Диагностика и лечение злокачественных опухолей поджелудочной железы, яичников и других злокачественных опухолей

Диагностика и лечение злокачественных опухолей поджелудочной железы, яичников и других злокачественных опухолей

Реферат

Родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США, номер 61/044457, поданной 11 апреля 2008, полное содержание которой приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Предпосылки создания изобретения

CD70 является представителем семейства фактора некроза опухоли (TNF), мембраносвязанных и секретируемых молекул, которые экспрессируются множеством нормальных и малигнизированных типов клеток. CD70 представляет собой трансмембранный белок типа II с C-концом, экспонированным наружу клеток, и с N-концом, на обращенной к цитозолю стороне плазматической мембраны (Bowman et al., 1994, J. Immunol. 152:1756-61; Goodwin et al., 1993, Cell 73:447-56). CD70 человека содержит цитоплазматический домен из 20 аминокислот, трансмембранный домен из 18 аминокислот и внеклеточный домен из 155 аминокислот с двумя вероятными участками N-связанного гликозилирования (Bowman et al., выше; Goodwin et al., выше). С помощью специфической иммунопреципитации меченных радиоактивным изотопом CD70-экспрессирующих клеток посредством антител против CD70 получают полипептиды размером 29 и 50 кДа (Goodwin et al., выше; Hintzen et al., 1994, J. Immunol. 152:1762-73). На основании гомологии с TNF-альфа и TNF-бета, была спрогнозирована тримерная структура CD70 (Petsch et al., 1995, Mol. Immunol. 32:761-72).

CD70 обладает ограниченной экспрессией в нормальных тканях человека. Это делает CD70 привлекательной мишенью для терапии рака. Однако экспрессия CD70 была идентифицирована лишь у небольшого числа злокачественных опухолей, таких как почечно-клеточная карцинома, злокачественная опухоль ободочной кишки, определенные типы неходжкинской лимфомы и множественная миелома. Экспрессию CD70 на клетках злокачественных опухолей, как правило, обнаруживают с помощью антител, которые связываются с нативным CD70, например, посредством иммуногистохимии. Доказано, что обнаружение экспрессии CD70 на фиксированных образцах, полученных у пациентов, затруднено из-за плохого качества антител, у которых отсутствует достаточная специфичность в отношении CD70. В частности, перекрестная реактивность и фоновое окрашивание мешают обнаружению CD70 в фиксированных образцах. Настоящее изобретение решает эту и другие трудности.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к способам диагностики, прогнозирования, профилактики и лечения, и контроля лечения злокачественных опухолей яичников, поджелудочной железы, и других злокачественных опухолей с использованием антител против CD70. Кроме того, изобретение относится к способам диагностики, прогнозирования, профилактики и лечения, и контроля лечения рака легких, головы и шеи (гортань или глотка), меланомы, глиобластомы, множественной миеломы, ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, такой как фолликулярная лимфома, почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточную карциному и папиллярную карциному, карциномы ободочной и прямой кишки и мочевого пузыря.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу, которое специфически связывает денатурированный CD70 по сравнению с нативным CD70. В некоторых вариантах осуществления антитело специфически связывает денатурированный CD70 на фиксированной линии клеток злокачественной опухоли яичников SK-OV-3 или поджелудочной железы PANC-1 по сравнению с нативным CD70. Антитело может представлять собой моноклональное антитело, такое как химерное, гуманизированное антитело или антитело человека. Предпочтительно, антитело связывает денатурированный CD70 на фиксированных формалином погруженных в парафин клетках или тканях со специфическим связыванием, таким же или лучше, чем у антитела SG-21.1C1, продуцируемого гибридомой, депонированной в ATCC и с присвоенным инвентарным No. PTA-8733, или у антитела SG-21.5D12, продуцируемое гибридомой, депонированной в ATCC и с присвоенным инвентарным No. PTA-8734. В частности, неспецифическая перекрестная реактивность антитела меньше, чем у антитела SG-21.1C1 или антитела SG-21.5D12. В некоторых вариантах осуществления антитело может конкурировать за специфическое связывание с денатурированным CD70 с антителом SG-21.1C1 или с антителом SG-21.5D12.

