Ингибирование axl сигнализации в антиметастатической терапии

Ингибирование axl сигнализации в антиметастатической терапии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение заявляет о приоритете Предварительной заявки США №61/336478, поданной 22 января 2010 года, содержание которой включено здесь в качестве ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к опухолевой инвазии и метастазированию, например, лечению или диагностике опухолевой инвазии и метастазирования через пути, связанные с AXL и/или GAS6.

Уровень техники

Инвазия и метастазирование - наиболее коварные и опасные для жизни аспекты рака. В то время как опухоли с минимальной инвазией или вообще неинвазивные могут быть успешно удалены, после того, как опухоль становится инвазивной, она может распространяться через лимфатические и/или сосудистые каналы в несколько мест, и полное удаление становится очень трудным. Инвазия и метастазирование уничтожают хозяина через два процесса: локальную инвазию и удаленную колонизацию органов с их повреждением. Локальная инвазия может привести к нарушению функции тканей от локального сжатия, локального разрушения или затруднения нормальной функции органа. Наиболее важным поворотным пунктом в раке, однако, является развитие отдаленных метастазов. Пациент не может быть вылечен локальной терапией на этом этапе.

Процесс метастазирования является каскадом связанных последовательных шагов с участием нескольких взаимодействий хозяин-опухоль. Этот сложный процесс требует от клеток входа в кровеносную или лимфатическую систему, задержки на отдаленном участке сосудистого или лимфатического русла, активного проникновения из сосудов в интерстициальную ткань и паренхиму органа, а также разрастания в качестве вторичной колонии. Метастатический потенциал зависит от местной микросреды, ангиогенеза, взаимодействий строма - опухоль, выработки цитокинов локальными тканями, а также молекулярных фенотипов опухоли и клеток хозяина.

Местная начальная стадия инфильтрирующего роста опухоли может произойти рано, несмотря на то, что удаленное распространение еще не очевидно или, возможно, еще не началось. Опухолевые клетки проникают в эпителиальную базальную мембрану и входят в основную интерстициальную строму в течение перехода от in situ к инвазивной карциноме. Как только опухолевые клетки проникают в основную строму, они получают доступ к лимфатическим и кровеносным сосудам для удаленного распространения при высвобождении фрагментов матрикса и факторов роста. При переходе от доброкачественной опухоли к инвазивной карциноме происходят общие и широкомасштабные изменения в организации, распределении и количестве эпителиальных базальных мембран.

Терапевтические усилия по профилактике и лечению рака в настоящее время сосредоточены на уровне сигнальных путей или селективных модулирующих белков. Активность протеинкиназы, гомеостаз и активация онкобелка являются управляющими сигналами и, следовательно, могут играть ключевую роль регуляторных участков для терапевтического вмешательства. Киназы в сигнальных путях, регулирующих инвазию и ангиогенез, могут быть важным регулятором метастазирования. Одним из крупнейших классов биохимических молекулярных мишеней является семейство рецепторов тирозинкиназы (RTKs). Наиболее распространенными молекулярными мишенями, относящимися к рецепторам тирозинкиназы, на сегодняшний день являются рецепторы EGF и васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF). Новейшие киназные молекулярные мишени включают в себя тип III RTK семейства c-kit и abl. Ингибиторы этих молекул прописывались в сочетании с классической химиотерапией.

Метастазы в конечном счете ответственны за большую часть страданий и смертности от рака. Существует необходимость идентифицировать и молекулярные и функциональные маркеры, которые определяют метастатические клетки рака и нацеливаться на них, а также создавать реагенты для их специфического ингибирования.

Публикации в этой области включают, в частности, Li et al. Oncogene. (2009) 28(39):3442-55; Заявку на патент США, 20050186571 Ullrich et al.; Заявку на патент США 20080293733 Bearss et al.; Sun etal. Oncology. 2004; 66(6):450-7; Gustafsson et al. Clin Cancer Res. (2009) 15(14):4742-9; Wimmeletal. Eur J Cancer. 2001 37(17):2264-74; Koorstra et al. Cancer Biol Ther. 2009 8(7):618-26; Tai et al. Oncogene. (2008) 27(29):4044-55.

