Гуманизированное антитело к фно-α, его антигенсвязывающий фрагмент (fab) и их применение

Гуманизированное антитело к фно-α, его антигенсвязывающий фрагмент (fab) и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам к фактору некроза опухоли-α человека (ФНО-α), их антигенсвязывающим фрагментам (Fab) и применению указанных антител и фрагментов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Развитие и прогрессирование аутоиммунных заболеваний является сложным процессом, который возникает как следствие нарушенного равновесия в регуляции многих активных цитокинов. Было показано, что фактор некроза опухоли-α (ФНО-α) играет важную роль в иммунной регуляции множества цитокинов. Однако было продемонстрировано, что его сверхэкспрессия является одной из основных причин аутоиммунных и других заболеваний. Соответственно, применение биофармацевтических препаратов, подавляющих активность ФНО-α, становится одним из наиболее успешных способов лечения таких заболеваний. Показания, которые были одобрены для таких препаратов, включают главным образом ревматоидный артрит, болезнь Крона, бляшечный псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, язвенный колит и юношеский идиопатический артрит, а многие сходные заболевания в настоящее время изучаются в клинических исследованиях.

В настоящее время на рынке Европы и Америки появились фармацевтические антитела против ФНО-α и лекарственные средства на основе антитело-подобных гибридных белков Fc, такие как Ремикейд. Однако Ремикейд обладает меньшим периодом полувыведения in vivo, который составляет приблизительно 9 дней. Кроме того, хотя Ремикейд обладает высоким сродством связывания, биологической активностью и клинической эффективностью, поскольку он является химерным антителом, содержащим 1/3 последовательностей от мыши и 2/3 последовательностей от человека, приблизительно у 10%-47% пациентов после введения Ремикейда возникает иммунный ответ, обычно приводящий к образованию антимышиных антител человека (HAMA), которые плохо влияют на активность и длительность применения указанного антитела. Соответственно, существует большая потребность в разработке антитела против ФНО-α с высокой степенью гуманизации и максимально сниженной долей последовательностей, полученных от мыши, чтобы уменьшить процент материала мышиного происхождения и обеспечить безопасное применение при лечении заболеваний у человека. Обычным способом гуманизации антител является прививка частей гипервариабельных областей (CDR) вариабельных областей (V_H, V_K) антитела, полученного от мыши, в каркасную область ранее отобранного антитела человека. Образующееся антитело содержит в основном последовательности, полученные от человека, и может сохранять селективность исходного антитела мышиного происхождения в отношении того же антигена. Однако указанный способ, как правило, влечет за собой потерю сродства указанного антитела.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одна из задач настоящего изобретения состоит в обеспечении гуманизированных антител к фактору некроза опухоли-α человека (ФНО-α) и их антигенсвязывающих фрагментов (Fab), сродство которых к фактору некроза опухоли-α человека сопоставимо или даже выше, чем у Ремикейда - химерного антитела человека/мыши.

Гуманизированные антитела к фактору некроза опухоли-α человека (ФНО-α) или Fab, предложенные в настоящем изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи показана в SEQ ID №:1 или 3 в перечне последовательностей, а последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи показана в SEQ ID №:15, 9, 11, 7, 13 или 5 в перечне последовательностей, и первым остатком аминокислоты в SEQ ID №:1 является Glu или Gln.

Указанное антитело выбирают, в частности, из одного из следующих a)-l):

a) KS10, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:1, и вариабельную область легкой цепи SH08 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:15;

b) KS03, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:1, и вариабельную область легкой цепи SH05 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:9;

c) KS06, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:1, и вариабельную область легкой цепи SH06 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:11;

d) KS12, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:3, и вариабельную область легкой цепи SH08 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:15;

e) KS04, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:3, и вариабельную область легкой цепи SH05 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:9;

f) KS07, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:3, и вариабельную область легкой цепи SH06 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:11;

g) KS02, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:3, и вариабельную область легкой цепи SH03 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:5;

h) KS08, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:3, и вариабельную область легкой цепи SH04 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:7;

i) KS11, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:3, и вариабельную область легкой цепи SH07 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:13;

j) KS01, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:1, и вариабельную область легкой цепи SH03 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:5;

k) KS05, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:1, и вариабельную область легкой цепи SH04 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:7;

l) KS09, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:1, и вариабельную область легкой цепи SH07 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:13;

причем первым остатком аминокислоты в SEQ ID №:1 является Glu или Gln.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в обеспечении антигенсвязывающего фрагмента (Fab) гуманизированного антитела к фактору некроза опухоли-α человека. Указанный Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность аминокислот которой соответствует положениям 1-20 в SEQ ID №:27 или SEQ ID № DQ25 в перечне последовательностей, и вариабельную область легкой цепи, последовательность аминокислот которой соответствует положениям 1-109 в SEQ ID №:31 или SEQ ID №:29 в перечне последовательностей.