В другом аспекте изобретение относится к диагностическому набору, содержащему антитело, которое специфически связывает денатурированный CD70 по сравнению с нативным CD70. В связанном аспекте изобретение относится к способу обнаружения экспрессии CD70 в образце ткани, взятом у пациента. Образец ткани может быть получен из поджелудочной железы, яичников, легкого, гортани, глотки, молочной железы, почки, мозга, ободочной кишки, крови или кожи пациента. Ткань является фиксированной, а белок CD70 является денатурированным. Фиксированный образец ткани приводят в контакт с антителом, которое специфически связывает денатурированный CD70 по сравнению с нативным CD70, и обнаруживают связывание антитела с фиксированным образцом ткани для определения того экспрессируется ли CD70 в образце. Экспрессия CD70 на фиксированном образце ткани указывает на вероятность наличия экспрессирующей CD70 злокачественной опухоли у пациента. В некоторых вариантах осуществления образец фиксируют формалином и погружают в парафин.

В другом аспекте изобретения относится к способу диагностики, прогнозирования, определения способа лечения или контроля лечения пациента со злокачественной опухолью поджелудочной железы, яичников, легкого, гортани, глотки, молочной железы или кожи. Способ включает определение экспрессии CD70 в клетках в образце поджелудочной железы, яичников, легкого, гортани, глотки, молочной железы пациента или кожи пациента, где наличие обнаруживаемой экспрессии CD70 используют для диагностики, прогнозирования, определения способа лечения или контроля лечения пациента. Образец может представлять собой фиксированный формалином погруженный в парафин образец. Кроме того, способ может включать введение эффективного количества антитела против CD70 или конъюгата “антитело против CD70-лекарственное средство” пациенту, если на стадии определения обнаружен детектируемый уровень CD70.

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу лечения CD70-позитивных злокачественных опухолей. Способ включает введение эффективного количества средства, связывающего CD70, пациенту со злокачественной опухолью поджелудочной железы, яичников, легкого, гортани, глотки, молочной железы или кожи, обладающей детектируемой экспрессией CD70, где связывающее средство представляет собой антитело, производное антитела или конъюгата “антитело-лекарственное средство”. Антитело может обладать эффекторной функцией. Ранее пациент мог быть подвергнут хирургическому лечению, получать лучевую и/или химиотерапию средством, не направленным на CD70, без индукции ремиссии злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой химерное, гуманизированное антитело или антитело человека, такое как химерная или гуманизированная форма моноклонального антитела 1F6 или 2F2. Конъюгат “антитело-лекарственное средство” может содержать цитотоксическое средство, такое как антитубулиновое средство, связывающее малую бороздку ДНК средство или алкилирующее малую бороздку ДНК средство. Антитело в конъюгате “антитело-лекарственное средство” можно конъюгировать с цитотоксическим или цитостатическим средством посредством линкера, такого линкера, который расщепляется во внутриклеточных условиях.

В соответствии с другим аспектом комбинированный диагностический и фармацевтический набор содержит антитело, которое специфически связывает денатурированный CD70, для применения в диагностике и антитело, которое специфически связывает внеклеточный домен нативного CD70, для применения в терапии.

Аспекты изобретения будут более понятны со ссылкой на следующее ниже подробное описание, проиллюстрированное вариантами осуществления, сопровождающимися рисунками, фигурами и таблицами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фигуре 1 показан Вестерн-блот экстрактов белка с использованием антител SG-21.1C1 и SG-21.5D12 для обнаружения денатурированного CD70 в экстрактах белка из трансфицированных клеток 786-О, 293F:CD70 и нетрансфицированных клеток 293F.

На фигуре 2 показана экспрессия белка CD70 на фиксированной формалином погруженной в парафин (FFPE) линии клеток поджелудочной железы PANC-1 с использованием антитела SG21.1C1.

На фигуре 3 показана экспрессия белка CD70 в линиях клеток яичников Ovcar-3, SK-OV-3, Ca-Ov-3 и TOV-21G с использованием антитела SG21.1C1.