Рецептор тирозинкиназы AXL (также известный как Ufo и Tyro7) принадлежит к семейству тирозиновых рецепторов, которое включает в себя Tyro3 (Sky) и Mer (Tyrol 2). Общим лигандом для семейства AXL является GAS6 (Специфически задерживающий рост белок 6). AXL человека содержит открытую рамку считывания в 2682п.о. способную направлять синтез 894-аминокислотного полипептида. Два варианта мРНК были охарактеризованы, с вариантом 1 транскрипта можно ознакомиться в Genbank, по номеру доступа NM_021913.3, а с вариантом 2 транскрипта можно ознакомиться по номеру доступа NM_001699.4. Полипептидная последовательность нативного белка определяется как SEQ ID NO:1, а конкретная ссылка может быть сделана к последовательности с учетом аминокислотных модификаций. Важные функции клеточного GAS6/AXL включают клеточную адгезию, миграцию, фагоцитоз, и ингибирование апоптоза. Семейство рецепторов GAS6 и AXL строго регулируемо в тканях и определенным образом при болезни.

AXL характеризуется уникальной молекулярной структурой, заключающейся в том, что внутриклеточная область имеет типичную структуру рецептора тирозинкиназы, а внеклеточный домен содержит мотивы фибронектина III и Ig, похожие на молекулы адгезии кадгеринового типа. В течение развития, AXL экспрессируется в различных органах, включая мозг, что предполагает, что этот RTK участвует в развитии мезенхимы и нервной системы. У взрослых экспрессия AXL низка, но в различных опухолях экспрессия возвращается к высоким уровням. GAS6 является пока единственным активирующим лигандом для AXL.

Рецепторы тирозинкиназы (RTK), как правило, активируется лигандами, которые способствуют димеризации рецептора и, в свою очередь, аутофосфорилированию остатков тирозина в цитозольном домене. Связывание сигнальных белков в этих фосфорилированных остатках тирозина приводит к последующей передаче сигнала в сигнальном пути. Семейство AXL RTKs уникально тем, что его члены активируются GAS6, членом семейства витамин К-зависимых белков, которые напоминают факторы свертывания крови, а не типичные факторы роста.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано частично на открытии того, что пути связанные с AXL и/или GAS6 связаны с инвазией опухоли и/или метастазированием. Соответственно, настоящее изобретение относится к композициям и способам, которые используются для лечения опухолевой инвазии и/или метастазирования, например, с помощью ингибирования путей связанных с AXL и/или GAS6. Кроме того, данное изобретение обеспечивает реагенты и способы, которые полезны для определения чувствительности или вероятности того, что опухоль станет инвазивной и/или метастатической, например, с помощью определения уровня активности AXL и/или GAS6.

В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения предлагается растворимый вариант полипептида AXL, отличающийся тем, что полипептид не имеет трансмембранного домена AXL и, необязательно, внутриклеточного домена, и содержит, по меньшей мере, одну модификацию аминокислоты по сравнению с последовательностью AXL дикого типа, и где указанные изменения повышают сродство связывания полипептида AXL к GAS6. В некоторых вариантах воплощения растворимый вариант полипептида AXL содержит, по меньшей мере, одну модификацию аминокислоты в участке, выбранном из группы, состоящей из 1) между 15-50, 2) между 60-120 и 3) между 125-135 в последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO:1). В некоторых других вариантах воплощения, растворимый вариант полипептида AXL содержит, по меньшей мере, одну модификацию аминокислоты в положении 19, 23, 26, 27, 32, 33, 38, 44, 61, 65, 72, 74, 78, 79, 86, 87, 88, 90, 92, 97, 98, 105, 109, 112, 113, 116, 118, 127 или 129 последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO:1), или их сочетание. В некоторых других вариантах воплощения растворимый вариант полипептида AXL содержит, по меньшей мере, одну модификацию аминокислоты, которая выбрана из группы, состоящей из 1) А19Т, 2) Т23М, 3) E26G, 4) E27G или E27K, 5) G32S, 6) N33S, 7) T38I, 8) T44A, 9) H61Y, 10) D65N, 11) A72V, 12) S74N, 13) Q78E, 14) V79M, 15) Q86R, 16) D87G, 17) D88N, 18) I90M или I90V, 19) V92A, V92G или V92D, 20) I97R, 21) T98A или Т98Р, 22) T105M, 23) 0109R, 24) V112A, 25) F113L, 26) H116R, 27) T118A, 28) G127R или G127E и 29) E129K и их комбинации и консервативные эквиваленты.