Антитело, предложенное в настоящем изобретении, состоит из тяжелой цепи, в которой последовательность аминокислот константной области идентична последовательности аминокислот тяжелой цепи антитела человека, и легкой цепи, в которой последовательность аминокислот константной области идентична последовательности аминокислот легкой цепи антитела человека.

Константная область тяжелой цепи описываемого антитела может быть полученной от человека константной областью любого класса (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) или подкласса (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1, IgA2), а константная область легкой цепи описываемого антитела может быть полученной от человека константной областью легкой цепи любого класса (κ или λ) или подкласса (λ1, λ2, λ3, λ4), или аллотипа (κm (1), κm (2), κm (3)).

Последовательность аминокислот константной области тяжелой цепи указанного антитела, в частности, показана в SEQ ID №:17 в перечне последовательностей; а последовательность аминокислот константной области легкой цепи, в частности, показана в SEQ ID №:19 в перечне последовательностей.

Последовательность аминокислот указанной тяжелой цепи показана в SEQ ID №:21 в перечне последовательностей; а последовательность аминокислот указанной легкой цепи, в частности, показана в SEQ ID №:23 в перечне последовательностей. Остатки аминокислот в положениях 1-120 SEQ ID №:21 соответствуют вариабельной области тяжелой цепи, а остатки аминокислот в положениях 121-450 той же последовательности соответствуют константной области тяжелой цепи. Остатки аминокислот в положениях 1-109 SEQ ID №:23 соответствуют вариабельной области легкой цепи, а остатки аминокислот в положениях 110-214 той же последовательности соответствуют константной области легкой цепи. Первым остатком аминокислоты в SEQ ID №:21 является Glu или Gln.

Фрагмент Fab, предложенный в настоящем изобретении, состоит из фрагмента Fd тяжелой цепи и легкой цепи; причем указанный фрагмент Fd тяжелой цепи включает V_H и CH1, а указанная легкая цепь включает V_K и константную область легкой цепи; причем последовательность аминокислот указанной CH1 идентична CH1 константной области тяжелой цепи антитела человека, а последовательность аминокислот указанной константной области легкой цепи идентична константной области легкой цепи антитела человека.

CH1 указанного фрагмента Fd описанного выше Fab может быть CH1 константной областью, полученной от человека, любого класса (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) или подкласса (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1, IgA2); а константная область легкой цепи описанного выше Fab может быть константной областью легкой цепи, полученной от человека, любого класса (κ или λ) или подкласса (λ1, λ2, λ3, λ4), или аллотипа (κm (1), κm (2), κm (3)).

Последовательность аминокислот CH1 показана в SEQ ID №:33 в перечне последовательностей; последовательность аминокислот константной области указанной легкой цепи показана в SEQ ID №:19 в перечне последовательностей.

Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения, указанный Fab является одним из следующих b1)-b3):

b1) KS-7F: последовательность аминокислот фрагмента тяжелой цепи показана в SEQ ID №:27 в перечне последовательностей; а последовательность аминокислот легкой цепи показана в SEQ ID №:31 в перечне последовательностей;

b2) KS-7A: последовательность аминокислот фрагмента тяжелой цепи показана в SEQ ID №:25 в перечне последовательностей; а последовательность аминокислот указанной легкой цепи показана в SEQ ID №:31 в перечне последовательностей;

b3) KS-2E: последовательность аминокислот фрагмента тяжелой цепи показана b SEQ ID №:25 в перечне последовательностей; а последовательность аминокислот указанной легкой цепи показана в SEQ ID №:29 в перечне последовательностей.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в обеспечении антигенсвязывающего фрагмента A или антигенсвязывающего фрагмента B, причем указанный антигенсвязывающий фрагмент A представляет собой Fab, Fab′, F(ab′)₂, Fv (фрагменты вариабельных областей антитела), вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи, фрагменты полипептида, выбираемые из вариабельной области тяжелой цепи, или фрагменты полипептида, выбираемые из вариабельной области легкой цепи, которые получают из указанного антитела; антигенсвязывающий фрагмент B представляет собой Fab′, F(ab′)₂, Fv, вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи, фрагменты полипептида, выбираемые из вариабельной области тяжелой цепи, или фрагменты полипептида, выбираемые из вариабельной области легкой цепи, которые получают из указанного Fab.

