Живые аттенуированные вакцины

Живые аттенуированные вакцины

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственную заявку

Эта заявка заявляет преимущество Австралийской предварительной заявки на патент № 2009900736, поданной 20 февраля 2009 года, которая включена здесь посредством ссылки в ее полном виде.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к получению живых аттенуированных бактерий, которые продолжают сохраняться в субъекте, для применения в вакцинных композициях. В частности, данное изобретение относится к удалению функции по меньшей мере одного АВС-транспортерного белка бактерии для получения аттенуированной бактерии, которая продолжает существовать в субъекте и может быть использована в вакцинной композиции.

Уровень техники

Бактериальные инфекции вызывают существенные экономические потери в животноводстве вследствие заболеваемости и смертности и оказывают существенное влияние на здоровье человека. В частности, респираторные инфекции и септицемии являются обычными инфекционными заболеваниями, которые могут распространяться в группе животных или людей (субъектов) и отрицательно влиять на здоровье этих субъектов. Это может приводить к существенным потерям продуктивности и, в конечном счете, к смерти этих субъектов. Например, патогенные бактерии, в частности, рода Mycoplasma, являются существенной причиной респираторного заболевания. Септицемия обычно вызывается E. coli.

Известно, что вакцинные композиции, содержащие аттенуированные патогенные микроорганизмы, такие как бактерии и вирусы, являются эффективными в продуцировании защитной иммунной реакции в вакцинированных животных и людях. Такие живые аттенуированные вакцины являются предпочтительными, так как после иммунизации последующее заражение патогенным организмом, на котором основана эта вакцина, приводит к быстрой повторной стимуляции иммунной реакции, первоначально индуцированной этой вакцинацией. Это вызывает ингибирование пролиферации этого патогена и предотвращает развитие клинически релевантного заболевания.

Как правило, аттенуирование патогенных организмов для использования в вакцине достигается полным или частичным удалением одного или нескольких факторов вирулентности, так что этот организм уже не является патогенным. Факторы вирулентности обычно известны как свойства, которые непосредственно вызывают заболевание и/или позволяют этому организму персистировать в хозяине. Свойства, которые усиливают вредные реакции хозяина, также обычно известны как факторы вирулентности. Типичные факторы вирулентности включают, например, токсины, прикрепляющие органеллы и механизмы иммунной инвазии. Это создает проблему, заключающуюся в том, что многие факторы вирулентности участвуют в индуцировании иммунитета, и, следовательно, удаление факторов вирулентности ухудшает иммуногенность организма, аттенуированного таким образом. Живая аттенуированная вакцина выгодным образом остается антигенной и, следовательно, способна индуцировать достаточный уровень иммунитета хозяина, будучи непатогенной. Обычно, живые аттенуированные вакцины не сохраняются в субъекте, и это может способствовать уменьшению иммуногенности живого аттенуированного организма, на котором основана эта вакцина.

Хотя некоторые факторы вирулентности, такие как токсины, являются очевидными мишенями для аттенуации, факторы, неизвестные в качестве факторов вирулентности, не являются очевидными мишенями для аттенуации. Действия аттенуации этих факторов на вирулентность организма не являются легко очевидными или предсказуемыми. Члены суперсемейства АВС-транспортеров (АТФ-связывающей кассеты) обычно не считаются факторами вирулентности. АВС-транспортеры содержат мембранные белки, которые выполняют функцию транслокации субстратов через внеклеточные и внутриклеточные мембраны. Вещества, транспортируемые АВС-транспортерами, включают пептиды, олигопептиды, белки, метаболические продукты, липиды, стерины и лекарственные средства. Сравнение последовательностей АВС-транспортеров указывает на то, что гены и белки этого суперсемейства являются консервативными среди отдаленно родственных типов (филюмов).

Данное изобретение предсказано на основе неожиданного открытия, что потеря мутации функции гена АВС-транспортера в патогенных организмах, аттенуировала патогенные организмы, хотя аттенуированные организмы оставались иммуногенными и продолжали существовать в субъекте, как было оценено в модельной системе хозяин-заболевание.

Сущность изобретения

В первом аспекте обеспечена бактерия, аттенуированная мутацией по меньшей мере в одном гене АВС-транспортера, где мутация делает соответствующий АВС-транспортерный белок нефункциональным, причем аттенуированная бактерия продолжает существовать в субъекте.

Во втором аспекте обеспечен способ аттенуации бактерий, предусматривающий мутирование по меньшей мере одного гена АВС-транспортера, причем аттенуированная бактерия продолжает существовать в субъекте.