В еще некоторых других вариантах воплощения растворимый вариант полипептида AXL содержит замены аминокислот по сравнению с последовательностью AXL дикого типа (SEQ ID NO:1) по следующим позициям: (а) глицин 32; (b) аспарагиновая кислота 87; (с) валин 92; и (d) глицин 127. В еще некоторых других вариантах воплощения растворимый вариант полипептида AXL содержит такие изменения: остаток глицина 32 заменен остатком серина, остаток аспарагиновой кислоты 87 заменен остатком глицина, остаток валина 92 заменен остатком аланина, или остаток глицина 127 заменен остатком аргинина или их комбинация, или консервативный эквивалент. В еще нескольких других вариантах воплощения растворимый вариант полипептида AXL содержит замены аминокислоты по сравнению с последовательностью AXL дикого типа (SEQ ID NO:1) по следующим позициям: (а) глутаминовая кислота 26; (b) валин 79; (с) валин 92; и (d) глицин 127. В еще нескольких других вариантах воплощения растворимый вариант полипептида AXL содержит такие изменения: остаток глутаминовой кислоты 26 заменен остатком глицина, остаток валина 79 заменен остатком метионина, остаток валина 92 заменен остатком аланина или остаток глицина 127 заменен остатком глутаминовой кислоты или их комбинацией или консервативным эквивалентом.

В некоторых других вариантах воплощения растворимый вариант полипептида AXL содержит, по меньшей мере, аминокислоты 1-437, 19-437, 130-437, 19-132, 1-132 полипептида AXL дикого типа (SEQ ID NO:1). В еще нескольких других вариантах воплощения растворимый вариант полипептида AXL является гибридным белком, содержащим область Fc.

В одном из вариантов воплощения растворимый вариант полипептида AXL имеет сродство по меньшей мере 1×10^-5 М к GAS6. В другом варианте воплощения растворимый вариант полипептида AXL имеет сродство по меньшей мере 1×10^-6 М, к GAS6. В еще одном варианте воплощения растворимый вариант полипептида AXL имеет сродство по меньшей мере 1×10^-7 М к GAS6. В еще одном варианте растворимый вариант полипептида AXL имеет сродство по меньшей мере 1×10^-8 М к GAS6. В еще одном варианте воплощения растворимый вариант полипептида AXL обладает сродством, по меньшей мере, около 1×10^-9 М, 1×10^-10 М, 1×10^-11 М, или 1×10^-12 М к GAS6. В различных вариантах воплощения, описанных здесь, растворимый вариант полипептида AXL показывает сродство к GAS6, что, по меньшей мере, примерно в 2 раза сильнее, чем сродство полипептида AXL дикого типа. В некоторых вариантах воплощения растворимый вариант полипептида AXL показывает сродство к GAS6, что составляет по меньшей мере в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 15 раз, в 20 раз, в 25 раз, или в 30 раз сильнее, чем сродство полипептида AXL дикого типа.

В другом варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает выделенные антитела или их фрагменты, которые специфически связываются с GAS6 белком (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах воплощения выделенное антитело или его фрагмент представляет собой моноклональное антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело (ScFv) или их комбинации. В некоторых других вариантах воплощения выделенное антитело или его фрагмент связывает эпитоп, который состоит из одного или нескольких аминокислотных участков GAS6, которые выбраны из группы, состоящей из R299-T317, V364-P372, R389-N396, D398-A406, Е413-Н429, и W450-M468. Еще в нескольких других вариантах воплощения выделенное антитело или его фрагмент связывает эпитоп, который содержит аминокислотный участок, выбранный из группы, состоящей из RMFSGTPVIRLRFKRLQPT (SEQ ID NO:3), VGRVTSSGP (SEQ ID NO:4), RNLVIKVN (SEQ ID NO:5), DAVMKIAVA (SEQ ID NO:6), ERGLYHLNLTVGGIPFH (SEQ ID NO:7) и WLNGEDTTIQETVKVNTRM (SEQ ID NO:8).

