 микроячеек с микроканалами 20. При использовании микроканалов 125 может быть возможно удаление и/или введение дополнительных жидкостей из каждой/в каждую из групп 25 микроячеек. Например, небольшие молекулы (например, медикаментов, метаболитов) могут быть введены в группу 25 микроячеек диффузией.

Каждая из групп 25 микроячеек может быть однозначным образом закодирована таким образом, что может быть определено точное расположение любой данной группы 25 микроячеек на матрицах 5, 105. Соответственно, после определения позиции микроячеек, содержащих клетки, представляющие интерес, посредством анализа матрицы 5, 105 может быть идентифицирован «адрес» каждой микроячейки, представляющей интерес. Таким образом, например, клетки из микроячейки, представляющей интерес, могут быть с уверенностью извлечены позже.

При обращении к фиг.8, примерная схема кодирования разделяет группу 25 микроячеек на заданные области 130, 135, 140, 145 и присваивает заданную величину индивидуальным микроячейкам 30 в каждой области. Например, области 130, 135 представляют наиболее и наименее значимые цифры, соответственно, колонки, в которой расположена группа 25 микроячеек. Аналогичным образом, области 140, 145 представляют наиболее и наименее значимые цифры, соответственно, ряда, в котором расположена группа 25 микроячеек. Каждой из микроячеек в каждой области может быть присвоена величина (например, как показано на фиг.8). Соответственно, число, представленное в каждой области 130, 135, 140 и 145, может быть идентифицировано посредством изменения формы, предназначенной для этой микроячейки (например, посредством использования ромбовидной микроячейки для идентификации соответствующей цифры). Число ноль может быть представлено посредством обозначения определенной микроячейки как ноль, или, в качестве альтернативы, отсутствие ромбовидной микроячейки в конкретной области может обозначать номер ноль. Соответственно, интерпретирование микроячейки 35, показанной на фиг.8, показывает адрес с колонкой 20 и рядом 58. При использовании этой схемы кодирования конкретная микроячейка на матрицах 5, 105 может быть идентифицирована посредством шестизначного номера, в котором первые две цифры обозначают колонку группы микроячеек, представляющей интерес, третья и четвертая цифры обозначают ряд группы микроячейки, представляющей интерес, и последние две цифры обозначают ряд и колонку микроячейки в группе микроячеек, представляющей интерес. Например, адрес 224757 будет представлять нижнюю правую микроячейку группы микроячеек, расположенной в колонке 22 и ряде 47 матриц 5, 105.

В пределах объема и сущности данного изобретения находятся другие варианты осуществления. Среднему специалисту в данной области техники будет понятно, что различные компоненты примеров, описанных в данном документе, могут быть заменены и/или замещены разными компонентами в других примерах и что могут быть возможны другие модификации. В тех пределах, в которых любой из материалов, включенных посредством ссылки в данный документ, противоречит условиям данного раскрытия, данное раскрытие предназначено быть доминирующим.

Кроме того, несмотря на то, что приведенное выше описание относится к изобретению, описание может включать более чем одно изобретение.

1. Микроматрица для использования при скрининге клеток, сформированная в плоской поверхности пластичной пластины, где микроматрица содержит:множество микроканалов, сформированных в плоской поверхности пластичной пластины, где множество микроканалов сконфигурировано таким образом, что образуют решетку, при этом решетка определяет множество межлинейных областей; имножество групп микроячеек, содержащих множество микроячеек, каждая из которых расположена в одной из межлинейных областей, причем каждая группа содержит множество микроячеек, сформированных в плоской поверхности пластичной пластины, и каждая микроячейка имеет такие размеры, чтобы содержать по меньшей мере единственную клетку, где микроканалы и микроячейки размещены и сконфигурированы в плоской поверхности пластичной пластины таким образом, что, когда плоская поверхность пластичной пластины размещена в контакте с плоской поверхностью подложки, так что имеет место плотное прилегание между пластичной пластиной и подложкой, жидкость на плоской поверхности пластичной пластины удаляется из разделительной области через микроканалы.

2. Микроматрица по п.1, в которой микроканалы и микроячейки размещены и сконфигурированы в плоской поверхности пластичной пластины таким образом, что, когда жидкость удаляется из разделительной области через микроканалы, каждая микроячейка удерживает достаточно жидкости, чтобы поддерживать содержащуюся в ней по меньшей мере одну клетку.

3. Микроматрица по п.1, в которой множество микроканалов содержит периферийный микроканал, соединенный с возможностью протекания текучей среды с отверстием так, что отсасывание содержимого микроканалов может быть выполнено через данное отверстие.

4. Микроматрица по п.2, в которой множество микроканалов содержит периферийный микроканал, соединенный с возможностью протекания текучей среды с отверстием так, что отсасывание содержимого микроканалов может быть выполнено через данное отверстие.

5. Микроматрица по п.1, в которой конфигурация решетки микроканалов выбрана из группы, состоящей из квадратной и гексагональной конфигураций.

6. Микроматрица по п.1, в которой каждая группа микроячеек включает по меньшей мере одну микроячейку, которая отличается по форме, размеру и разделяющему расстоянию от других микроячеек в данной группе микроячеек.

7. Микроматрица по п.6, в которой указанная по меньшей мере одна отличающаяся микроячейка расположена в заданном месте в каждой группе микроячеек, так что ориентация групп микроячеек может быть определена визуально.

8. Микроматрица по п.6, в которой указанная по меньшей мере одна отличающаяся микроячейка предоставляет информацию, которая может быть использована для определения расположения каждой группы микроячеек в микроматрице.

9. Микроматрица по п.8, в которой информацией является номер колонки и номер ряда.

10. Микроматрица по п.6, в которой указанная по меньшей мере одна отличающаяся микроячейка имеет форму, отличную от формы других микроячеек в группе микроячеек.

11. Микроматрица по п.1, в которой каждая из микроячеек имеет по существу размер 50 × 50 × 50 мкм.

12. Микроматрица по п.1, в которой размеры и конфигурация матрицы подобраны таким образом, чтобы быть совместимыми для использования с подложкой, представляющей собой 25 × 60 мм покровное стекло или стандартное предметное стекло, используемое для микроскопии.

13. Микроматрица по п.1, в которой каждая из микроячеек имеет такие же размеры, что и поле зрения, предоставляемое прибором с зарядовой связью (ПЗС), используемым в камере.

14. Микроматрица по п.1, в которой прибор с зарядовой связью (ПЗС) имеет 1360 х 1024 пикселей.

15. Микроматрица по п.1, в которой она загружена клетками при средней плотности клеток 1-3 клетки на микроячейку.

16. Микроматрица по п.1, в которой микроканалы и микроячейки размещены и сконфигурированы таким образом, что, когда суспензия, содержащая клетки, размещена на матрице, клетки из суспензии оседают в микроячейках микроматрицы и, когда плоская поверхность пластичной пластины размещена в контакте с плоской поверхностью подложки, так что имеет место плотное прилегание между пластиной и подложкой, жидкость на плоской поверхности пластины удаляется из разделительной области через микроканалы, и при этом достаточно жидкости удерживается в каждой из микроячеек после того, как было достигнуто уплотнение, так что клетки, содержащиеся в микроячейках, не повреждаются или не погибают.