В третьем аспекте обеспечена иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере одну аттенуированную бактерию первого аспекта.

В четвертом аспекте обеспечена вакцинная композиция, содержащая эффективное количество по меньшей мере одной аттенуированной бактерии первого аспекта и фармацевтически приемлемый носитель.

В пятом аспекте обеспечено применение вакцинной композиции для лечения или профилактики заболевания, причем вакцинная композиция содержит по меньшей мере одну аттенуированную бактерию первого аспекта.

В шестом аспекте обеспечен способ предотвращения или устранения заболевания в субъекте, предусматривающий введение терапевтически эффективной дозы вакцинной композиции или иммуногенной композиции субъекту, причем вакцинная композиция или иммуногенная композиция содержит по меньшей мере одну аттенуированную бактерию первого аспекта.

В седьмом аспекте обеспечен способ профилактики заболевания, предусматривающий введение терапевтически эффективной дозы вакцинной композиции или иммуногенной композиции субъекту, нуждающемуся в профилактике, причем указанная вакцинная композиция или иммуногенная композиция содержит по меньшей мере одну аттенуированную бактерию первого аспекта.

В одном варианте осуществления мутация может быть генерирована инсерцией, делецией, заменой или любой их комбинацией. Инсерционная мутация может быть получена, например, гомологичной рекомбинацией, транспозонным мутагенезом и ST-мутагенезом с последовательностью-меткой.

В одном варианте осуществления ген АВС-транспортера может быть геном, кодирующим белок АВС-пептидного транспортера. Например, CvaB, CylB, SpaB, NisT, EpiT, ComA, PedD, LcnC, McbEF, OppD и DppD и их гомологи и, в частности, ген АВС-транспортера, могут кодировать OppD.

В одном варианте осуществления бактерия может быть выбрана из группы, состоящей из Avibacterium, Bacillus, Brucella, Bartonella, Bordetella, Burkholderia, Vibrio, Escherichia, Salmonella, Clostridium, Campylobacter, Chlamydia, Coxiella, Erysipelothrix, Francisella, Listeria, Actinobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Streptococcus, Shigella, Yersinia, Mycoplasma, Mycobacterium, Mannheimia, Ornithobacterium, Rickettsia, Ureaplasma и Pasteurella. В частности, аттенуированными бактериями могут быть Avibacterium paragallinarum, Bordetella avium, Ornithobacterium rhinotracheale, Salmonella enteritidis, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, E. coli, Clostridium perfringens, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma anatis, Mycoplasma anseris, Mycoplasma imitans, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma arginini, Ureaplasma parvum, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma californicum, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma dispar, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowae, большая колония и малая колония Mycoplasma mycoides subsp mycoides, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma pullorum, Mycoplasma alligatorus, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma maleagridis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum, Mycoplasma haematoparvum.

В одном варианте осуществления бактерией может быть птичий патогенный штамм E. coli Е956 или штамм Mycoplasma gallisepticum Ap3AS.

В одном варианте осуществления живая аттенуированная бактерия может экспрессировать гетерологичный антиген. Гетерологичный антиген может кодироваться нуклеиновой кислотой из другого патогенного организма. Нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичный антиген, может быть выделена из родов, выбранных из группы, включающей Avibacterium, Bacillus, Brucella, Bartonella, Bordetella, Burkholderia, Vibrio, Escherichia, Salmonella, Clostridium, Campylobacter, Chlamydia, Coxiella, Erysipelothrix, Francisella, Listeria, Actinobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Streptococcus, Shigella, Yersinia, Mycoplasma, Mycobacterium, Mannheimia, Ornithobacterium, Rickettsia, Staphylococci, Ureaplasma и Pasteurella. В частности, нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичный антиген, может быть получена из Avibacterium paragallinarum, Bordetella avium, Ornithobacterium rhinotracheale, Salmonella enteritidis, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, E. coli, Clostridium perfringens, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma gallisepticum или Mycoplasma synoviae, Avibacterium paragallinarum, Bordetella avium, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma anatis, Mycoplasma anseris, Mycoplasma imitans, Mycoplasma arginini, Ureaplasma parvum, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma californicum, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma dispar, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowae, большую колонию и малую колонию Mycoplasma mycoides subsp mycoides, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma pullorum, Mycoplasma alligatorus, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma, Mycoplasma maleagridis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum, Mycoplasma haematoparvum. Нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичный антиген, может быть выделена из вирусов, выбранных из группы, включающей вирус болезни Ньюкасл (псевдочумы птиц), вирус инфекционного бронхита, птичий пневмовирус, вирус оспы птиц, инфекционного бурсального заболевания, вирус инфекционного ларинготрахеита, птичьего гриппа, вирус гепатита уток, вирусной чумы уток, инфекционной куриной анемии, вирус болезни Марека.