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение относится к способам лечения, снижения или предотвращение метастазирования, или инвазии опухоли в организме пациента, относящегося к млекопитающим. В одном варианте воплощения способ включает введение указанному пациенту эффективной дозы растворимого варианта полипептида AXL или выделенного анти-GAS6 антитела, или его фрагмента.

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение относится к способам лечения, снижения или предотвращение метастазирования, или инвазии опухоли в организме пациента, относящегося к млекопитающим. В одном варианте воплощения способ включает введение одного или нескольких ингибиторов, выбранных из группы, состоящей из (а) ингибитора активности AXL, (b) ингибитора активности GAS6; и (с) ингибитора взаимодействия AXL-GAS6. В различных вариантах воплощения, описанных здесь, ингибитор представляет собой полипептид, полинуклеотид, небольшую молекулу, антитело, фрагмент антитела, или лекарственный конъюгат антитела.

Еще в одном варианте воплощения настоящее изобретение предлагает способы определения способности опухоли к инвазии или метастазированию в субъекте. В одном из вариантов воплощения способ включает в себя определение уровня активности AXL и/или активности GAS6 в биологическом образце от субъекта с опухолью; и сравнение уровня активности AXL и/или GAS6 в биологическом образце с заранее установленным уровнем, в котором увеличение по сравнению с заранее установленным уровнем, свидетельствует о предрасположенности опухоли к инвазии или метастазированию.

Краткое описание фигур

Фигура 1. Экспрессия AXL коррелирует с прогрессированием опухоли и метастазами рака молочной железы и рака яичников человека. А. Репрезентативные изображения иммуногистохимического окрашивания AXL в нормальной ткани молочной железы (нормальный), первичных инфильтратах протоковой карциномы (стадия 1, 2, и 3) и метастазах лимфатических узлов (лимфатические узлы). Следует отметить, что высокий уровень мембранного окрашивания AXL наблюдается на 2 стадии (стрелки), 3-й стадии, а также на метастазах в лимфоузлы. Отсутствие окрашивания AXL наблюдался в нормальной или опухолевой строме (*). В. Репрезентативные изображения иммуногистохимического окрашивания AXL в нормальном эпителии яичников (стрелка), стадия II, стадия III, и метастазах сальника, полученных от пациентов с серозной аденокарциномой. Обратите внимание, что нормальная и опухолевая стромы были отрицательными по окрашиванию AXL (*).

Фигура 2. Генетической инактивации AXL достаточно, чтобы заблокировать метастазы молочной железы и яичников. А. Иммуногистохимическое окрашивание Н & Е и AXL в легких мышей; через хвостовую вену мышам вводили клетки линии MDA-231 shscramble (малая шпилечная РНК случайной последовательности shSCRM) и shAXL (малая шпилечная РНК к последовательности AXL-shAXL). На фотографии представлены 5 мышей из группы. Графики показывают результаты ПЦР в реальном времени экспрессии человеческих GASPDH и AXL в здоровых легких мышей, которым вводили клетки линии MDA-231 shSCRM или shAXL (п=5). В. Фотографии мышей, сделанные через 28 дней после инъекции SKOV3ip.1 клеток shscramble (shSCRM) и shAXL (shAXL). Обратите внимание, что введение shSCRM мышам привело к развитию многочисленных метастазов в брюшной полости (отмечены кружком). Для shAXL группы показаны мыши с наибольшей опухолевой нагрузкой. Графики справа показывают среднее количество перитонеальных метастазов мыши >5 мм по размеру и средний вес крупных опухолей. На фотографии представлены пять мышей из группы. С. Фотографии мышей, сделанные через 34 дня после инъекции OVCAR-8 клеток shSCRM и shAXL. Обратите внимание, что введение shSCRM мышам приводило к развитию многочисленных метастазов в брюшной полости (отмечены кружком). Графики справа показывают среднее общее число перитонеальных метастазов на мышь и среднюю общую массу опухоли. На фотографии представлены восемь мышей из группы.