На фигуре 4 показана экспрессия белка CD70 в образцах опухоли поджелудочной железы, как было обнаружено посредством антител SG-21.1C1 или SG-21.5D12 по сравнению с контрольным mIgG.

На фигуре 5 показана экспрессия белка CD70 на клетках нормальной поджелудочной железы и клетках опухоли поджелудочной железы, как было обнаружено посредством антитела SG-21.1C1 с использованием хромогена быстрого красного (более темная окраска).

На фигуре 6 показана оценка экспрессии белка CD70 в клетках злокачественной опухоли поджелудочной железы. По x-оси указана интенсивность окраски CD70, а по y-оси указан процент площади, являющийся CD70-положительным.

На фигуре 7 показана оценка экспрессии белка CD70 в опухолях яичников. По x-оси указана интенсивность окраски CD70, а по y-оси указан процент площади, являющийся CD70-положительным.

На фигуре 8 показана оценка цитотоксической активности in vitro различных конъюгатов гуманизированного антитела 1F6 с лекарственными средствами против линии клеток злокачественной опухоли яичника, SKOV-3.

На фигурах 9A-C показаны оценки цитотоксической активности in vitro конъюгата гуманизированного антитела 1F6 с лекарственным средством на следующих линиях клеток: (A) CD70-трансфицированная линия клеток поджелудочной железы, HPAFII; (B) трансфицированная CD70 линия клеток поджелудочной железы PANC-1; и (C) трансфицированная CD70 линия клеток MiaPaCa-2.

На фигуре 10 показана оценка эффективности in vivo конъюгата гуманизированного антитела 1F6 с лекарственным средством для CD70-трансфицированных опухолях-карциномах поджелудочной железы MiaPaCa у мышей nude.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не указано другого, следующие термины и фразы, как используется в настоящем документе, обозначают следующее.

Термин «антитело» относится к (a) иммуноглобулиновым полипептидам и иммунологически активным частям иммуноглобулиновых полипептидов, т.е., полипептидам семейства иммуноглобулинов или их фрагментам, содержащим антигенсвязывающий участок, который иммуноспецифически связывает специфический антиген (например, CD70), или (b) обладающим консервативными заменами производным таких иммуноглобулиновых полипептидов или фрагментов, которые иммуноспецифически связывают антиген (например, CD70). Антитела в общем описаны, например, в Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Если из контекста не очевидно иначе, ссылка на антитело включает также производные или конъюгаты “антитело-лекарственное средство”, как более подробно описано ниже.

«Производное антитела» обозначает антитело, как определено выше, модифицированное ковалентным присоединением гетерологичной молекулы, например, таким как присоединение гетерологичного полипептида, или гликозилированием, дегликозилированием, ацетилированием или фосфорилированием, в норме не связанным с антителом, и тому подобное.

Термин «моноклональные антитело» относится к антителу, полученному из отдельного клона клеток, включая любой клон эукариотических или прокариотических клеток, или фаговый клон, а не к способу, которым оно получено. Таким образом, термин «моноклональное антитело» не ограничено антителами, полученными гибридными технологиями.

«Антиген» представляет собой частицу, с которой специфически связывается антитело.

Термин «ингибировать» или «ингибирование» означает уменьшение поддающегося измерению количества, или полное предотвращение.

Термин «средство» обозначает элемент, соединение, или молекулярную частицу, включая, например, фармацевтическое, терапевтическое или фармакологическое соединение. Средства могут представлять собой природные или синтетические средства или их сочетание. «Лекарственное средство» представляет собой средство, оказывающее терапевтический (например, благоприятный) эффект на клетки злокачественных опухолей, либо отдельно, либо в сочетании с другим средством (например, превращающий пролекарство фермент в сочетании с пролекарством). Как правило, лекарственные средства, применимые в соответствии со способами и композициями, описанными в настоящем документе, представляют собой средства, оказывающие цитотоксический или цитостатический эффект.

«Цитотоксический эффект», по отношению к эффекту средства на клетки, означает клеточную гибель.

«Цитостатический эффект» означает ингибирование пролиферации клетки.