Упоминаемый выше F(ab′)₂ состоит из пары легких цепей и пары тяжелых цепей (обозначается как Fd′), которые несколько крупнее, чем Fd. Гидролиз молекул IgG под действием пепсина может приводить к получению указанного фрагмента F(ab′)₂, который содержит два Fab, и таким образом, может связываться с двумя антигенными эпитопами. Fd′ содержит около 235 остатков аминокислот, которые охватывают V_H, CH1 и шарнирную область. Fv состоит из вариабельной области легкой цепи (V_L) и вариабельной области тяжелой цепи (V_H), которые соединены вместе нековалентными связями. Fv обладает молекулярной массой приблизительно в шесть раз больше, чем молекула интактного антитела, и содержит единственный антигенсвязывающий сайт. Fv включает ScFv (одноцепочечные антитела), DsFv (стабилизированные дисульфидными связями антитела) и др. ScFv представляет собой одну пептидную цепь, экспрессируемую с V_H и V_L, соединенных вместе фрагментом подходящего олигонуклеотида (линкера). DsFv представляет собой иммобилизованный дисульфидными связями фрагмент Fv, образованный путем соответствующего введения одного цистеина в легкую цепь и вариабельную область тяжелой цепи в соответствующем сайте. Было показано, что DsFv превосходит ScFv как по сродству связывания, так и по стабильности.

Также в объем изобретения входит ген, кодирующий любой из белков A)-C):

(A) указанное антитело; B) указанный Fab; C) антигенсвязывающий фрагмент A или B.

Последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей как указанного антитела, так и антигенсвязывающего фрагмента A, показаны в SEQ ID №:2 или 4 в перечне последовательностей. Последовательности, кодирующие вариабельные области легких цепей как указанного антитела, так и антигенсвязывающего фрагмента A, выбирают из SEQ ID №:16, 10, 12, 8, 14 и 6 в перечне последовательностей. Последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей как указанного Fab, так и антигенсвязывающего фрагмента B, соответствуют положениям 1-360 в любой из последовательностей SEQ ID №:2, 4, 28 и положениям 1-360 SEQ ID №:26 в перечне последовательностей. Последовательности, кодирующие вариабельные области легких цепей как Fab, так и антигенсвязывающего фрагмента B, соответствуют положениям 1-327 в любой из последовательностей SEQ ID №:16, 10, 12, 8, 14, 6, 32 и положениям 1-327 последовательности SEQ ID №:30 в перечне последовательностей.

Среди перечисленных выше последовательностей как SEQ ID №:2, так и SEQ ID №4 содержат 360 нуклеотидов, а все последовательности SEQ ID №:6, 8, 14, 10, 12 и 16 содержат 327 нуклеотидов.

Последовательность, кодирующая константную область тяжелой цепи указанного антитела, показана в SEQ ID №:18 в перечне последовательностей; а последовательность, кодирующая константную область легкой цепи указанного антитела, показана в SEQ ID №:20 в перечне последовательностей.

Последовательность, кодирующая область CH1 указанного Fab, показана в SEQ ID №:34 в перечне последовательностей; последовательность, кодирующая константную область легкой цепи указанного Fab, показана в SEQ ID №:20 в перечне последовательностей.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения последовательность, кодирующая тяжелую цепь указанного антитела, показана, в частности, в SEQ ID №:22 в перечне последовательностей; последовательность, кодирующая легкую цепь указанного антитела, показана, в частности, в SEQ ID №:24 в перечне последовательностей.