Фигура 3. Генетическая инактивация AXL не влияет на пролиферацию клеток опухоли молочной железы или яичников in vitro или рост in vivo. А. Кривые клеточного роста для MDA-231, SKOV3ip.1 и OVCAR-8 клеток стабильно экспрессирующих последовательности shPHK контроля scramble (shSCRM) или AXL (shAXL). Измерения проводились троекратно, и погрешность измерений представлена S.E.M. В. Средние объемы опухоли ортотопической MDA-231 (п=8 мышей в группе) и подкожной SKOV3ip.l опухоли (п=4 мыши в группе) выросли за время 48-дневного курса. Погрешность измерений представлена S.E.M.

Фигура 4. AXL регулирует инвазию клеток опухоли яичников и молочной железы in vitro. А. Анализ инвазии в коллаген под контролем (shSCRM) и с дефицитом AXL (shAXL) клеток MDA-231, SKOV3ip.1 и OVCAR-8. Фотографии были сделаны через 7 дней после внедрения клеток в коллаген и на них представлено по три образца из группы. Обратите внимание на инвазивный фенотип, наблюдаемый в AXL клетках дикого типа (ветвления) по сравнению с AXL дефицитными клетками (округлый). Графики показывают количественный анализ инвазии в коллаген. В. Анализ способом ПЦР в реальном времени экспрессии ММР-2 в shAXL и shSCRM SKOV3ip.1 клеток. Значения экспрессии нормированы на 18S; п=3. Погрешность определения представлена S.E.M.. Звездочки указывают на значительное увеличение или уменьшение экспрессии по сравнению с shSCRM, как это определено по t-критерию Стьюдента (**, p<0,001). С. ММР-2 значения из анализа shSCRM или shAXL SKOV3ip.1 клеток (п=6). D. Желатиновая зимография анализа активности про- и активного- ММР-2, в кондиционированной среде, собранной из сыворотки истощенных SKOV3ip.1 клеток. Е. Вестерн-блот анализ фосфо-AKT на Ser473 (P-AKT), общая AKT (AKT), и экспрессии AXL в SKOV3ip.1 клетках, экспрессирующих ShРНК целевые последовательности для контроля scramble (shSCRM) или AXL (shAXL) и истощенных SKOV3ip.1 клеток (strve), обработанных с GAS6 или ингибитором PI3K Ly294002 (Ly) с GAS6. ММР-2 значения из анализа истощенных SKOV3ip.1 клеток (strve), обработанных с GAS6 или GAS6 с ингибитором PI3K Ly294002 (Ly+GAS6).

Фигура 5. Эктодоменная терапия растворимыми AXL ингибирует AXL сигнализацию и инвазию in vitro. А. Схематическое изображение механизма терапии растворимыми AXL. Растворимые AXL (sAXL) функционируют в качестве рецепторов-ловушек для ингибирования эндогенной передачи сигнала AXL. В. Вестерн-блот анализ фосфо-AKT на Ser473 (P-AKT), общей AKT (AKT) и экспрессии AXL в клетках MDA231, SKOV3ip.1 и OVCAR-8, экспрессирующих последовательности ShPHK контроля scramble (shSCRM) или AXL (shAXL), и истощенных клеток SKOV3ip.1 (strve), обработанных GAS6 или ингибитором PI3K Ly294002 (Ly) с GAS6. С. Вестерн-блот анализ экспрессии фосфо-AKT Ser473a клетках, обработанных в одной из кондиционированных сред, содержащих растворимый AXL рецептор (sAXL) или контрольную среду (-). Все клетки культивировали в бессывороточной среде в течение 48 часов и обрабатывали GAS6 (+) или контрольной средой (-). D. Анализ инвазии в коллаген MDA-231 клеток, обработанных кондиционированной средой, содержащей контрольный вектор или sAXL.

