Анти-ifnar1 антитела с пониженным сродством с лигандом fc

Анти-ifnar1 антитела с пониженным сродством с лигандом fc

Реферат

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с разделом 35 Свода законов США, §119(е), на основе следующих предварительных заявок на патенты США: US 61/006962, поданной 8 февраля 2008 г., 61/034618, поданной 7 марта 2007 г., и 61/049970, поданной 2 мая 2008 г., сущность которых включена в настоящее описание в виде ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к выделенным антителам и композициям, специфичным в отношении рецептора 1 интерферона альфа (interferon alpha receptor 1 - IFNAR1), с пониженным сродством в отношении лигандов Fc. Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие антитела, комплементарным нуклеиновым кислотам, векторам, клеткам-хозяевам и способам их получения и применения, включая терапевтические композиции, составы, способы введения и устройства.

Уровень техники

Интерфероны

Интерфероны (IFN) I типа (IFNα, IFNβ, IFNω, IFNτ) представляют семейство структурно близких цитокинов, обладающих противовирусным, противоопухолевым и иммуномодулирующим действием (Hardy и др. Blood 97, 2001, С.473; Cutrone и Langer J. Biol. Chem. 276, 2001, с.17140). Локус IFNα человека включает два подсемейства. Первое подсемейство состоит из 14 неаллельных генов и 4 псевдогенов, обладающих по меньшей мере 80% гомологии. Второе подсемейство, αII или омега (ω), включает 5 псевдогенов и 1 функциональный ген, проявляющий 70% гомологию с генами IFNα (Weissmann и Weber Prog. Nucl. Кислота Res. Mol. Biol., 33, 1986, cc.251-300). Подтипы IFNα обладают разными специфическими действиями, но одинаковым биологическим спектром (Streuli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1981, с.2848) и одним и тем же клеточным рецептором (Agnet M. и др. в кн.: «Interferon 5», 1983, под ред. I. Gresser, изд-во Academic Press, Лондон, cc.1-22). Подтипы интерферона альфа обозначают следующим образом: IFNα 1, 2а, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 и 21.

Интерферон β (IFNβ) кодирует один ген, который примерно на 50% гомологичен генам IFNα.

Интерферон γ, который вырабатывается активированными лимфоцитами, не проявляет какой-либо гомологии с альфа/бета интерферонами и не взаимодействует с их рецептором.

Рецепторы интерферона

Все интерфероны I типа человека связываются с рецептором на поверхности клеток (рецептор IFN альфа, IFNAR), состоящим из двух трансмембранных белков, IFNAR1 и IFNAR2 (Uze и др. Cell 60, 1990, с.225; Novick и др. Cell 77, 1994, с.391). Белок IFNAR1 важен для высокого связывающего сродства и дифференциальной специфичности комплекса IFNAR (Cutrone и др. J. Bio Chem 276(20), 2001, cc.17140-17148). Хотя функциональных отличий для каждого подтипа IFN I типа не было выявлено, предполагают, что каждый подтип может проявлять разные взаимодействия с компонентами рецептора IFNAR, приводя к возможному различию результатов по передаче сигналов (Cook и др. J. Biol. Chem. 271, 1996, с.13448). В частности исследования, в которых используют мутантные формы белков IFNAR1 и IFNAR2, подтверждают, что сигналы альфа и бета интерферонов по-разному передаются через рецептор за счет дифференциального взаимодействия с соответствующими цепями (Lewerenz и др. J. Mol. Biol. 282, 1998, с.585).

Функции интерферонов

Ранние функциональные исследования интерферонов I типа были сосредоточены на врожденной защите от вирусных инфекций (Haller и др. J. Ехр. Med. 154, 1981, с.199; Lindenmann и др. Methods Enzymol. 78, 1981, с.181). Однако в последующих исследованиях рассматривали интерфероны I типа в качестве мощных иммунорегулирующих цитокинов при формировании адаптивного иммунного ответа. Особенно показано, что интерфероны I типа облегчают дифференциацию не подвергнутых какому-либо воздействию Т-клеток по метаболическому пути Th1 (Brinkmann и др. J. Ехр. Med. 178, 1993, с.1655) для повышения выработки антител (Finkelman и др. J. Ехр. Med. 174, 1991, с.1179) и поддержки функционального действия и выживания Т-клеток памяти (Santini и др. J. Ехр. Med. 191, 2000, с.1777; Tough и др. Science 272, 1996, с.1947).