Субъект представляет собой позвоночное животное, включающее людей, коровьих, собачьих, кошачьих, козлиных, овечьих, свиных, верблюдовых, лошадиных и птичьих. Субъектом коровьих может быть корова, бык, бизон или буйвол. Субъектом собачьих может быть собака. Субъектом кошачьих может быть кошка. Субъектом козлиных может быть коза. Субъектом овечьих может быть овца. Субъектом свиных может быть свинья. Субъектом верблюдовых может быть верблюд, дромадер, лама, альпака, викунья или гуанако. Субъектом лошадиных может быть лошадь, осел, зебра или мул. Субъектом птичьих может быть любой из выращенных коммерчески или домашних представителей семейства птичьих. В частности, субъектом птичьих может быть курица (в том числе карликовые куры бентамки), индейка, утка, гусь, фазан, перепел, куропатка, голубь, цесарка, африканский страус, эму или павлин.

Вакцинные композиции и иммуногенные композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, такой как вода, солевой раствор, культуральная жидкость, стабилизаторы, углеводы, белки, белоксодержащие агенты, такие как бычья сыворотка или обезжиренное молоко, и буферы или любую их комбинацию.

Стабилизатором может быть SPGA. Углеводы включают, например, сорбит, маннит, крахмал, сахарозу, глюкозу, декстран или их комбинации. Дополнительно, в качестве фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей могут быть использованы белки, такие как альбумин или казеин, или белоксодержащие агенты, такие как бычья сыворотка или обезжиренное молоко.

Буферы для применения в качестве фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей включают малеат, фосфат, CABS, пиперидин, глицин, цитрат, малат, формиат, сукцинат, ацетат, пропионат, пиперазин, пиридин, какодилат, сукцинат, MES, гистидин, бис-трис, фосфат, этаноламин, ADA, карбонат, ACES, PIPES, имидазол, BIS-TRIS пропан, BES, MOPS, HEPES, TES, MOPSO, MOBS, DIPSO, TAPSO, TEA, пирофосфат, HEPPSO, POPSO, трицин, гидразин, глицилглицин, TRIS, EPPS, бицин, HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, таурин, борат, CHES, глицин, гидроксид аммония, CAPSO, карбонат, метиламин, пиперазин, CAPS или любую их комбинацию.

Вакцинные композиции и иммуногенные композиции могут быть лиофилизированы или высушены замораживанием.

В некоторых вариантах осуществления вакцинные композиции и иммуногенные композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один адъювант. Примеры адъювантов включают полный адъювант Фрейнда или неполный адъювант Фрейнда, витамин Е, неионные блоксополимеры, мурамилдипептиды, сапонины, минеральное масло, растительное масло, гидроксид алюминия карбопол, фосфат алюминия, оксид алюминия, масляные эмульсии (например, Bayol F® или Marcol 52®), сапонины или солюбилизат витамина Е или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать адъюванты, применимые, в частности, для мукозного применения, например, термолабильный токсин E. coli или холерный токсин.

Вакцинная композиция или иммуногенная композиция может вводиться интраназально, офтальмически, внутрикожно, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, перорально, при помощи аэрозоля (спрей-вакцинация), через клоаку или внутримышечно. Введение в виде глазных капель или аэрозольное введение являются предпочтительными, когда субъектом является птица. Аэрозольное введение является особенно предпочтительным для введения вакцинной композиции или иммуногенной композиции большим количествам субъектов.

Иммуногенная композиция или вакцинная композиция может содержать по меньшей мере от приблизительно 10³ до приблизительно 10⁵ аттенуированных бактерий, или от приблизительно 10⁵ до приблизительно 10⁷ аттенуированных бактерий, или от приблизительно 10⁷ до приблизительно 10⁹ аттенуированных бактерий, или от приблизительно 10⁹ до приблизительно 10¹¹ аттенуированных бактерий, или от приблизительно 10¹¹ до приблизительно 10¹³ аттенуированных бактерий, или от приблизительно 10¹³ до приблизительно 10¹⁵ аттенуированных бактерий, или от приблизительно 10¹⁵ до приблизительно 10¹⁷ аттенуированных бактерий, или от приблизительно 10¹⁷ до приблизительно 10¹⁹, или по меньшей мере приблизительно 10¹⁹ аттенуированных бактерий на дозу.