Последовательность, кодирующая указанный Fab, является одной из следующих c1-c3):

c1) KS-7F: последовательность, кодирующая фрагмент тяжелой цепи указанного Fab показана в SEQ ID №:28 в перечне последовательностей; а последовательность, кодирующая легкую цепь указанного Fab, показана в SEQ ID №:32 в перечне последовательностей;

c2) KS-7A: последовательность, кодирующая фрагмент тяжелой цепи указанного Fab показана в SEQ ID №:26 в перечне последовательностей; а последовательность, кодирующая легкую цепь указанного Fab, показана в SEQ ID №:32 в перечне последовательностей;

c3) KS-2E: последовательность, кодирующая фрагмент тяжелой цепи указанного Fab показана в SEQ ID №:26 в перечне последовательностей; а последовательность, кодирующая легкую цепь указанного Fab, показана в SEQ ID №:30 в перечне последовательностей.

Тогда как нуклеотиды в положениях 1-360 и 360-1350 последовательности SEQ ID №:22 соответствуют нуклеотидам упомянутой вариабельной области тяжелой цепи и нуклеотидам константной области тяжелой цепи, соответственно; нуклеотиды в положениях 1-327 и 328-642 последовательности SEQ ID №:24 соответствуют нуклеотидам упомянутой вариабельной области легкой цепи и нуклеотидам константной области легкой цепи, соответственно.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в обеспечении следующего генетического материала: рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии,

рекомбинантной линии клеток; рекомбинантного вируса или кассеты экспрессии, содержащей ген, описанный выше.

Указанный рекомбинантный вектор представляет собой вектор экспрессии у прокариот или эукариот для экспрессии указанного антитела, Fab или антиген-связывающего фрагмента. Указанная рекомбинантная бактерия представляет собой Escherichia coli, содержащую ген, описанный выше. Указанная рекомбинантная линия клеток представляет собой трансгенную линию клеток или гибридную линию клеток, причем указанная трансгенная линия клеток может представлять собой линию клеток млекопитающих, в которых трансфецировали указанный ген, кодирующий гуманизированное антитело к фактору некроза опухоли-α человека, или Fab, или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, предпочтительно линия клеток CHO (яичника китайского хомячка), или линия клеток 293 и ее сублинии; указанная гибридная линия клеток представляет собой клетки гибридомы, которые могут секретировать указанное гуманизированное антитело к фактору некроза опухоли-α человека, упоминаемое в настоящем изобретении. Указанный рекомбинантный вирус представляет собой рекомбинантный аденовирус или рекомбинантный адено-ассоциированный вирус и др., которые содержат ген, описанный выше. Указанная кассета экспрессии представляет собой молекулу ДНК, которая включает три фрагмента в направлении протекания транскрипции в следующем порядке: промотор; ген, кодирующий указанное антитело или Fab, или его антигенсвязывающий фрагмент, транскрипция которого инициируется с указанного промотора; и терминатор.

Если клетку-хозяина трансфецируют или трансформируют рекомбинантным вектором, содержащим ген, кодирующий указанное антитело, Fab или антигенсвязывающий фрагмент, могут экспрессироваться соответствующие белки, и таким образом можно получать указанное антитело, Fab или антигенсвязывающий фрагмент. Указанная клетка-хозяин может быть клеткой эукариот, а может быть клеткой прокариот, включая, но не ограничиваясь клетками млекопитающих, бактерий, дрожжей, насекомых и др. Для масштабной экспрессии белков применим широкий спектр клеток млекопитающих, таких как клетки 293, CHO, SP20, NS0, COS, BHK или PerC6 и др. Существуют разные способы трансфекции клетки, включая без ограничений электропорацию, опосредуемую липосомами трансфекцию, опосредуемую фосфатом кальция трансфекцию и др.

Предпочтительный способ экспрессии указанного антитела, Fab или антигенсвязывающего фрагмента следующий: проведение амплификации гена при помощи рекомбинантного вектора в стабильно трансфецированной клетке-хозяине с целью увеличения уровня экспрессии указанного рекомбинантного белка. Например, дефицитную по DHFR клетку-хозяина стабильно трансфецируют рекомбинантным вектором, содержащим ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), а затем в питательную среду для культивирования клеток можно добавлять метотрексат (МТХ) в концентрации, достаточной для увеличения числа копий указанного рекомбинантного вектора в клетке-хозяине.

После экспрессии указанного Fab или IgG, содержащего сочетание кодирующих последовательностей гена, для определения концентрации белка в питательной среде можно применять твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или другие виды анализа. Для указанных фрагментов Fab можно проводить очистку при помощи аффинной хроматографии с применением белка G; белки IgG можно очистить при помощи аффинной хроматографии с применением белка A.