Некоторые группы исследователей в предшествующих исследованиях высказали предположение, что IFNα может повысить созревание или активацию дендровидных клеток (ДК) (Santini и др. (2000) J. Ехр. Med. 191:1777; Luft и др. J. Immunol. 161, 1998, с.1947; Luft и др. Int. Immunol. 14, 2002, с.367; Radvanyi и др. Scand. J. Immunol. 50, 1999, с.499). Кроме того, повышенная экспрессия интерферонов I типа описана при многочисленных аутоиммунных заболеваниях (Foulis и др. Lancet 2, 1987, с.1423; Hooks и др. Arthritis Rheum. 25, 1982, с.396; Hertzog и др. Clin. Immunol. Immunopathol. 48, 1988, с.192; Hopkins и Meager Clin. Ехр. Immunol. 73, 1988, с.88; Arvin и Miller Arthritis Rheum. 27, 1984, с.582). Большинство связанных с этим исследованных примеров представляет инсулин-зависимый сахарный диабет (ИЗСД) (Foulis (1987)) и системная красная волчанка (СКВ) (Hooks (1982)), которые ассоциированы с повышенными уровнями IFNα, и ревматоидный артрит (PA) (Hertzog (1988), Hopkins и Meager (1988), Arvin и Miller (1984)), в котором IFNβ может играть более существенную роль.

Кроме того, сообщают, что введение интерферона α обостряет основное заболевание у пациентов с псориазом и рассеянным склерозом, а также индукцию СКВ-подобного синдрома у пациентов, у которых ранее не было аутоиммунного заболевания. Также было установлено, что интерферон α индуцирует гломерулонефрит у нормальных мышей и для ускорения начала спонтанного аутоиммунного заболевания у мышей NZB/W. Кроме того, установлено, что терапия IFNα в некоторых случаях приводит к нежелательным побочным эффектам, в том числе к лихорадке и неврологическим нарушениям. Следовательно, имеются патологические ситуации, при которых подавление действия IFN I типа может быть полезно для пациента, и существует потребность в агентах, эффективных для подавления действия IFN I типа.

Эффекторные функции антител

Область Fc антитела взаимодействует с рядом лигандов (называемых также «лигандами Fc», к которым относятся, но которыми перечень не ограничивается, агенты, специфически связывающиеся с областью Fc антител, например, рецепторы Fc и C1q), включая рецепторы Fc и C1q, обеспечивая должное функционирование важных признаков, называемых эффекторными функциями. Рецепторы Fc опосредуют взаимодействие между антителами и клеточными выростами иммунной системы (Raghavan и др., Annu Rev Cell Dev Biol 12, 1996, cc.181-220; Ravetch и др., Annu Rev Immunol 19, 2001, cc.275-290). У людей к этому семейству белков относятся: FcγRI (CD64), в том числе изоформы FcγRIA, FcγRIB и FcγRIC; FcγRII (CD32), в том числе изоформы FcγRIIA, FcγRIIB и FcγRIIC; и FcγRIII (CD16), в том числе изоформы FcγRIIIA и FcγRIIB (Jefferis и др., Immunol Lett 82, 2002, cc.57-65). Эти рецепторы обычно имеют внеклеточный домен, который опосредует связывание с Fc, областью мембранного связывания и внутриклеточным доменом, которые могут опосредовать некоторые действия по передаче сигнала в клетке. Эти рецепторы экспрессируются в различных клетках иммунной системы, включая моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендровидные клетки, эозинофилы, тучные клетки, тромбоциты, В-клетки, крупные гранулярные лимфоциты, клетки Лангерганса, природные клетки-киллеры (NK) и Т-клетки. Формирование комплекса Fc/FcγR рекрутирует такие эффекторные клетки к сайтам связанного антигена, обычно приводя к передаче сигналов внутри клеток и последующим важным иммунным ответам, например, к высвобождению медиаторов воспаления, активации В-клеток, эндоцитозу, фагоцитозу и цитотоксической атаке. Способность опосредовать цитотоксические и фагоцитарные эффекторные функции является важным механизмом, с помощью которого антитела расстраивают клетки-мишени. Опосредованную клетками реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие FcγR, распознают связанное антитело на клетках-мишенях и затем вызывают лизис клеток-мишеней, называют антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (антитело dependent cellular cytotoxicity - ADCC) (Raghavan и др., Annu Rev Cell Dev Biol 12, 1996, cc.181-220; Ghetie и др., Annu Rev Immunol 18, 2000, cc.739-766; Ravetch и др., Annu Rev Immunol 19, 2001, cc.275-290). Опосредованную клетками реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие FcγR, распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают фагоцитоз клеток-мишеней, называют антитело-зависимым клеточно-опосредованным фагоцитозом (антитело dependent cell-mediated phagocytosis - ADCP). Кроме того, перекрывающийся сайт в области Fc на молекуле также контролирует активацию клеточно-независимой цитотоксической функции, опосредованной комплементом, которая также называется комплемент-зависимой цитотоксичностью (complement dependent cytotoxicity - CDC).

Разные типы FcγR человека

Рецепторы FcγR человека подразделяют на три разных класса: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16). Рецептор FcγRI является рецептором высокой степени сродства (K_a: 10^-8-10^-9 М^-1)и связывает и иммунные комплексы, и мономерные молекулы IgG, хотя Fc рецепторы FcγRII и FcγRIII ингибируют пониженное сродство (<10^-7 М^-1 и 2-3×10^-7, соответственно) (Gessner J.E. и др., Annn Hematology 76, 1998, cc.231-248). Передача сигналов через FcγR происходит или через иммунорецепторный основанный на тирозине активирующий мотив (immunoreceptor tyrosine-based activation motif - ITAM), или через иммунорецепторный основанный на тирозине ингибирующий мотив (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif - ITIM) для всех трансмембранных рецепторов (Presta, Adv Drug Deli Rev 58, 2006, cc.640-656).