Определения

В контексте этой заявки, единственная форма "a", "an" и "the" включает и множественные ссылки, если контекст не указывает явно другое. Например, термин "ABC-транспортер" включает также множество АВС-транспортеров.

В контексте этого описания, термин "содержащие" обозначает "включающие в основном, но необязательно только". Кроме того, вариации слова "содержащие", такие как "содержат" и "содержит", имеют соответственно варьирующиеся значения.

В данном контексте термин "иммуногенно эффективные" обозначает, что количество живых аттенуированных бактерий, вводимых при вакцинации или при введении иммуногенной композиции, является достаточным для индукции в этом субъекте эффективной иммунной реакции против вирулентных форм этой бактерии.

В данном контексте термины "лечение" и "обработка" относятся к любому или всем применениям, которые лечат состояние или симптомы, предотвращают возникновение состояния или заболевания или другим путем задерживают или замедляют прогрессирование состояния или заболевания или другие нежелательные симптомы любым каким бы то ни было путем.

В данном контексте термины "персистируют" и "персистирующий" относятся к установлению и/или сохранению инфекции или колонизации по меньшей мере части субъекта. Персистенция включает состояние, в котором организм выживает в тканях, независимо от того, воспроизводится он или не воспроизводится. Персистирующий организм может быть или может не быть ассоциирован с клинически релевантным заболеванием.

Краткое описание фигур

Фиг.1 является схематическим планом компонентов и экспериментального протокола. А. Основная структура меченного сигнатурой (определенной последовательностью) транспозона. B. Схема для экспериментов с меченным сигнатурой (определенной последовательностью) мутагенеза (STM).

Фиг.2. Детектирование конкретных меток. Бульонные культуры, обнаруживающие изменение окраски, подвергали скринингу при помощи ПЦР, использующей пару праймеров P2/P4, для детектирования индивидуальных сигнатурных меток. Каждую пробу подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле вместе с маркером размеров ДНК (pUC18, расщепленной HaeIII). Дорожка 1, ST-мутант, несущий метку Tag 02; Дорожка 2, ST-мутант, несущий метку Tag 03; Дорожка 3, ST-мутант, несущий метку Tag 04; Дорожка 4, ST-мутант, несущий метку Tag 06; Дорожка 5, ST-мутант, несущий метку Tag 07; Дорожка 6, отрицательный контроль. Дорожка 7, положительный контроль, плазмида, содержащая транспозон, несущий Tag 02 в качестве матрицы.

Фиг.3. Подтверждение трансформантов STM. Трансформанты, которые обнаруживали изменение окраски, подвергали скринингу при помощи ПЦР, использующей набор праймеров P2/P4, для подтверждения присутствия индивидуальной сигнатурной метки. Каждую пробу подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле вместе со стандартом размеров ДНК pUC18, расщепленной HaeIII. Дорожка 1, рекомбинантный Mg-содержащий Tag02; Дорожка 2, трансформант Tag03; Дорожка 3, клон Tag04; Дорожка 4, трансформант Tag06; Дорожка 5, трансформант, несущий Tag07; +, положительный контроль с плазмидой Tag02 в качестве матрицы, -, отрицательный контроль без добавленной матрицы.

Фиг.4. Экспериментальная схема подтверждающего скрининга.

Фиг.5. Последовательность и Саузерн-блот-анализ ST-мутантов.

A. Электроферограммы, полученные прямым секвенированием. (I). ST-мутант 26-2, который нес единственный транспозон, со считываемой последовательностью в геном. Можно видеть сигналы смешанных последовательностей, начинающихся в точке соединения транспозона и генома штамма-хозяина в ST-мутантах 15-1 (II) и 25-1 (III).

B. Множественные инсерции, детектированные Саузерн-блоттингом. Дорожка 1, ST-мутант 15-1; Дорожка 2, ST-мутант 15-2; Дорожка 3, ST-мутант 15-3; Дорожка 4, ST-мутант 25-1; Дорожка 5, ST-мутант 25-2; Дорожка 6, ST-мутант 25-3. Стандартами размеров ДНК была ДНК фага λ, расщепленная HindIII.

Фиг.6. Распределение балльных оценок RSA и повреждений альвеолярных мешочков в птицах в исследовании вирулентности и инфективности. A. Балльная оценка RSA при 2 неделях после инфицирования. B. Балльная оценка повреждения альвеолярных мешочков. Группа 1, отрицательный контроль; Группа 2, инфицированная ST-мутантом 04-1; Группа 3, инфицированная ST-мутантом 33-1; Группа 4, инфицированная ST-мутантом 03-1; Группа 5, инфицированная ST-мутантом 26-1; Группа 6, инфицированная ST-мутантом 18-1; Группа 7, инфицированная ST-мутантом 20-1; Группа 8, инфицированная ST-мутантом 22-1; Группа 9, положительный контроль (инфицированная Ap3AS дикого типа).