«Цитотоксическое средство» обозначает средство, которое оказывает цитотоксический или цитостатический эффект на клетку, таким образом, соответственно, истощая клетки или ингибируя рост клеток внутри популяции клеток.

Термин «истощать», в контексте эффекта антитела против CD70 на CD70-экспрессирующие клетки, относится к уменьшению количества или разрушению CD70-экспрессирующих клеток.

Термин «функциональный», в контексте антитела против CD70 или его производного, используемого согласно способам, описанным в настоящем документе, обозначает, что антитело или его производное (1) способно связывать CD70 и/или (2) истощает или ингибирует пролиферацию CD70-экспрессирующих клеток отдельно или при конъюгации с цитотоксическим средством.

Термин «профилактика» относится к введению конъюгата антитело против конъюгата “CD70-лекарственное средство” (ADC) или производного ADC индивиду до проявления клинического или диагностического симптома CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли (например, к введению индивидууму с предрасположенностью или с высоким риском возникновения злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичников) для (a) блокирования возникновения или проявления CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли, или одного или нескольких из ее клинических или диагностических симптомов, (b) ингибирования тяжести проявления CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли, или (c) уменьшения вероятности проявления CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли.

Термины «лечение» или «лечить» относятся к замедлению, остановке или обращению прогрессирования CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли у пациента, как доказывают по уменьшению или прекращению клинического или диагностического симптома заболевания, посредством введения антитела против CD70, конъюгата “антитело-лекарственное средство” или производного ADC индивиду после проявления клинического или диагностического симптома CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли на любой клинической стадии. Лечение может включать, например, уменьшение тяжести симптома, количества симптомов или частоты обострений.

Термин «фармацевтически приемлемый» обозначает одобренный регулирующим органом федерального или государственного правительства или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применении у животных, и более конкретно, у человека.

Термин «фармацевтически совместимый ингредиент» относится к фармацевтически приемлемому разбавителю, адъюванту, наполнителю или носителю вместе с которым вводят антитело против CD70.

Термин «эффективное количество», в контексте введения фармацевтического средства, относится к количеству средства, достаточному для ингибирования возникновения или облегчения одного или нескольких клинических или диагностических симптомов CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичника у пациента. Эффективное количество средства вводят согласно способам, описанным в настоящем документе, в «эффективном режиме». Термин «эффективный режим» относится к сочетанию количества средства и частоты дозирования, адекватному для достижения лечения CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли.

Термин «пациент» включает людей и других млекопитающих, получающих диагностическое, профилактическое или терапевтическое лечение.

Аббревиатура «AFP» обозначает диметилвалин-валин-долаизолейин-долапроин-фенилаланин-п-фенилендиамин.

Аббревиатура «MMAE» обозначает монометилауристатин E.

Аббревиатура «AEB» обозначает сложный эфир, полученный реакцией ауристатина E с пара-ацетилбензойной кислотой.

Аббревиатура «AEVB» обозначает сложный эфир, полученный реакцией ауристатина E с бензоилвалериановой кислотой.

Аббревиатура «MMAF» обозначает довалин-валин-долаизолейнин-долапроин-фенилаланин.

Аббревиатуры «fk» и «phe-lys» означают дипептид фенилаланин-лизин.

Аббревиатуры «vc» и «val-cit» обозначают дипептид валин-цитруллин.

Лекарственные средства как правило, являются по существу чистыми от нежелательных загрязнителей. Это означает, что средство, как правило, обладает чистотой по меньшей мере приблизительно 50% масс./масс. (масса/масса), так же как является по существу свободным от связанных белков и загрязнителей. Иногда средства обладают чистотой по меньшей мере приблизительно 80% масс./масс. и, более предпочтительно по меньшей мере 90 или приблизительно 95% масс./масс. Однако с использованием общепринятых способов очистки белка можно получать гомогенные пептиды чистотой по меньшей мере 99% масс./масс.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Общее