Внеклеточный гликопротеин FcγRI массой 72 кДа преимущественно экспрессируется на миелоидных клетках, например, моноцитах, клетках-предшественников макрофагов CD4+ и может вызвать ответы в виде ADCC, эндоцитоза и фагоцитоза (Siberil и др. J Immunol Lett 106, 2006, cc.111-118).

Рецепторы группы FcγRII массой 40 кДа (А, В и С изоформы) проявляют внеклеточные домены, но не содержат домены активной трансдукции сигналов. Эти рецепторы распространяют сигналы через фосфорилирование цитоплазматического хвостового домена (Amigorena S. и др., Science. 256, 1992, cc.1808-1812). Рецептор FcγRIIA в основном экспрессируется на моноцитах, макрофагах, нейтрофилах и тромбоцитах, несмотря на то, что рецептор FcγRIIC был идентифицирован только на клетках NK. Было установлено, что эти два рецептора инициируют ADCC, эндоцитоз, фагоцитоз и высвобождение медиатора воспаления (Cassel и др., Mol Immunol 30, 1993, cc.451-460). Напротив, рецепторы FcγRIIB (типов В1 и В2) экспрессируются на В-клетках, тучных клетках, базофилах, моноцитах, макрофагах и дендровидных клетках, а также установлено, что они снижают иммунный ответ, запускаемый изоформами А и С.

Рецептор FcγRIIIA массой 50 кДа, экспрессируемый на клетках NK, моноцитах, макрофагах и подгруппой Т-лимфоцитов, где он активирует ADCC, фагоцитоз, эндоцитоз и высвобождение цитокина (Gessner и др.). Изоформой FcγRIIIB является гликозилфосфатидилинозит (glycosyl-phosphatidylinositol - GPI) заякоренный периферический мембранный белок, участвующий в дегрануляции и выработке промежуточных соединений реакционноспособного кислорода (Salmon J.E. и др,. J Clin Inves 95, 1995, cc.2877-2785).

Молекулы IgG также проявляют различную по изотипам специфичность в отношении рецепторов FcγR. Молекулы IgG3 сильно связываются со всеми изоформами FcγR. Изоформы IgG1, наиболее превалирующие изоформы в крови, связываются со всеми рецепторами FcγR, хотя и с меньшим сродством в отношении изоформ FcγRIIA/B. IgG4 является промежуточным связующим для FcγRI и слабым связующим для FcγRIIB. В конечном счете IgG2 связывается слабо только с одной аллельной формой FcγRIIA (FcγRIIA-H131) (Siberil и др., J Immunol Lett 106, 2006, cc.111-118).

Комплемент

Воспалительный каскад комплемента является частью врожденного иммунного ответа и является ключевым в отношении способности индивидуума сдерживать инфекцию. Другим важным лигандом Fc является белок комплемента C1q. Fc, связываясь с C1q, опосредует процесс, называемый комплемент-зависимой цитотоксичностью (complement dependent cytotoxicity - CDC) (по этой теме см. обзор Ward и др., Ther Immunol 2, 1995, cc.77-94). Clq способен связывать шесть антител, хотя связывание с двумя IgG достаточно для активирования каскада комплемента. C1q формирует комплекс с сериновыми протеазами C1r и C1s для формирования комплекса С1 метаболического пути комплемента.

Области и аминокислотные остатки IgG, участвующие в связывании FcγR

Проводилось тщательное исследование картирования сайтов связывания IgG человека с разными рецепторами FcγR. Эти исследования, основанные на генетически измененных молекулах IgG, выявили короткие непрерывные участки аминокислотных остатков (234-238) N-концевой части домена СН2, в качестве непосредственно вовлеченных в связывание со всеми рецепторами FcγR. Кроме того, остатки 268, 297, 327 и 329 могут воздействовать на связывание с подгруппой FcγR. Кроме того, множественные остатки, локализованные на доменах СН2 и CH3, также влияют на связывание с FcγR (Canfield S.M. и др., J Exp Med 173, 1991, cc.1483-1491; Chappel M.S. и др. Proc Nat Acad Sci USA 888, 1991, cc.9036-9040; Gergely J. и др., FASEB J 4, 1990, cc.3275-3283).