Также в объем настоящего изобретения попадает применение указанного антитела, или Fab, или антигенсвязывающего фрагмента, или указанного гена, или указанного генетического материала при:

d1) получении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболеваний, ассоциированных с фактором некроза опухоли-α человека, или

d2) получении продукта для нейтрализации фактора некроза опухоли-α человека, или

d3) получении набора для качественного и количественного определения фактора некроза опухоли-α человека.

Причем заболеванием, ассоциированным с фактором некроза опухоли-α человека, является заболевание, вызванное повышением уровня фактора некроза опухоли-α человека, предпочтительно ревматоидный артрит, аутоиммунный увеит, болезнь Крона, бляшечный псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, язвенный колит или юношеский идиопатический артрит.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в обеспечении фармацевтической композиции, содержащей вспомогательные вещества и активные ингредиенты, причем указанные активные ингредиенты включают по меньшей мере одно из следующих веществ: антитело, Fab, антигенсвязывающий фрагмент, ген и генетический материал, описанные выше; а указанное вспомогательное вещество представляет собой фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Указанными активными ингредиентами в фармацевтической композиции может быть только один любой из указанных Fab или антител, описываемых выше, или любой один из антигенсвязывающих фрагментов, описываемых выше, или любой один из генов, описываемых выше, или любой один из генетических материалов, описываемых выше.

Также в объем настоящего изобретения попадает применение любого из следующих веществ для лечения заболеваний, ассоциированных с фактором некроза опухоли-α человека: указанного антитела, Fab, антигенсвязывающего фрагмента, указанного гена, генетического материала и фармацевтической композиции, описываемых выше.

Указанное заболевание, ассоциированное с фактором некроза опухоли-α человека, вызвано увеличением уровня фактора некроза опухоли-α человека, и предпочтительно является аутоиммунным увеитом, ревматоидным артритом, болезнью Крона, бляшечным псориазом, псориатическим артритом, анкилозирующим спондилитом, язвенным колитом или юношеским идиопатическим артритом.

Описание прилагаемых чертежей:

На Фиг.1 показано определение биологической активности указанного гуманизированного Fab в отношении подавления ФНО-α при помощи ELISA.

На Фиг.2 показано определение биологической активности указанного гуманизированного Fab в отношении нейтрализации ФНО-α в эксперименте по оценке цитотоксичности L929.

На Фиг.3 показан анализ связывания KS10 с антигенным ФНО-α из разных видов.

На Фиг.4 показаны баллы, оценивающие лечение KS10 у экспериментальных крыс, страдающих ревматоидным артритом. Слева направо показаны - здоровая группа, отрицательный контроль, модельная группа, группа, получающая 5 мг/кг KS10, группа, получающая 10 мг/кг KS10, и группа, получающая 20 мг/кг KS10.

На Фиг.5 показано действие KS10 на уровень IL-1β (интерлейкина-1β) в синовиальной жидкости/ткани суставов экспериментальных крыс, страдающих ревматоидным артритом. Слева направо показаны - здоровая группа, отрицательный контроль, модельная группа, группа, получающая 5 мг/кг KS10, группа, получающая 10 мг/кг KS10, и группа, получающая 20 мг/кг KS10.

На Фиг.6 показано действие KS10 на уровень IL-6 в синовиальной жидкости/ткани суставов экспериментальных крыс с ревматоидным артритом. Слева направо показаны - здоровая группа, отрицательный контроль, модельная группа, группа, получающая 5 мг/кг KS10, группа, получающая 10 мг/кг KS10, и группа, получающая 20 мг/кг KS10.

Примеры

Следующие примеры представлены для обеспечения более полного представления о настоящем изобретении, но не для ограничения изобретения. Если не указано другое, экспериментальные способы, упоминаемые ниже, соответствуют традиционным экспериментальным способам. Если не указано другое, экспериментальные материалы, применяемые в данных примерах, все могут быть приобретены в обычных компаниях, производящих биомедицинские реактивы. Количественный анализ в следующих примерах проводили в трех параллельных определениях, и за результат брали средние значения.