Фигура 6. Лечение с помощью растворимых AXL рецепторов ингибирует метастатическую опухолевую нагрузку у мышей с установленными метастазами. А. Схематическое изображение исследования лечения растворимым AXL рецептором. Голым мышам и.п. (интраперитонеально) ввели 1×10⁶ SKOV3ip.1 клеток. Через пять дней после имплантации проверяли наличие макроскопических поражений у мышей (на фотографии показана мышь с перитонеальным метастазом на 5-й день после инъекции, метастатические поражения отмечены кружком). На 7-й день мышам вводили аденовирус, экспрессирующий IgG2a-Fc контроль (Ad-Fc) или растворимый AXL рецептор (Ad-sAXL). Сывороточные уровни экспрессии sAXL оценивали по данным Вестерн-блоттинга каждые 3-4 дня после аденовирусной инъекции. В последующие 28 дней, после имплантации опухолевых клеток, оценивали опухолевую нагрузку у всех мышей. В. Представлены фотографии мышей, получавших путем экспрессии аденовируса Ad-sAXL или Ad-Fc через 28 дней после инъекции опухолевых клеток. Метастатические поражения отмечены кружком. Графики показывают среднее общее количество и вес опухоли для 7 мышей в группе. Погрешность измерений представлена S.E.M.. Отметим, что статистическая разница в количестве опухоли и весе (р=0,01, t-критерий Стьюдента) наблюдалась между мышами, обработанными Ad-Fc или shPHK Ad-sAXL (*). С.Анализ ПЦР в реальном времени экспрессии ММР-2 в опухоли мышей с Ad-Fc или Ad-AXL.

Фигура 7. Терапия растворимыми эктодоменами AXL не вызывает токсичность в нормальных тканях. А. Полное СВС и биохимический анализ сыворотки мышей, обработанными контролем (Fc) или растворимыми AXL (sAXL). В. Н & Е окрашивание тканей печени и почек, отобранных у мышей обработанных Fc или sAXL.

Фигура 8. Схема, иллюстрирующая молекулярные механизмы, связанные с торможением метастазирования растворимым рецептором AXL. Терапия растворимым рецептором AXL (sAXL) действует как рецептор-ловушка, который связывается с лигандом AXL GAS6. sAXL ингибирует путь эндогенной GAS6-AXL сигнализации, который стимулирует клеточную инвазию и метастазирование.

Фигура 9. Создание дефицитных по AXL линий раковых клеток молочной железы и яичников. А. Вестерн-блот анализ экспрессии AXL на панели человеческих линий раковых клеток молочной железы и яичников. Белок теплового шока 70 (Hsp70) был использован в качестве контроля загрузки белка. В. Вестерн-блот анализ экспрессии AXL в линиях раковых клеток метастатического рака молочной железы (MDA-231), яичников (SKOVSip.1 и OVCAR-8), стабильно трансфецированных мшРНК последовательностью контроля (scramble) (shSCRM) или AXL (shAXL). Обратите внимание, что shAXL клеточные линии имеют значительное уменьшение экспрессии AXL.

Фигура 10. AXL не влияет на клеточную адгезию или выживание клеток опухоли молочной железы и яичников. А-В. Процент миграции клеток MDA-231 (А) и SKOVSip.1 (В) миграции клеток к сыворотке, которая выступает как хемоаттрактант, при анализе в камере Бойдена. C-D. Анализы MDA-231 (A) SKOV3ip.1 (В) клеточной адгезии к белкам внеклеточного матрикса. Сокращения: бычий сывороточный альбумин (BSA), фибронектин (FN), коллаген типа I (Col I), коллаген типа IV (Col IV), ламинин (LN), фибриноген (FBN). Погрешности измерений представляют собой стандартную ошибку среднего. E-F. Анализ выживания AXL дикого типа и AXL дефицитных MDA-231 (Е) и SKOV3ip.1 (F) опухолевых клеток после удаления сыворотки, как это определено ХТТ анализом.