Изобретение относится к способам диагностики, прогнозирования, профилактики и лечения, и контроля лечения злокачественных опухолей поджелудочной железы яичников и поджелудочной железы с использованием антител против CD70. Кроме того, изобретение относится к способам диагностики, прогнозирования, профилактики и лечения, и контроля лечения рака легкого, головы и шеи (гортань или глотка), меланомы, глиобластомы, множественной миеломы, ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, такой как фолликулярная лимфома, почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточную карциному и папиллярную карциному, карциномы ободочной и прямой кишки и мочевого пузыря. Способы частично основаны на результатах, представленных в разделе “Примеры”, указывающих на повышенные уровню экспрессии CD70 в конкретных злокачественных опухолях. Повышенную экспрессию обнаруживали в фиксированных формалином погруженных в парафин (FFPE) образцах тканей злокачественных опухолей яичников и поджелудочной железы с использованием антител, которые специфически связывают денатурированный CD70. Кроме того, повышенную экспрессию CD70 обнаруживали также в фиксированных формалином погруженных в парафин (FFPE) образцах тканей других злокачественных опухолей с использованием антител против денатурированного внеклеточного домена CD70.

Хотя осуществление изобретения на практике не зависит от знания механизма, считают, что успех обнаружения CD70 в FFPE образцах тканей яичников и поджелудочной железы в частности, и других злокачественных опухолей в общем, принадлежит к использованию антител, которые предпочтительно связывают денатурированный CD70 в таких образцах по сравнению с нативным CD70. Хотя частота детектируемого CD70 в злокачественных опухолях яичников и поджелудочной железы и/или его уровень не настолько высоки, как в некоторых других злокачественных опухолей, с которыми ранее связывали CD70, они являются очень специфичными для ткани злокачественной опухоли по сравнению с нормальной тканью. Таким образом, у пациентов обладающих злокачественной опухолью яичников или злокачественной опухолью поджелудочной железы, в которых детектируется CD70, CD70 представляет собой крайне эффективную мишень для избирательно направленной токсичности на клетки злокачественных опухолей. Подобным образом, для пациентов с другими злокачественными опухолями (например, опухолями легкого, головы и шеи (гортань или глотка), меланомой, глиобластомой, множественной миеломой, ходжкинской лимфомой, неходжкинской лимфомой, такой как фолликулярная лимфома, почечно-клеточной карциномой, включая светлоклеточную карциному и папиллярную карциному, карциномами ободочной и прямой кишки и мочевого пузыря), настоящее изобретение относится к простому способу обнаружения экспрессии CD70 в фиксированных образцах, полученных у пациентов.

II. Антитела против CD70

В следующем ниже описании сначала рассматривают свойства антител против CD70, которые можно использовать для обнаружения CD70 в злокачественных опухолях яичников и поджелудочной железы и их лечения, и затем подробно описывают предпочтительные свойства антител для соответствующих вариантов использования.

A. Общее описание антител против CD70

Как правило, антитела против CD70 включают моноклональные, химерные (например, содержащие константную область человека и вариабельную область мыши), гуманизированные, замаскированные антитела или антитела человека; одноцепочечные антитела или тому подобное. Молекулы иммуноглобулинов могут принадлежать любому типу или классу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY) или подклассу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2).

Антитела против CD70 могут представлять собой антигенсвязывающий фрагмент антитела, такой как Fab, F(ab'), F(ab')₂, цепь Fd, одноцепочечный Fv (scFv), одноцепочечное антитело, Fv с дисульфидными связями (sdFv), фрагмент, содержащий либо V_L, либо V_H домен, включая наноантитела или фрагменты из верблюдов, лам или тому подобное, или фрагменты, полученные посредством экспрессирующей библиотеки Fab, или CD70-связывающие фрагменты любого из вышеупомянутых антител, описанных выше. Антигенсвязывающие фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела, могут содержать вариабельную область(области) отдельно или в сочетании с целым или частью из следующего: шарнирная область, CH1, CH2, CH3 и CL домены. Кроме того, антигенсвязывющие фрагменты могут содержать любую комбинацию вариабельной области(областей) с шарнирной областью, CH1, CH2, CH3 и CL доменами. Как правило, антитела являются антителами человека, грызунов (например, мыши и крысы), осла, овцы, кролика, козы, морской свинки, верблюдовых, лошади или курицы.