Токсичность, связанная с терапевтическими антителами

Во многих случаях связывание и стимуляция эффекторных функций, опосредованных областью Fc иммуноглобулинов, весьма полезны, однако в некоторых случаях может быть более полезным снизить или элиминировать эффекторную функцию. Это особенно справедливо для тех антител, которые разработаны для доставки лекарственного средства (например, токсинов и изотопов) к клеткам-мишеням, когда Fc/FcγR-опосредованные эффекторные функции приводят здоровые иммунные клетки в соприкосновение со смертельным грузом, что приводит к истощению нормальной лимфоидной ткани вместе с клетками-мишенями (Hutchins и др., PNAS USA 92, 1995, cc.11980-11984; White и др., Annu Rev Med 52, 2001, cc.125-145). В этих случаях применение антител, которые слабо рекрутируют комплемент или эффекторные клетки, может обладать огромным преимуществом (см., например, Wu и др., Cell Immunol 200, 2000, cc.16-26; Shields и др., J. Biol Chem 276, 2001, cc.6591-6604; US 6194551; US 5885573 и РСТ публикацию WO 04/029207).

В других случаях, например, если целью является блокирование взаимодействия широко экспрессируемого рецептора с его близким лигандом, может быть полезно понизить или элиминировать все эффекторные функции антитела для снижения нежелательной токсичности. Кроме того, если терапевтическое антитело проявляет беспорядочное связывание в ряде тканей человека, может быть целесообразно ограничить нацеливание эффекторной функции на разнообразный набор тканей для ограничения токсичности. Хотя некоторые известные подклассы имуноглобулинов человека, которые утратили специфические эффекторные функции, неизвестны природные иммуноглобулины, утратившие эффекторные функции. Другим подходом может быть конструирование или внесение мутации применительно к принципиально важным остатков в области Fc, ответственной за эффекторную функцию. См., например, публикации РСТ WO2006076594, WO199958572, US20060134709, WO2006047350, WO2006053301 и US 5624821, каждая из которых включена в настоящее изобретение в виде ссылки на ее сущность.

Применение моноклональных антител для лечения многих заболеваний хорошо изучено. С неисчислимыми эффекторными функциями, которые антитело может индуцировать, одним из необходимых условий для терапевтических антител является то, что они нацеливаются конкретно на требуемую мишень. Например, но этот пример не является ограничительным, специфичность ткани-мишени анализируется путем определения иммуногистохимии (ИГХ) исследуемой ткани. Важно, что лекарственное средство связывается только с тканями, которые содержат исследуемую мишень. Расстройство такого действия может привести к повышенной токсичности терапевтического антитела из-за несоответствующей активации эффекторной функции, вызываемой по сайту, не являющемуся мишенью. Если эффекторная функция может быть понижена или удалена, опасности широко распространенного связывания терапевтического средства можно избежать. Учитывая вышесказанное, имеется нерешенная проблема по разработке антител с пониженным или удаленным сродством в отношении по меньшей мере одного лиганда Fc, ответственного за действие эффекторной функции. Такие антитела могут быть особенно полезны для применения в лечении хронического воспаления и аутоиммунных состояний.

В настоящем изобретении цитирование и обсуждение ссылок нельзя истолковывать в качестве допущения, что таков предшествующий уровень для настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

С целью иллюстрации настоящего изобретения в виде фигур представлены определенные варианты осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничивается точным описанием манипуляций и инструментария тех вариантов настоящего изобретения, которые отображены на фигурах.

Фиг.1А. Выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID No:7) и выравнивание последовательности аминокислот (SEQ ID No:8) 3F11 VH с областями CDR, отмеченными подчеркиванием сверху.

Фиг.1Б. Выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID No:9) и аминокислотной последовательности (SEQ ID No:10) 3F11 VK с областями CDR, отмеченными подчеркиванием сверху.

Фиг.2А. Выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID No:17) и выравнивание последовательности аминокислот (SEQ ID No:18) 4G5 VH с областями CDR, отмеченными подчеркиванием сверху.

Фиг.2Б. Выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID No:19) и выравнивание последовательности аминокислот (SEQ ID No:20) 4G5 VK с областями CDR, отмеченными подчеркиванием сверху.

Фиг.3А. Выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID No:27) и выравнивание последовательности аминокислот (SEQ ID No:28) 11E2 VH с областями CDR, отмеченными подчеркиванием сверху.

Фиг.3Б. Выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID No:29) и выравнивание последовательности аминокислот (SEQ ID No:30) 11E2 VK с областями CDR, отмеченными подчеркиванием сверху.

Фиг.4А. Выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID No:37) и выравнивание последовательности аминокислот (SEQ ID No:38) 9D4 VH с областями CDR, отмеченными подчеркиванием сверху.

Фиг.4В. Выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID No:39) и выравнивание последовательности аминокислот (SEQ ID No:40) 9D4 VK с областями CDR, отмеченными подчеркиванием сверху.

Фиг.5. Выравнивание аминокислотной последовательности константных областей тяжелой цепи для 9D4. Стрелки показывают аминокислотные замещения (немодифицированные на модифицированные) для повышения стабильности и пониженного сродства в отношении по меньшей мере одного лиганда Fc.

Фиг.6А. Профиль иммуногистохимического окрашивания ткани гловного мозга, обработанной различными анти-IFNAR1 антителами. Антитело 9D4 демонстрирует профиль пониженного окрашивания при инкубировании с тканью головного мозга человека по сравнению с антителами 4G5 и MDX-1333.