Прививка CDR тяжелых и легких цепей гуманизированного антитела к ФНО-α, сайт-направленный мутагенез при помощи ПЦР (полимеразно-цепной реакции) и скрининг в библиотеке мутантных генов, описанные в настоящем изобретении, проводили в соответствии с традиционными технологиями рекомбинации генов и иммунологическими способами, основанными на взаимодействии атиген-антитело, а подробные экспериментальные способы и этапы задокументированы в "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 3rd edition, by Joseph Sambrook, Science Press, и similar experiment handbooks. EC₅₀ (концентрация, обеспечивающая 50% от максимального эффекта) в следующих примерах получали путем введения значений оптической плотности (OD₄₅₀) в программу GraphPad Prism 5, и генерирования итоговых графиков.

Пример 1: Экспрессия Fab гуманизированного антитела к ФНО-α и определение его активности

В данном примере применяют три Fab гуманизированных антител к ФНО-α (указанный Fab состоит из Fd фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи указанного антитела), а именно KS-2E, KS-7A, и KS-7F.

1. Конструирование векторов экспрессии для KS-2E, KS-7A и KS-7F

(1) Получение последовательностей легких и тяжелых цепей

Клетки гибридомы получали от мышей, вакцинированных ФНО-α человека (R&D Co., каталожный номер: 210-ТА-050) и подвергали их скринингу на продуцентов моноклональных антител, а затем полную РНК экстрагировали и применяли в качестве матрицы, с которой амплифицировали последовательности нуклеотидов для вариабельной области тяжелой цепи при помощи ПЦР с применением обычных праймеров Р1: 5′-GCGAATTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′, Р2: 5′-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3′; а последовательности нуклеотидов для вариабельной области легкой цепи амплифицировали при помощи ПЦР с применением обычных праймеров Р3: 5′-GACATTCTGMTSACMCAGMCTCC-3′, P4: 5′-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3′. Срезы геля, содержащие рассматриваемые полосы, вырезали для дальнейшего восстановления. Продукты амплификации тяжелых и легких цепей указанного антитела индивидуально встраивали в вектор pMD18-T (TaKaRa Co., каталожный номер: D101C). Одиночные колонии по отдельности извлекали и секвенировали с целью идентификации последовательностей нуклеотидов вариабельных областей легких и тяжелых цепей указанного антитела.

(2) Конструирование гуманизированного Fab

Проводили сравнение сходства последовательностей аминокислот между полученной вариабельной областью легкой цепи и вариабельной областью легкой цепи гуманизированного антитела, между полученной вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью тяжелой цепи гуманизированного антитела. Поиск сходства последовательностей проводили по отдельности в IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) и IMGT (ImMunoGeneTics, IMGT: http://www.imgt.org). На основании результатов поиска в качестве матрицы для получения гуманизированного антитела выбирали антитело с более высоким процентом сходства последовательностей в отношении как легких, так и тяжелых цепей. Полученную вариабельную область тяжелой цепи VH прививали в каркасную область антитела человека IGHV3-15*07 (Номер доступа: М99406), обладающего более высоким процентом сходства последовательностей, а полученную вариабельную область легкой цепи VK прививали в каркасную область антитела человека IGKV6-21*01 (Номер доступа: Х63399), обладающего более высоким процентом сходства последовательностей.

После множественных циклов мутагенеза в исходных фрагментах тяжелых цепей (Fd) и легких цепях человека сочетания разных легких цепей и фрагментов тяжелых цепей (Fd) встраивали в вектор pTLR (модифицированный pET22b (+) вектор). Более конкретно, готовили разные ДНК для легких цепей с сайтами рестрикции BamHI и EcoRI, соответственно, на каждом конце, и разные ДНК для фрагментов тяжелых цепей (Fd) с сайтами рестрикции NotI и XhoI соответственно, на каждом конце. Две группы ДНК по отдельности клонировали в вектор pTLR (модифицированый pET22b (+) вектор) между соответствующими сайтами рестрикции, то есть, разные ДНК для указанных легких цепей встраивали между сайтами рестрикции BamHI и EcoRI, разные ДНК для указанных фрагментов тяжелых цепей (Fd) встраивали между сайтами рестрикции NotI и XhoI, что привело к получению нескольких векторов экспрессии Fab (включая три вектора экспрессии Fab, с которых экспрессируются KS-2E, KS-7A и KS-7F, соответственно).