Антитела могут быть моноспецифическими, биспецифическими, триспецифическими или обладать большей специфичностью (мультиспецифические). Мультиспецифические антитела могут быть специфическими для различных эпитопов CD70 или могут быть специфическими для CD70, а так же для гетерологичного белка. (См., например, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; патент США No. 4474893; 4714681; 4925648; 5573920; и 5601819; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553.) Мультиспецифические антитела, включая биспецифические и триспецифические антитела, которые можно использовать в практике способов, описанных в настоящем документе, представляют собой антитела, которые иммуноспецифически связываются как с CD70, так и со вторым рецептором или рецепторным комплексом на поверхности клеток, например, представителем суперсемейства генов иммуноглобулинов, представителем суперсемейства рецепторов TNF, интегрином, рецептором цитокинов, рецептором хемокинов, белком главного комплекса гистосовместимости, лектином (C-типа, S-типа или I-типа) или белком контроля комплемента.

Антитела против CD70 также можно охарактеризовать по их аффинности связывания с CD70, равной 10^-7 M, 5×10^-8 M, 10^-8 M, 5×10^-9 M, 10^-9 M, 5×10^-10 M, 10^-10 M, 5×10^-11 M, 10^-11 M, 5×10^-12 M, 10^-12 M, 5×10^-13 M, 10^-13 M, 5×10^-14 M, 10^-14 M, 5×10^-15 M или 10^-15 M. Антитело против CD70 может представлять собой химерное антитело. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части антитела происходят из различных видов животных, например, антитело имеет вариабельную область, происходящую из моноклонального антитела мыши, и константную область иммуноглобулина человека. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области. (См., например, Morrison, Science, 1985, 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191- 202; Патенты США No. 5807715; 4816567; и 4816397.)

Антитело против CD70 также может представлять собой гуманизированное антитело, в том числе замаскированное антитело. Гуманизированные антитела представляют собой молекулы антитела, которые связывают желательный антиген и обладают одной или несколькими определяющими комплементарность областями (CDR) из не относящихся к человеку видов, и каркасом и константными областями из иммуноглобулиновой молекулы человека. Часто каркасные остатки в каркасных областях человека можно заменять соответствующим остатком из CDR донорного антитела для изменения или, предпочтительно, улучшения связывания антигена. Такие замены в каркасе идентифицируют способами, хорошо известными в данной области, например, посредством моделирования взаимодействий CDR и остатков каркаса для идентификации остатков каркаса, важных для связывания антигена, и сравнения последовательностей для идентификации необычных остатков каркаса в конкретных положениях. (См., например, Queen et al., Патент США No. 5585089; Riecbmann et al., 1988, Nature 332:323.) Антитела можно гуманизировать с использованием множества способов, известных в данной области, таких как CDR-прививка (EP 0239400; WO 91/09967; патенты США No. 5225539; 5530101; и 5585089), маскировка или ремоделирование поверхности (EP 0592106; EP 0519596; Padlan, Molecular Immunology, 1991, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973) и перетасовка цепей (патент США No. 5565332) (содержание всех из этих ссылок приведено в настоящем документе в качестве ссылки).

Антитело против CD70 может также представлять собой антитело человека. Антитела человека можно получать множеством способов, известных в данной области, такими как способы фагового дисплея (см. выше) с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей иммуноглобулинов человека. См. также, например, патенты США No. 4444887 и 4716111; WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741. Кроме того, антитело человека, распознающее выбранный эпитоп, можно получать с использованием способа, обозначенного как «направленная селекция», в котором не относящееся к человеку моноклональное антитело, например, антитело мыши, используют для направления отбора полностью человеческого антитела, распознающего тот же самый эпитоп (см., например, Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903). Антитела человека можно получать также с использованием трансгенных мышей, экспрессирующих гены иммуноглобулинов человека. Моноклональные антитела, направленные против антигена, можно получать из иммунизированных трансгенных мышей с использованием способа гибридом. Обзор способов для получения антител человека см. в Lonberg and Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93. Подробное обсуждение этого способа для получения антител человека и моноклональных антител человека и способы для получения таких антител см., например, в публикациях PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Европейском патенте No. 0 598 877; и патентах США No. 5413923; 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771; и 5939598.