Фиг.6Б. Профиль иммуногистохимического окрашивания моноцитов человека, обработанных различными анти-IFNAR1 антителами. В качестве положительного контроля различные анти-IFNAR1 антитела исследуют на реактивность в отношении моноцитов человека.

Фиг.7. Анти-IFNAR1 антитело 9D4 ингибирует передачу сигнала IFNα по данным исследования активирования STAT, основанного на клетках. Обработка антителом 9D4 ингибирует STAT1/3/4 фосфорилирование тирозина в ответ на стимулирование интерфероном альфа, что было установлено методом вестерн-блоттинга с коммерчески доступными антителами STAT.

Фиг.8. Анти-IFNAR1 антитела блокируют передачу сигнала различных концентраций интерферонов I типа, производных от клеток ПДК. Представлены величины IC50 для антитела 9D4, блокирующего передачу сигнала IFN, в люциферазном репортерном анализе, использующем супернатанты IFN I типа, очищенные от трех независимых доноров. Содержатся относительные количества IFNα, IFNβ и IFNω в каждом очищенном супернатанте интерферона I типа.

Фиг.9 А, Б, В. Анти-IFNAR1 антитела 9D4, 9D4-DM (двойной мутант) и 9D4-TM (тройной мутант) проявляют схожие связывающие свойства. Показанные данные представляют немодифицированное антитело 9D4 наряду с 2 модифицированными антителами, 9D4-DM и 9D4-TM. Модифицированные антитела проявляют сходные показатели связывания IFNAR1 с немодифицированным антителом.

Фиг.10А. Анти-IFNAR1 антитело 9D4 связывает растворимый рецептор интерферона альфа (soluble interferon alpha receptor - sIFNαR1). Представлены данные равновесного связывания, которые показывают доза-зависимое связывание 9D4 с растворимым рецептором интерферона альфа.

Фиг.10Б. Определение величины Kd антитела 9D4 на мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) человека. Показано определение константы диссоциации антитела 9D4, измеренное по связыванию с МКПК человека.

Фиг.11. Анти-IFNAR1 антитела ингибируют индуцированную IFNα передачу сигнала в люциферазном репортерном анализе. Анти-IFNAR1 антитела, включая немодифицированные и модифицированные антитела, проявляют сходные величины IC50 для блокирования передачи сигнала через лейкоцитарный IFN в системе люциферазного репортерного анализа.

Фиг.12А. Определение изоэлектрической точки 9D4 антитела (немодифицированного) и модифицированного 9D4 антитела. Показан IEF гель, документирующий относительные величины pI для антител 9D4 WT (немодифицированного), 9D4-DM и 9D4-TM.

Фиг.12Б. Определение температуры плавления антитела 9D4 (немодифицированного) и модифицированного антитела 9D4. На фигуре представлены кривые плавления, представляющие относительные температуры плавления (melting temperatures - Tm) для антител 9D4, 9D4-DM и 9D4-TM.

Фиг.13. Профилактическое лечение с помощью анти-IFNAR антител блокирует Adv-IFNα индуцированную протеинурию. Мышей, обработанных контрольным вектором, Adv-IFNα, Adv-IFNα + предварительная обработка изотипическим контролем и Adv-IFNα + предварительная обработка анти-IFNAR, исследуют на протеинурию на протяжении 9 недель. Мыши, предварительно обработанные анти-IFNAR антителом, не проявляют протеинурии после введения IFNα.

Фиг.14. Профилактическое лечение анти-IFNAR антителами блокирует повышенную регуляцию генов, ответственных за IFNα (IFIT1, IFI44, CXCL11, IFI202b, CXCL19, CXCL9), в крови. Мыши, предварительно обработанные анти-IFNAR антителами, не проявляют повышенной регуляции отобранных генов, отвечающих за IFNα, при заражении аденовирусом, кодирующим IFN альфа, по сравнению с мышами, предварительно обработанными контрольным вирусом, ФСБ или контролями изотипических IgG. Представлена относительная экспрессия шести генов, о которых известно, что они отвечают на IFNα в образцах крови, взятых от мышей через 3 недели после индукции IFNα инфицированием Adv-IFNα.

Фиг.15 А, Б. Профилактическое лечение анти-IFNAR антителами блокирует индуцированную IFNα выработку аутоантитела. Мыши, предварительно обработанные анти-IFNAR антителами, не проявляют повышенной выработки аутоантитела при инфицировании аденовирусом, кодирующим IFNα, по сравнению мышами, предварительно обработанными контрольным вирусом, ФСБ или изотипическими контролями IgG. Представлены концентрации анти-днДНК и анти-SSA/Ro в образцах крови, взятых от мышей через 6 мин после индукции IFNα инфицированием Adv-IFNα.

Фиг.16 А, Б. Профилактическое лечение анти-IFNAR антителами блокирует повышенную регуляцию цитокинов в почках. Мыши, предварительно обработанные анти-IFNAR антителами, не проявляют повышенной регуляции цитокинов в почках при заражении аденовирусом, кодирующим IFNα5, по сравнению с мышами, предварительно обработанными контрольным вирусом, ФСБ или контрольными изотипическими IgG. Представлено измерение уровней IP-10 и IL-18 в образцах почек, полученных от мышей через 6 недель после индукции IFNα инфекцией Adv-IFNα5.