Фиг.7. Распределение балльных оценок RSA и повреждений альвеолярных мешочков птиц. A. Балльная оценка RSA в день 28. B. Балльная оценка повреждения альвеолярных мешочков. Суммарная балльная оценка 6 различных альвеолярных мешочков. Группа 1, отрицательный контроль; Группа 2, положительный контроль (инфицированная Ap3AS дикого типа); Группа 3, вакцинированный контроль (вакцинированная ST-мутантом 26-1); Группа 4, вакцинированная (ST-мутантом 26-1) и зараженная (зараженная Ap3AS дикого типа).

Фиг.8. Схематическая диаграмма ПЦР-конструкций, используемых для гомологичной рекомбинации. Эти ПЦР-продукты генерировали с олигонуклеотидными праймерами, как описано. Ген канамицина амплифицировали для конструкций генов как oppA, так и dppD с использованием пары праймеров TX/TY. Генерировали плечи конструкций и дополняли дополнительными ПЦР-продуктами с использованием WS/WU и WY/WT для oppD или с использованием 60-мерных праймеров WE/WF в ПЦР для dppD.

Фиг.9. Детектирование гомологичной рекомбинации при помощи ПЦР. Олигонуклеотидные праймеры для генов dppD (Панель А) и oppD (Панель B) использовали в ПЦР для амплификации соответствующих районов в штаммах E. coli с использованием пары праймеров WS/WT для oppD и TZ/UA для dppD: E956 (дорожка 1 панелей A и B), ΔdppD (дорожка 1, панель A) и ΔoppD (дорожка 1, панель B).

Фиг.10. Саузерн-блоттинг нокаутов dppD и oppD E. coli Е956. Канамицин, зонды dppD и oppD метили радиоактивно и использовали для зондирования расщепленной рестриктазой PstI геномной ДНК E. coli Е956, ΔdppD и ΔoppD, дорожки 1, 2 и 3, соответственно.

Подробное описание

Данное изобретение относится к живым аттенуированным бактериям, которые персистируют в субъекте, и их применению в вакцинных композициях. Эти аттенуированные бактерии лишены по меньшей мере одного функционального АВС-транспортерного белка в результате мутации в нуклеиновой кислоте, кодирующей АВС-транспортерный белок. АВС-транспортерный белок может быть сделан нефункциональным любым способом, но обычно это достигается мутацией нуклеиновой кислоты, кодирующей АВС-транспортерный белок. Обычно мутация является инсерцией, делецией или мутацией со сдвигом рамки или любой их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления живые аттенуированные бактерии могут также экспрессировать гетерологичный антиген.

В соответствии с настоящим изобретением может быть аттенуирован любой тип бактерий, хотя предпочтительной является аттенуация патогенных бактерий позвоночных животных и, в частности, патогенных бактерий птиц.

Бактерии

В одном варианте осуществления, изобретение относится к живым аттенуированным бактериям, но не ограничивается ими, родов Actinobacillus, Aeromonas, Avibacterium, Bacillus, Brucella, Bartonella, Bordetella, Burkholderia, Escherichia, Salmonella, Clostridium, Campylobacter, Chlamydia, Coxiella, Erysipelothrix, Francisella, Listeria, Actinobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Listeria, Aeromonas, Pasteurella, Streptococcus, Shigella, Yersinia, Mycoplasma, Mycobacterium, Ornithobacterium, Mannheimia, Vibrio, Rickettsia, Pseudomonas, Staphylococci, Ureaplasma и Pasteurella для применения в вакцинной композиции. Эти бактериальные роды содержат большое количество видов, которые являются патогенными как для представителей птичьих, так и для различных других животных, в том числе человека.

В частности, аттенуированными бактериями могут быть, но не ограничиваются ими, Avibacterium paragallinarum, Bordetella avium, Ornithobacterium rhinotracheale, Salmonella enteritidis, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, E. coli, Clostridium perfringens, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma anatis, Mycoplasma anseris, Mycoplasma imitans, Mycoplasma arginini, Ureaplasma parvum, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma californicum, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma dispar, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowae, большая колония и малая колония Mycoplasma mycoides subsp mycoides, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma pullorum, Mycoplasma alligatorus, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma, Mycoplasma maleagridis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum, Mycoplasma haematoparvum.

В одном варианте живая аттенуированная бактерия может быть выбрана из группы, состоящей из E. coli или Mycoplasma gallisepticum.