Фигура 11. Лечение с помощью растворимых AXL рецепторов ингибирует метастатическую опухолевую нагрузку у мышей с установленными OVCAR-8 метастазами. А. Схематическое изображение исследования лечения растворимым AXL рецептором. Голым мышам были интраперитонеально введены 5×10⁶ OVCAR-8 клеток. Спустя четырнадцать дней после имплантации проверяли наличие макроскопических поражений у мышей (на фотографии показана мышь с перитонеальным метастазом на 14-й день после инъекции, метастатические поражения отмечены кружком). На 14-й день мышам вводили аденовирус, экспрессирующий IgG2a-Fc контроль (Ad-Fc) или растворимый AXL рецептор (Ad-sAXL). Сывороточные уровни экспрессии sAXL оценивали по данным Вестерн-блот анализа. В последующие 34 дня после имплантации опухолевых клеток, опухолевую нагрузку оценивали у всех мышей. В. Представлены фотографии мышей, получавших аденовирусы, экспрессирующие Ad-sAXL или Ad-Fc через 28 дней после инъекции опухолевых клеток. Метастатические поражения отмечены кружком. С. Графики показывают среднее общее количество и вес опухоли для 8 мышей в группе. Погрешности измерений представлены S.E.M.. Отметим, что статистическая разница в количество и весе опухоли (p<0,01, t-критерий Стьюдента) наблюдалась между мышами, которых лечили Ad-Fc и Ad-sAXL (*).

Фигура 12. Анализ связывания AXL библиотеки выявил 5 продуктов для GAS6. На точечном графике проточной цитометрии дрожжевых клеток экспрессирующих AXL дикого типа (А) или пул AXL, выделяется 5 продуктов полученных путем направленной эволюции (В). Представлены данные анализа связывания с последующей диссоциацией, описанного в примере 2. Уровень связывания с 2 нМ GAS6 показан в левой колонке, уровень связывания с GAS6 после 4 часов показан в средней колонке, и уровни связывания с GAS6 после 6 часов приведены в правой колонке. Для клеток, которые являются положительными по экспрессии конкретного белка на поверхности клетки (правый верхний квадрант каждой точки участка проточной цитометрии), уровни связывания с GAS6 (y-ось) количественно представлены на графике ниже. Выделенные пять продуктов показывают значительно лучшее связывание с GAS6 по сравнению с диким типом AXL.

Фигура 13. Связывание улучшенных вариантов AXL с GAS6. Левая панель показывает равновесие связывания GAS6 с мутантами AXL S6-1 (красный квадрат) и S6-2 (голубые ромбы) по сравнению с диким типом AXL (зеленые кружки). Мутанты S6-1 и S6-2 показывают значительно более высокие уровни связывания с низкими концентрациями GAS6, демонстрируя более сильное сродство связывания для этих мутантов по сравнению с диким типом AXL. В правой панели показана кинетика диссоциации Gas6-AXL взаимодействия для AXL дикого типа или сконструированного AXL. При взаимодействие Gas6 с диким типом AXL образуется Gas6-AXL «дикий тип», который распадается быстро, как функция от времени, в то время как при взаимодействии сконструированных S6-1 ("S6-1") или S6-2 ("S6-2") с Gas6 показано значительное увеличение сохранности связывания.

Фигура 14. Внутрибрюшинная доставка очищенного AXL S6-1-Fc показывает усиление терапевтического эффекта дикого типа AXL-Fc и AXL E59R/T77R-Fc. Представлено два изображения вскрытия мышей из трех групп лечения, AXL E59R/T77R-Fc, AXL-Fc дикого типа, и AXL S6-1-Fc. Черные кружки на снимках, указывают на видимое метастатическое поражение, но не обязательно показывают все метастазы. AXL-Fc дикого типа показывает умеренное ингибирование метастазирования, но превышающее отрицательный контроль, AXL E59R/T77R, a AXL S6-1 показывает почти полное подавление метастазирования.

Фигура 15. Ингибирование метастазирования в ксенографной модели SKOV3ip.1. На первых двух графиках один и тот же набор данных представлен двумя различными способами, чтобы показать, как среднее количество метастазов учитывается в каждой группе лечения. Кроме того, два нижних графика показывают тот же набор данных, который описывает общий вес всех метастазов, которые вырезали из мышей в каждой группе. AXL-Fc дикого типа препятствует распространению метастазов по сравнению с отрицательным E59R/T77R-Fc контролем, о чем свидетельствует снижение как количества повреждений (верхняя панель), так и общий вес (нижняя панель). AXL S6-1-Fc показывает значительное снижение опухолевой массы по сравнению с диким типом AXL-Fc и AXL E59R/T77R-Fc, как можно оценить по количеству поражений (верхняя панель), а также общему весу (нижняя панель). Эти данные показывают, что увеличенное сродство AXL S6-1 обеспечивает повышенную терапевтическую эффективность для дикого типа, и что AXL S6-1-Fc является эффективным способом лечения для борьбы с метастазированием.