Фиг.17. Профилактическое лечение с помощью анти-IFNAR антител блокирует индуцированную IFN выработку аутоантитела. Представлены титры антител к антиядерным антигенам (ANA) из сыворотки мыши. Мыши, обработанные анти-IFNAR антителами, проявляют пониженные титры ANA в сыворотке после введения IFN по сравнению с мышами, ранее обработанными контрольным вирусом, ФСБ или изотипным контролем.

Фиг.18. Опосредованное антителом подавление развития дендровидных клеток, опосредуемого плазмой СКВ. Представлены результаты 5 отдельных экспериментов, в которых IFN, полученный от пациентов с СКВ, инкубируют в присутствии анти-IFNAR1 антитела 9D4 и затем добавляют к моноцитам человека. Наличие анти-IFNAR1 антитела 9D4 ингибирует способность IFN, полученного от пациентов с СКВ, индуцировать маркеры CD38 и CD123 дендровидных клеток в дифференцирующихся моноцитах.

Фиг.19. Анти-IFNAR1 антитела подавляют экспрессию CD38, CD123 и CD86 в моноцитах, после стимуляции лейкоцитарным интерфероном. По данным измерения процента подавления экспрессии при контрольном стимулировании, анти-IFNAR1 антитела 9D4, 9D4-DM и 9D4-TM проявляют сходные профили экспрессии CD38, CD123 и CD86 в дифференцирующихся моноцитах.

Фиг.20. Модифицированные анти-IFNAR1 антитела проявляют пониженное связывание с Fc рецептором FcγRI по сравнению с немодифицированными анти-IFNAR1 антителами. Анти-IFNAR1 антитела 9D4 (немодифицированное), 9D4-DM (модифицированное) и 9D4-TM (модифицированное) анализируют по способности связываться с планшетом, с которым связан рецептор FcγRI, в эксперименте ELISA. В качестве положительного контроля для связывания Fc рецептора используют неродственное немодифицированное антитело (контрольное антитело).

Фиг.21 А, Б, В. Модифицированные анти-IFNAR1 антитела проявляют пониженное связывание с Fc рецептором FcγRIIIA по сравнению с немодифицированными анти-IFNAR1 антителами. Связанные с планшетом немодифицированное анти-IFNAR1 антитело 9D4(A) и модифицированное анти-IFNAR1 антитела 9D4-DM(В) и 9D4-TM(С) анализируют по способности связывать свободный рецептор FcγRIIIA в экспериментальном формате ELISA.

Фиг.22 А, Б, В. Модифицированные анти-IFNAR1 антитела проявляют пониженное связывание с Fc рецептором FcγRIIIA. Свободное немодифицированное анти-IFNAR1 антитело 9D4(A) и модифицированные анти-IFNAR1 антитела 9D4-DM(B) и 9D4-TM(C) анализируют по способности связывать связанный с планшетом рецептор FcγRIIIA в экспериментальном формате ELISA.

Фиг.23 А-Д. Нейтрализация подтипов IFN в сыворотке пациентов с СКВ. По данным измерений в репортерном анализе анти-IFNAR1 антитела MDX-1333, 9D4-WT и 9D4-TM подавляют опосредованную IFN передачу сигнала α10 (А), лейкоцитарного интерферона (Б), α2b (В), ω (Г) и β (Д).

Фиг.24. Анти-IFNAR1 антитела нейтрализует интерферон I типа от пациентов с СКВ. С помощью репортерного анализа показано, что анти-IFNAR1 антитело, 9D4, подавляет опосредованную интерфероном I типа передачу сигнала по сравнению с контрольным, неродственным антителом.

Фиг.25 А-Г. Анти-IFNAR антитела подавляют индуцированную IFNα популяцию ПДК среди МКПК. Анти-IFNAR антитела блокируют повышение клеток ПДК, установленное по экспрессии эпитопа на поверхности клеток, индуцированной эктопической аденовирусной экспрессией, вызванной экспрессией интерферона альфа в селезенке (А), лимфоузлах (Б), периферической крови (В) и костном мозге (Г).

Фиг.26. Анализ связывания анти-IFNAR1 антител 9D4-WT, 9D4-DM и 9D4-TM с Fc рецептором FcγRI определяют методом BIACore. Вкратце, анти-IFNAR1 антитела иммобилизуют и добавляют свободный FcγRI для измерения аффинности. Из рисунка следует, что модифицированные антитела 9D4-DM и 9D4-TM проявляют пониженное сродство со свободным FcγRI по сравнению с немодифицированным антителом 9D4-WT.