Разные сочетания указанных легких цепей и указанных фрагментов тяжелых цепей, упоминаемых выше, включают три указанных Fab, KS-2E, KS-7F, и KS-7A. Последовательность аминокислот фрагмента тяжелой цепи KS-2E показана в SEQ ID №:25 в перечне последовательностей, его последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:26, а последовательность аминокислот легкой цепи KS-2E показана в SEQ ID №:29 в перечне последовательностей, ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:30. Последовательность аминокислот фрагмента тяжелой цепи KS-7A показана в SEQ ID №:25 в перечне последовательностей, его последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:26, а последовательность аминокислот легкой цепи KS-7A показана в SEQ ID №:31 в перечне последовательностей, ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:32. Последовательность аминокислот фрагмента тяжелой цепи KS-7F показана в SEQ ID №:27 в перечне последовательностей, его последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:28, а последовательность аминокислот легкой цепи KS-7F показана в SEQ ID №:31 в перечне последовательностей, ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:32.

Более подробно, способ модификации вектора pET22b (+) с целью получения упоминаемого выше вектора pTLR был следующим: сначала искусственным путем синтезировали сегмент ДНК (сокращенно - последовательность ДНК T-L-R, показанная в SEQ ID №:35 в перечне последовательностей), который содержал последовательность промотора Р7, оператор лактозного оперона и сайт связывания с рибосомой (RBS), с сайтами рестрикции SalI и NotI, расположенными на каждом конце; затем по отдельности расщеплению подвергали вектор pET22b (+) (продукт компании «Novage Co.», США) и последовательность ДНК T-L-R рестриктазами SalI и NotI, затем сшивали вместе при помощи ДНК-лигазы Т4 и трансформировали; и в конце - традиционным способом отбирали отдельную колонию и проводили последующий скрининг на правильно модифицированный вектор.

2. Экспрессия KS-2E, KS-7A и KS-7F у прокариот

Штамм E. coli Top 10 трансформировали по отдельности сконструированными, как упоминалось выше, векторами экспрессии Fab (включая три вектора экспрессии Fab, которые экспрессируют KS-2E, KS-7A и KS-7F, соответственно), а затем его помещали в планшет 2-YT (пептон 1,6%, экстракт дрожжей 1%, NaCl 0,5%, и агар в порошке 1,5%) с хлорамфениколом. На следующий день выбирали планшет с подходящей плотностью колонии для отбора нескольких одиночных колоний. Для каждой позитивной колонии отбирали восемь одиночных колоний и помещали в планшет с 96 глубокими лунками, затем индуцировали экспрессию при помощи IPTG (изопропилтиогалактозид). Каждую одиночную колонию добавляли в пробирку с 6 мл жидкой среды 2-YT YT (пептон 1,6%, экстракт дрожжей 1%, NaCl 0,5%), содержащей хлорамфеникол, и взбалтывали при 250 об/мин при 37°C в течение 12 часов. 0,2 мкл указанной суспензии бактерий отбирали пипеткой из каждой пробирки и переносили на планшет с 2-YT с хлорамфениколом для хранения. 5 мл указанной суспензии бактерий засевали на 500 мл жидкой среды 2-YT, содержащей хлорамфеникол, и культивировали при 33°C, 300 об/мин до тех пор, пока OD₆₀₀ не достигала 0,6. Затем в указанную среду добавляли IPTG в конечной концентрации 50 мкл, чтобы индуцировать экспрессию разных Fab, с временем индукции 3 часа. После того, как индуцированная экспрессия завершалась, указанную питательную среду центрифугировали при 5100 об/мин и 10°C в течение 15 минут. Надосадочную жидкость сливали, а осадок с бактериями полностью повторно суспендировали в 40 мл предварительно охлажденного раствора TES (Трис-(гидроксиметил)-метил-2-аминоэтансульфоновая кислоты); 66 мл предварительного охлажденного разбавленного 20% раствора TES с H₂O добавляли повторно в повторно суспендированный раствор бактерий и инкубировали на льде в течение 40 минут, после чего центрифугировали при 13000 об/мин, 4°C в течение 10 минут. После центрифугирования отбирали надосадочную жидкость, которая представляет собой периплазматический экстракт, содержащий белки Fab (белки KS-2E, KS-7A или KS-7F). Указанный периплазматический экстракт обессоливали путем пропускания через колонку G-25 («GE Co.», 17-0034-01). Готовили колонку, заранее заполненную белком G («GE Co.», 17-0618-04), уравновешивали ее раствором для уравновешивания (20 мМ фосфатного буфера, pH 6,5), а затем загружали на нее указанную пробу белка. После загрузки указанной пробы колонку последовательно промывали раствором для уравновешивания, а затем проводили десорбцию непосредственно при помощи раствора для десорбции (0,1 М Gly-HCl, pH 2,5). Элюируемые фракции отбирали, и pH элюируемых фракций быстро корректировали до 7,0, заранее добавляя 1,0М Трис-HCl буфер (pH 9,0) в пробирки для отбора фракций перед их отбором, причем отношение объемов Трис-буфера и элюируемых фракций составляло 1:9. Отобранная жидкость содержит рассматриваемые белки. Чистоту указанного белка оценивали при помощи SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), и оценивали концентрацию белка в указанных пробах белка. В итоге, указанную пробу белка упаковывали и хранили при -80°C, получая в результате белки Fab с более высокой степенью чистоты (включая три белка KS-2E, KS-7A и KS-7F).