E. coli может быть птичьей патогенной E. coli E956, и Mycoplasma gallisepticum может быть Mycoplasma gallisepticum Ap3AS.

Персистенция в субъекте

Живые аттенуированные бактерии стойко сохраняются в субъекте. Персистенция аттенуированных бактерий предпочтительно оценивается в модельной системе заболевания субъекта, но может также оцениваться в субъектах, которым были введены описанные здесь вакцинная композиция или иммуногенная композиция. Персистенция аттенуированных бактерий может оцениваться наблюдением клинических признаков и/или симптомов. Альтернативно или в добавление к этому, персистенция может оцениваться определением присутствия аттенуированной бактерии в пробе, взятой из этого субъекта. Этой пробой может быть проба ткани (например, крови, кожи, волос, внутриротового соскоба) или проба биологической секреции или экскреции, например, слизи, мочи, фекалий, слезной жидкости. Пробы могут браться при жизни субъекта или при аутопсии или вскрытии трупа. Присутствие аттенуированных бактерий в пробе может оцениваться при помощи культивирования, молекулярных способов, таких как ELISA или PCR, или любым способом, известным в данной области. Кроме того, обследование пораженных зон субъекта при аутопсии или вскрытии трупа может также позволить определение того, что аттенуированная бактерия продолжает существовать в субъекте.

ABC-транспортеры

Транспортеры АТФ-связывающей кассеты (ABC-транспортеры) образуют одно из самых больших суперсемейств белков и генов с характерными представителями во всех типах (филюмах) от простейших до человека. ABC-транспортеры являются трансмембранными белками, которые используют АТФ для транспорта веществ с определенными функциями через клеточные мембраны. Эти вещества включают метаболиты, пептиды, олигопептиды, липиды и стерины и лекарственные средства.

В бактериях ABC-транспортеры подразделяются на три основные группы на основе типа субстрата, который транслоцирует каждый из них. Этими группами являются транспортеры белков, транспортеры пептидов и системы, которые транспортируют небелковые субстраты.

В соответствии с настоящим изобретением живые аттенуированные бактерии могут быть получены мутацией по меньшей мере одного гена АВС-транспортера любого из этих классов, так что бактерия лишена по меньшей мере одного функционального АВС-транспортерного белка.

Особый интерес представляют ABC-пептидные транспортеры, которые включают, например, CvaB (E. coli), CylB (Enterococcus faecalis), SpaB (Bacillus subtilis), NisT (Lactococcus lactis 6F3), EpiT (Staphylococcus epidermidis), ComA (Streptococcus pneumoniae), PedD (Pediococcus acidilactici), LcnC (Lactococcus lactis subsp. lactis), McbEF (E coli) OppD и DppD (E. coli и M. gallisepticum) и их гомологи в других видах.

Субъекты

Предполагается, что субъектом, которому должны вводить живые аттенуированные бактерии, может быть любое позвоночное животное, включающее людей, коровьих, собачьих, кошачьих, козлиных, овечьих, свиных, верблюдовых, лошадиных и птичьих. Субъектом коровьих может быть корова, бык, бизон или буйвол. Субъектом собачьих может быть собака. Субъектом кошачьих может быть кошка. Субъектом козлиных может быть коза. Субъектом овечьих может быть овца. Субъектом свиных может быть свинья. Субъектом верблюдовых может быть верблюд, дромадер, лама, альпака, викунья или гуанако. Субъектом лошадиных может быть лошадь, осел, зебра или мул. Субъектом птичьих может быть любой из выращенных коммерчески или домашних представителей семейства птичьих. В частности, субъектом птичьих может быть курица (в том числе карликовые куры бентамки), индейка, утка, гусь, фазан, перепел, куропатка, голубь, цесарка, африканский страус, эму или павлин.

Мутации

Мутациями, используемыми для создания нефункционального АВС-транспортерного белка, могут быть инсерционные, делеционные мутации или мутации с заменами или их комбинация, при условии, что мутация приводит к нарушению экспрессии функционального АВС-транспортерного белка. АВС-транспортерные белки могут иметь множественные функции, например, связывание АТФ или связывание олигопептидов. Нефункциональный АВС-транспортерный белок включает АВС-транспортерный белок, который является дефектным по меньшей мере в одной из его функций.

Такой мутацией может быть инсерционная мутация, делеционная мутация, мутация с заменой или их комбинация, при условии, что эта мутация приводит к нарушению экспрессии функционального АВС-транспортерного белка. В предпочтительном варианте эта мутация является мутацией с нокаутом, где по меньшей мере существенная часть нуклеиновой кислоты, кодирующей АВС-транспортерный белок, делетирована. Инсерционная мутация может быть получена, например, гомологичной рекомбинацией, транспозонным мутагенезом или ST-мутагенезом (использующим в качестве меток определенные последовательности).