Фиг.27 А-В. Анализ связывания анти-IFNAR1 антител 9D4-WT, 9D4-DM и 9D4-TM с Fc рецептором FcγRI определяют методом BIACore. Вкратце, свободные анти-IFNAR1 антитела пропускают через иммобилизованный FcγRI для измерения аффинности. Из фигуры следует, что модифицированные антитела 9D4-DM (Б) и 9D4-TM (В) проявляют пониженное сродство со связанным FcγRI по сравнению с немодифицированным антителом 9D4-WT (А).

Фиг.28. Анти-IFNAR антитела ингибируют IFNα-чувствительную генную индукцию в почках. Вкратце, в мышах - модели повышенного проявления волчанки, лечение анти-IFNAR антителами блокирует индукцию в почках шести генов (ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10 и IFIT1), опосредованную эктопически экспрессируемым IFNα, по сравнению с контрольными мышами по данным измерения методом Taqman.

Фиг.29. Анти-IFNAR антитела ингибируют выработку анти-днДНК антител в мышах - модели повышенного проявления волчанки. Вкратце, мыши, эктопически экспрессирующие IFNα и обработанные анти-IFNAR антителами, не аккумулируют анти-днДНК антитела до того же уровня, что и у мышей, сходным образом инфицированных и обработанных контрольным антителом IgG.

Фиг.30. Анти-IFNAR антитела способны понизить протеинурию при терапевтическом лечении мышей - модели повышенного проявления волчанки. (А) Вкратце, мыши с симптомами волчанки, сформировавшимися под воздействием экспрессируемого IFNα, например с протеинурией. В терапевтическом исследовании анти-IFNAR антитела вводят мышам при достижении порога оценки, соответствующего протеинурии. Анти-IFNAR антитела, ФСБ или контрольный IgG вводят дважды в неделю на протяжении курса, длительностью 5 недель. У животных в группе лечения анти-IFNAR антителом проявляется пониженная тяжесть протеинурии во время эксперимента по сравнению с животными в группах применения ФСБ или контрольного IgG.

Фиг.31. Анти-IFNAR антитела способны повышать выживаемость при терапевтическом лечении мышей - модели повышенного проявления волчанки. (А) Вкратце, мыши, имеющие эктопически экспрессируемый IFNα, имеют пониженную степень выживаемости, примерно составляющую 8 недель, после развития симптомов, напоминающих симптомы волчанки, например, протеинурию. В терапевтическом исследовании анти-IFNAR антитела вводят мышам после достижения порога протеинурии. Анти-IFNAR антитела, ФСБ или контрольный IgG вводят дважды в неделю на протяжении 5 недельного курса. Через 5 недель лечение антителом прекращают и смертность прослеживают для всех трех групп лечения. В группе лечения анти-IFNAR антитело намного ниже показатель смертности по сравнению с группой, в которой использовали только ФСБ, или группами контрольных IgG, в каждой из которых установлена 100% смертность к 9 неделе.

Фиг.32. Представление содержимого асимметричной единицы кристаллов области Fc-TM, которая включает мутации L234F/L235E/P331S. Мутация Р331 обозначена красным цветом. Один ион цинка хелатирован двумя пространственно сближенными остатками гистидина. Углеводные остатки, присоединенные в положении 297, моделируют исходя из их электронной плотности.

Фиг.33. Кинетические изображения показывают интернализацию антитела 9D4-TM. Клетки ТНР-1 окрашивают 1 мкМ CFSE в инкубаторе при 37°С в атмосфере СО₂ в течение 10 мин с последующей обработкой 1 мкг/мл Alexa647-9D4-TM на льду в течение 1 ч. После удаления несвязанного реактива клетки инкубируют при 37°С в течение назначенного времени (0, 15, 30 и 60 мин) и получают изображения взятых клеток.

Фиг.34. Анти-IFNAR1 антитело 9D4-TM не проявляет действия CDC при оценке методом in vitro. На фигуре показаны результаты анализа CDC для определения способности антитела 9D4-TM вызывать действие CDC. Из фигуры следует, что 9D4-TM антитело не проявляет какого-либо CDC действия по сравнению с положительным контрольным антителом. Действие CDC также не выявляется для неродственного контрольного антитела, R347. Вкратце, клетки, экспрессирующие антиген IFNAR1, инкубируют или с положительным контрольным антителом, 9D4-TM, или с R347. После серий промывок добавляют свеже приготовленную сыворотку человека. Комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) измеряют, используя анализ высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ).

Терминология

Понятия «интерферон альфа», «IFNα», «IFNa», «IFNA» и «IFN альфа» в настоящем изобретении используют взаимозаменяемо, и они означают белки IFN альфа, кодируемые функциональным геном локуса гена интерферона альфа с 75% или выше идентичностью последовательности с последовательностью IFN альфа 1 (идентификационный номер NP_076918 в GenBank, у кодируемого белка идентификационный номер NM_024013 в GenBank). Примерами подтипов IFN альфа являются IFN альфа 1, альфа 2а, альфа 2b, альфа 4, альфа 4b альфа 5, альфа 6, альфа 7, альфа 8, альфа 10, альфа 13, альфа 14, альфа 16, альфа 17 и альфа 21. Понятия «интерферон альфа», «IFNα» и «IFN альфа» означают рекомбинантные формы различных подтипов IFN альфа, а также природные продукты, которые включают белки IFN альфа, например лейкоцитарный IFN и лимфобластоидный IFN.