3. Определение биологической активности KS-2E, KS-7A и KS-7F

1) Анализ связывания гуманизированных Fab к ФНО-α методом ELISA

Белки Fab, которые связываются с ФНО-α, подвергали скринингу посредством следующих этапов: планшет для ELISA в качестве субстрата покрывали 100 нг полученного от человека ФНО-α («R&D Co.», каталожный номер: 210-ТА-050) на лунку; добавляли 2-кратные серийные разведения 40 нМ белков Fab (приготовленные на 2 этапе, включая три белка KS-2E, KS-7A и KS-7F), и затем инкубировали; добавляли вторичное козье античеловеческое антитело С-Каппа, меченное пероксидазой хрена («Sigma Co.», каталожный номер: K3502) и в итоге добавляли ТМВ (тетраметилбензидин) для развития реакции и 2 М серной кислоты для остановки реакции; таким образом, определяли связывание белков Fab с ФНО-α. В соответствии с таким способом скрининга были получены три Fab с более высокой активностью: KS-2E, KS-7F и KS-7A, указанные белки в общем содержат два разных VH (VH01 и VH02, причем последовательность аминокислот VH01 показана в SEQ ID №:25, а ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:26; последовательность аминокислот VH02 показана в SEQ ID №:27, а ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:28), и два разных VK (VK03 и VK05, причем последовательность аминокислот VK03 показана в SEQ ID №:29, а ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:30; последовательность аминокислот VK05 показана в SEQ ID №:31, а ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:32 (Таблица 1)).

Результат тестирования активности связывания гуманизированного Fab к ФНО-α методом ELISA проиллюстрирован на Фиг.1. Данный результат показывает, что три гуманизированных Fab, полученных, как описано выше, обладают сродством к антигену, близким к сродству, которым обладает фрагмент Fab Ремикейда - химерного антитела человека-мыши, причем EC₅₀ для связывания KS-7A и KS-7F с ФНО-α выше, чем для связывания фрагмента Fab химерного антитела человека-мыши Ремикейда (таблица 2).

Таблица 1
Fab гуманизированных антител к ФНО-α
Фрагмент Fab	VH	VK
KS-2E	VH01	VK03
НП	VH02	VK03
KS-7F	VH01	VK05
KS-7A	VH02	VK05
Примечание: «НП» обозначает, что фрагмент Fab не был охарактеризован из-за низкой активности.

В Таблице 2 приведены EC₅₀ для связывания фрагмента Fab гуманизированных антител к ФНО-α с ФНО-α при ELISA

Таблица 2
Проба	EC50 (нМ)
Fab Ремикейда	3,324
KS-2E	6,659
KS-7A	3,027
KS-7F	2,740
Примечание: Данные в Таблице 2 приведены как средние значения для трехкратных экспериментов.

2. Определение биологической активности гуманизированных Fab при подавлении ФНО-α в эксперименте с цитотоксичностью L929.

Кроме того, биологическую активность трех гуманизированных Fab, указанных выше (KS-2E, KS-7F и KS-7A), в отношении нейтрализации ФНО-α проверяли в клеточно-биологическом эксперименте - в пробе на цитотоксичность L929. В данном эксперименте 1×10⁴ клеток L929 в логарифмич