Живые аттенуированные бактерии для применения согласно изобретению могут быть получены различными путями. Например, живые аттенуированные бактерии могут быть получены обработкой бактерий дикого типа мутагенными агентами, такими как аналоги пуринов или пиримидинов, ультрафиолетовый свет, ионизирующая радиация, ДНК-интеркалирующие агенты, температурная обработка, транспозонный мутагенез. Эти способы не нацеливают мутации на специфические гены, и, следовательно, требуют скрининга обработанных бактерий на аттенуацию способами, известными в данной области, такими как анализ последовательности ДНК генов-мишеней в комбинации с исследованиями патогенности.

Технология рекомбинантных ДНК, использующая известные способы, такие как сайт-направленный мутагенез, может быть использована для введения мутации в заданном сайте конкретного гена, например, oppD. Сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения мутации, такой как инцерция, делеция, замена одного или нескольких нуклеотидов, так что мутированный ген уже не экспрессирует функциональный АВС-транспортерный белок. Такие мутации могут быть, например, получены делецией ряда нуклеиновых кислот.

Делеции всего лишь единственного основания, создающие, следовательно, сдвиг рамки, могут делать АВС-белок нефункциональным. В некоторых вариантах большие количества оснований делетированы. В других вариантах могут быть делетированы большинство генов или все из генов, кодирующих АВС-транспортерный белок. Мутации, которые вводят стоп-кодон или поизводят сдвиг рамки, пригодны для получения нефункционального АВС-транспортерного белка.

Гены, кодирующие АВС-транспортерные белки, содержат не только кодирующую последовательность, но включают также регуляторные последовательности, например, промоторы. Гены включают также районы, существенные для коррекции трансляции мРНК, например, сайты связывания рибосом. Таким образом, живые аттенуированные бактерии могут содержать мутации не только в кодирующих районах, но также или альтернативно в последовательностях, существенных для транскрипции и трансляции, таких как промоторы и сайты связывания рибосом.

В отличие от аттенуированных бактерий, созданных спонтанными мутациями, аттенуированные бактерии, созданные такими мутациями, как делетирование фрагментов генов АВС-транспортеров или делетирование полных АВС-транспортерных генов или инсертирование фрагментов гетерологичной ДНК или их комбинаций, имеют преимущество, заключающееся в том, что они не ревертируются в патогенные бактерии дикого типа. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретение обеспечивает живые аттенуированные бактерии, в которых по меньшей мере один АВС-транспортерный ген содержит инсерцию и/или делецию.

Аттенуированные бактерии, экспрессирующие гетерологичные антигены

В одном варианте осуществления живые аттенуированные бактерии могут быть использованы в качестве носителей для гетерологичных генов, которые кодируют антигены других патогенных бактерий или вирусов. Это позволяют использовать живые аттенуированные бактерии для вызывания иммунной реакции в отношении множества заболеваний.

Ген, кодирующий АВС-транспортерный белок, может быть использован в качестве сайта инсерции для гетерологичных генов. Применение гена АВС-транспортера в качестве инсерции является выгодным, так как инсерция последовательности, кодирующей гетерологичный антиген, как инактивирует АВС-транспортерный белок, так и вводит последовательность, кодирующую один или несколько гетерологичных антигенов. Конструирование таких рекомбинантных бактерий может выполняться рутинно, с использованием стандартных способов, известных в данной области.

Другой вариант осуществления изобретения относится к живым рекомбинантным бактериями, выбранным из родов Avibacterium, Staphylococcus, Escherichia, Brucella, Salmonella, Bordetella, Burkholderia, Vibrio, Haemophilus, Ornithobacterium, Mannheimia, Pasteurella, Clostridium, Campylobacter, Chlamydia, Coxiella, Erysipelothrix, Francisella, Listeria, Actinobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Shigella, Yersinia, Mycoplasma, Mycobacterium, Rickettsia, Ureaplasma и Streptococcus, которые не продуцируют функциональный АВС-транспортер и в которые инсертирована гетерологичная нуклеиновая кислота. Гетерологичная нуклеиновая кислота может кодировать антиген, выбранный из другого патогенного микроорганизма или вируса. Нуклеиновая кислота может кодировать антиген или антигены из патогенных организмов, выбранных из группы, включающей Avibacterium paragallinarum, Bordetella avium, Ornithobacterium rhinotracheale, Salmonella enteritidis, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, E. coli, Clostridium perfringens, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma gallisepticum или Mycoplasma synoviae, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma anatis, Mycoplasma anseris, Mycoplasma imitans, Mycoplasma arginini, Ureaplasma parvum, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma californicum, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma dispar, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowae, большую колонию и малую колонию Mycoplasma mycoides subsp mycoides, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma pullorum, Mycoplasma alligatorus, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma, Mycoplasma maleagridis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum, Mycoplasma haematoparvum или из вирусов (не ограничивающихся ими) болезни Ньюкасл, (псевдочумы птиц), вируса инфекционного бронхита, птичьего пневмовируса, оспы птиц, инфекционного бурсального заболевания, вируса инфекционного ларинготрахеита, птичьего гриппа, вируса гепатита уток, вирусной чумы уток, инфекционной куриной анемии и вируса болезни Марека.