Антитела можно анализировать по специфическому связыванию с CD70 известными способами, например, такими как системы конкурентного и не конкурентного иммуноанализа с использованием таких способов, как Вестерн-блоттинг, радиоиммунный анализ, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), «сэндвич» иммуноанализы, анализы иммунопреципитации, реакции с преципитином, реакции с преципитином и диффузией в геле, анализы иммунодиффузии, реакции агглютинации, анализы связывания комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы, иммуноанализы с белком A. (См., например, Ausubel et al., eds., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 4th ed. 1999); Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999.)

Кроме того, аффинность связывания антитела против CD70 и скорость диссоциации для взаимодействия антитела-CD70 можно определять анализами конкурентного связывания. Одним примером анализа конкурентного связывания является радиоиммунный анализ, включающий инкубацию меченного CD70 (например, ³H или ¹²⁵I) с интересующим антителом в присутствии увеличивающихся количеств немеченого CD70 и обнаружение антитела, связанного с меченым CD70. Затем аффинность антитела против CD70 и скорости диссоциации для связывания можно определять из данных посредством анализа графика Скэтчарда. Конкуренцию с вторым антителом можно также определять с использованием радиоиммунных анализов. В этом случае, CD70 инкубируют с интересующим антителом, конъюгированным с меченным соединением (например, ³H или ¹²⁵I) в присутствии увеличивающихся количеств немеченого второго антитела. Альтернативно, аффинность связывания антитела с CD70 и скорости связывания и диссоциации для взаимодействия антитело-CD70 можно определять посредством поверхностного плазмонного резонанса.

Антитела можно получать по антиген-содержащим фрагментам белка CD70 общепринятыми способами в соответствии с типом антитела (см., например, Kohler, et al., Nature, 256:495, (1975); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H.P., NY, 1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) и WO 90/07861; Dower et al., WO 91/17271 и McCafferty et al., WO 92/01047 (содержание каждого из которых приведено в качестве ссылки для всех целей). В качестве примера, моноклональные антитела можно получать с использованием широкого ряда способов, включая, например, использование способа гибридом, рекомбинантных способов и способов фагового дисплея. Способы гибридомы в общих чертах обсуждают, например, в Harlow et al., выше, и Hammerling, et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). Примеры способов фагового дисплея, которые можно использовать для получения антител против CD70, включают, например, способы, описанные в Briinnan et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; заявке PCT No. PCT/GB91/01 134; Публикациях PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; и патентах США No. 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 и 5969108 (описания которых приведены в настоящем документе в качестве ссылки).

Способы получения фрагментов антител, распознающих специфические эпитопы, также являются общеизвестными в данной области. Например, фрагменты Fab и F(ab')₂ можно получать протеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулинов с использованием ферментов, таких как папаин (для получения фрагментов Fab) или пепсин (для получения фрагментов F(ab')₂). F(ab')₂ фрагменты содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и домен C_H1 тяжелой цепи. Можно применять также способы рекомбинантного получения фрагментов Fab, Fab' и F(ab')₂ с использованием, например, способов, описанных в WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; и Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; и Better et al., 1988, Science 240:1041-1043 (описания которых приведены в настоящем документе в качестве ссылки).

Примеры способов, которые можно использовать для получения одноцепочечных Fv и антител, включают способы, описанные в патентах США No. 4946778 и 5258498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999; и Skerra et al., 1988, Science 240:1038-1040.

Антитела против CD70 и их производные, используемые в настоящих способах, можно получать также способами рекомбинантной экспрессии. Для рекомбинантной экспрессии антитела или его производного, которое связывает CD70 и/или вызывает истощение или ингибирование пролиферации CD70-экспрессирующих клеток, необходимо конструирование экспрессирующего вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его производное. После получения нуклеиновой кислоты, кодирующей такой белок, вектор для продукции молекулы белка можно получать посредством технологии рекомбинантной ДНК с использованием способов, хорошо известных в данной области. Общепринятые способы, такие как описанные в Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 3rd ed., 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2nd ed., 1989); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 4th ed., 1999); и Glick & Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles и Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D. C, 2nd ed., 1998), можно использовать для способов рекомбинантных нуклеиновых кислот, синтеза нуклеиновых кислот, культивирования клеток, введения трансгенов и экспрессии рекомбинантного белка.