Понятия «рецептор-1 интерферона альфа», «IFNAR1», «IFNAR-1» и «антиген IFNAR-1» используют взаимозаменяемо; к ним относятся варианты, изоформы, гомологи IFNAR-1 человека от других видов и аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп с IFNAR-1. Таким образом, антитела человека по настоящему изобретению могут в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения перекрестно реагировать с IFNAR-1 других видов (т.е. происходящих не от человека) или с другими белками, которые структурно близки с IFNAR-1 человека (например, гомологами IFNAR-1 человека). В других вариантах осуществления настоящего изобретения антитела могут быть полностью специфичными для IFNAR-1 человека и не проявлять видовую или другого типа перекрестную реакционную способность. Полная последовательность кДНК IFNAR-1 человека имеет идентификационный номер NM_000629 в Genbank.

В контексте настоящего изобретения понятие «консервативные модификации последовательности» включает аминокислотные модификации, которые не влияют или не изменяют показателей связывания антитела, содержащего аминокислотную последовательность. К таким консервативным модификациям относятся аминокислотные замещения, вставки и делеции. Модификации могут быть внедрены в антитело по настоящему изобретению стандартными методами, известными в данной области, например, сайт-направленным мутагенезом и ПЦР-опосредованным мутагенезом. Консервативными являются аминокислотные замещения, у которых аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком со схожей боковой цепью. Например, одна или несколько аминокислот со сходной полярностью действуют в качестве функциональных эквивалентов и приводят к непроявляемому изменению в аминокислотной последовательности пептида. Замещения, которые нейтральны по заряду и которые замещают остаток на меньший остаток, могут также рассматриваться в качестве «консервативных замещений», даже если остатки находятся в разных группах (например, замещение фенилаланина на меньший изолейцин). Семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, известны и определены в данной области. Несколько неограничивающих примеров семейств аминокислот показано в табл.1.

Таблица 1.
Семейства консервативных аминокислотных замещений.
Семейство	Аминокислоты
Неполярные	Trp, Phe, Met, Leu, Ile, Val, Ala, Pro
Незаряженные полярные	Gly, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys
Кислотные/отрицательно заряженные	Asp, Glu
Основные/положительно заряженные	Arg, Lys, His
Бета-разветвленные	Thr, Val, Ile
Остатки, влияющие на ориентацию цепи	Gly, Pro
Ароматические	Trp, Tyr, Phe, His

Подробное описание настоящего изобретения

В отличие от предшествующих разработок в настоящем изобретении было установлено, что анти-IFNAR1 антитела с пониженной или усеченной эффекторной функцией желательны для лечения хронических аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний. Ранее были разработаны антитела, направленные против IFNAR1, при этом имели ввиду, что эффекторная функция может играть роль в опосредовании лечения или по меньшей мере в смягчении состояния при хроническом аутоиммунном и/или воспалительном заболевании (см., например, публикации US 20060029601 или РСТ WO 06002177). Согласно этой концепции многие предшествующие разработки были направлены на идентификацию анти-IFNAR1 антител с сильной эффекторной функцией и на дальнейшее повышение эффекторной функции путем повышения сродства антитела с рецепторами Fc (например, FcRn, FcγRIIIa, FcγRIIb) и/или белком комплемента C1q. Сложилось мнение, что такие полученные в результате анти-IFNAR1 антитела с повышенной эффекторной функцией полезны при лечении указанных болезненных состояний.

В отличие от такого сложившегося ранее мнения настоящее изобретение описывает анти-IFNAR1 антитела с пониженной или усеченной эффекторной функцией (например, цитотоксичностью ADCC и/или CDC). Через исследования тканевой перекрестной реакционной способности неожиданно было установлено, что анти-IFNAR1 антитела с сильной или повышенной эффекторной функцией проявляют предрасположенность к нежелательной токсичности из-за преобладания окрашивания анти-IFNAR1 на тканях, не являющихся мишенями. Такая токсичность может возникнуть из неспецифической активации ADCC и/или CDC по несоответствующим сайтам. Для снижения или элиминации такой нежелательной токсичности была установлена необходимость снижения эффекторной функции полипептидов, включающих область Fc.

Таким образом, один из объектов настоящего изобретения охватывает модифицированные антитела или другие полипептиды, включающие область Fc антитела, содержащую вставку, замещение или делецию по меньшей мере одного аминокислотного остатка области Fc, что приводит к пониженному или усеченному сродству в отношении по меньшей мере одного лиганда Fc (обозначаемые в настоящем изобретении «модифицированными антителами по настоящему изобретению», «модифицированными антителами» или «антителами по настоящему изобретению»). Область Fc взаимодействует с рядом лигандов, включая, но ими не ограничиваясь, рецепторы Fc (например, FcRn, FcγRIIIa, FcγRIIb), белок комплемента C1q и другие молекулы, например, белки А и