В другом варианте осуществления ген АВС-транспортера может быть полностью или частично заменен нуклеиновой кислотой, кодирующей белок, который выполняет функцию запуска или усиления иммунной реакции, например, интерлейкин или интерферон.

Вакцинные композиции

Живые аттенуированные бактерии пригодны для применения в вакцинных композициях. Вакцинная композиция может содержать иммуногенно эффективное количество живой аттенуированной бактерии, способной стойко сохраняться в субъекте, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Описанные здесь вакцинная композиция или иммуногенные композиции могут вводиться интраназально, офтальмически, внутрикожно, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, перорально, при помощи аэрозоля (спрей-вакцинация), через клоаку или внутримышечно. В частности, введение в виде глазных капель или аэрозоля является предпочтительным, когда субъектом являются птицы. Аэрозольное введение является особенно предпочтительным для введения вакцинной композиции или иммуногенной композиции большим количествам субъектов.

В одной форме настоящее изобретение обеспечивает живые аттенуированные вакцинные композиции для предотвращения или лечения животных и человека против инфекции бактерией, неаттенуированная форма которой содержит ген АВС-транспортера.

Фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель может быть выбран из группы, состоящей из воды, солевого раствора, культуральной жидкости, стабилизаторов, углеводов, белков, белоксодержащих агентов, таких как бычья сыворотка или обезжиренное молоко, и буферов или их комбинации.

Стабилизатором может быть SPGA (на литр, SPGA содержит 74,62 г сахарозы, 0,52 г KH₂PO₄, 1,25 г K₂HPO₄, 0,912 г глутамата калия и 10 г сывороточного альбумина). Углеводами, применимыми в качестве фармацевтически приемлемого носителя или разбавителей, являются, например, сорбит, маннит, крахмал, сахароза, глюкоза, декстран или их комбинации.

Дополнительно, белки, такие как альбумин или казеин, или белоксодержащие агенты, такие как бычья сыворотка или обезжиренное молоко, могут быть применимы в качестве фармацевтически приемлемого носителя или разбавителей.

Буферы в качестве фармацевтически приемлемого носителя или разбавителей могут быть выбраны из группы, включающей малеат, фосфат, CABS (4-(циклогексинамино)-1-бутансульфоновую кислоту), пиперидин, глицин, цитрат, глицилглицин, малат, формиат, сукцинат, ацетат, пропионат, пиперазин, пиридин, какодилат, сукцинат, MES (гидрат 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты и 4-морфолинэтансульфоновую кислоту), гистидин, бис-трис (2,2-бис(гидроксиметил)-2,2',2"-нитрилотриэтанол), фосфат, этаноламин, ADA (N-(2-ацетамидо)иминодиуксусную кислоту, N-(карбамоилметил)иминодиуксусную кислоту), карбонат, ACES (N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновую кислоту), PIPES (1,4-пиперазиндиэтансульфоновую кислоту), имидазол, BIS-TRIS-пропан (1,3-бис[трис(гидроксиметил)метиламино]пропан), BES (N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновую кислоту), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновую кислоту), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновую кислоту), TES (2-[(2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметил)этил)амино]этансульфоновую кислоту), MOPSO (3-морфолино-2-гидроксипропансульфоновую кислоту), MOBS (4-(N-морфолино)бутансульфоновую кислоту), DIPSO (3-(N,N-бис[2-гидроксиэтил]амино)-2-гидроксипропансульфоновую кислоту), TAPSO (2-гидрокси-3-[трис(гидроксиметил)метиламино]-1-пропансульфоновую кислоту), TEA (триэтаноламин), пирофосфат, HEPPSO (гидрат (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-(2-гидроксипропансульфоновой кислоты)), POPSO (дегидрат пип