Например, для рекомбинантной экспрессии антитела против CD70 экспрессирующий вектор может кодировать его тяжелую или легкую цепь, или вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, функционально связанный с промотором. Экспрессирующий вектор может включать, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область молекулы антитела (см., например, WO 86/05807; WO 89/01036; и патент США No. 5122464), и вариабельный домен антитела можно клонировать в такой вектор для экспрессии полной тяжелой или легкой цепи. Экспрессирующий вектор переносят в клетку-хозяина известными способами, и затем трансфицированные клетки культивируют для продукции антитела против CD70. Как правило, для экспрессии двухцепочечных антител, векторы, кодирующие как тяжелую, так и легкую цепи, можно совместно экспрессировать в клетке-хозяине для экспрессии целой иммуноглобулиновой молекулы.

Множество прокариотических и эукариотических систем хозяин-экспрессирующий вектор можно использовать для экспрессии антитела против CD70 или его производного. Как правило, эукариотические клетки, в частности, для полного рекомбинантного антитела против молекул CD70, используют для экспрессии рекомбинантного белка. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомяка (CHO) (например, DG44 или CHO-S) в сочетании с вектором, таким как промоторный элемент главного средне-раннего гена цитомегаловируса человека или промотор EF-1α яичника китайского хомяка, представляют собой эффективную систему экспрессии для получения антител против CD70 и их производных (см., например, Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2; Allison, патент США No. 5888809).

Другие системы хозяина-экспрессии включают системы экспрессии на основе плазмид в бактериальных клетках (см., например, Ruther et al., 1983, EMBO 1,2:1791; Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acid Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); системы насекомых, такие как использование экспрессирующего вектора из вируса ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) в клетках Spodoptera frugiperda; и системы экспрессии на основе вирусов в клетках млекопитающих, такие как системы на основе аденовирусов (см., например, Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359; Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol 153:51-544).

B. Антитела для детекции CD70

Отбор антител против CD70 для применения в способах детекции зависит от того, детектируют ли CD70 способом, требующим детекции денатурированного CD70 или нативного CD70 (как экспрессируется на клетках). В таких способах, как Вестерн-блоттинг или иммуногистохимическая детекция, в которых CD70-мишень является денатурированным, является предпочтительным использование антитела, которое связывает CD70 в денатурированной форме (например, CD70 человека или яванского макака). Как правило, такие антитела предпочтительно связывают денатурированную форму по сравнению с нативной формой (т.е., CD70 как он существует в природе или при выделении без подвергания воздействию денатурирующих условий, таких как растворители, детергенты или повышенные температуры (например, выше 50°C)). Такие антитела можно стимулировать с использованием денатурированного иммуногена CD70 (например, CD70 человека или яванского макака) или его иммуногенного фрагмента из внеклеточной части. Денатурацию можно вызывать обработкой иммуногена SDS (например, 0,5%) и, необязательно, нагреванием вплоть до 80°C. Денатурацию можно также просто вызывать элюцией иммуногена из геля с SDS, используемого для очистки иммуногена. Альтернативно, антитела, предпочтительно связывающие денатурированный CD70, можно получать с использованием синтетических пептидов из внеклеточного домена CD70 в качестве иммуногенов. Некоторые из таких пептидов являются слишком короткими для сохранения конформации соответствующего фрагмента нативного пептида. Синтетические пептиды могут присутствовать, но обычно не требуют денатурации для использования в качестве иммуногена.

Проводят скрининг антител, полученных этими или другими способами по предпочтительному связыванию с денатурированным CD70 по сравнению с нативным CD70. Денатурированный и нативный антиген CD70 можно анализировать посредством одного и того же анализа или различных анализов. В частности, при использовании последнего способа, скрининг можно проводить с контрольным антитело