Определения

В описании, представленном ниже, широко используется целый ряд терминов, обычно применяемых в области культуры клеток. В целях обеспечения четкого и последовательного понимания описания и формулы изобретения, а также объема, определяемого этими терминами, предусмотрены следующие определения.

"Ингибиторы", "активаторы" и "модуляторы" AXL на метастатических клетках или его лиганда GAS6 используются для обозначения ингибирующих, активирующих или модулирующих молекул соответственно, и определены с использованием in vitro и in vivo анализов связывания рецепторов или лигандов, и передачи сигналов, например, лигандов, рецепторов, агонистов, антагонистов и их гомологов и миметиков.

Термин «полипептид», «пептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера, состоящего из аминокислотных остатков. Термин распространяются и на аминокислотные полимеры, в которых один или более аминокислотных остатков является искусственным химическим миметиком, соответствующим природной аминокислоте, а также на природные аминокислотные полимеры, и не встречающиеся в природе аминокислотные полимеры.

Термин "аминокислота" означает природные и синтетические аминокислоты, а также аналоги аминокислот и миметики аминокислот, которые функционируют подобно природным аминокислотам. Природные аминокислоты кодируются генетическим кодом, также как аминокислоты, которые затем модифицируются, например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые имеют ту же основную химическую структуру природных аминокислот, то есть альфауглерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R группой, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, S-метилметионин. Такие аналоги, имеют измененные R группы (например, норлейцин) или модифицированные боковые пептидные связи, но у них сохранена базовая химическая структура природных аминокислот. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличную от общей химической структуры аминокислот, но функции аналогичные природным аминокислотам. В настоящем изобретении используются отдельные буквы, для обозначения аминокислот, которые являются общепринятыми символами аминокислот, широко используемыми в этой области, например, А означает аланин, С означает цистеин и др. Когда аминокислота представлена одной буквой до и после соответствующей позиции, это означает замену первоначальной аминокислоты (до) в данной позиции на измененную аминокислоту (после). Например, А19Т означает, что аминокислота аланин в положении 19 меняется на треонин.

Термин "субъект", "индивид" и "пациент" используются здесь взаимозаменяемо для обозначения млекопитающих, которых анализируют в процессе лечения и/или которые проходят лечение. В одном варианте воплощения млекопитающее является человеком. Термины "субъект", "индивид" и "больной" таким образом, охватывают лиц, имеющих рак, в том числе, без ограничений, аденокарциномы яичников или простаты, рак молочной железы, глиобластомы и т.д., в том числе тех, кто подвергся или являются кандидатами на удаление злокачественной ткани (операцию). Субъекты могут быть человеком, но также включают и других млекопитающих, особенно млекопитающих, полезных в качестве лабораторных моделей для заболеваний человека, например, мышь, крысу и т.д.

Термин «опухоль», как он использован здесь, относится ко всем неопластическим клеточным образованиям, независимо от злокачественного или доброкачественного характера пролиферации, и всем предраковым и раковым клеткам и тканям.

Термины "рак", "новообразование" и "опухоль" используются здесь взаимозаменяемо для обозначения клеток, которые характеризуются автономным, нерегулируемым ростом так, что они обладают аномальным фенотипом роста, и характеризуются значительной потерей контроля над клеточной пролиферацией. В общем, клетки, представляющие интерес для обнаружения, анализа, классификации или лечения в настоящей заявке включают предраковые (например, доброкачественные), злокачественные, преметастатические, метастатические и неметастатические клетки. Примеры рака включают, но не ограничиваются ими, раком яичников, глиобластомой, раком молочной железы, раком толстой кишки, раком легких, раком простаты, гепатоцеллюлярным раком, раком желудка, раком поджелудочной железы, раком шейки матки, раком яичников, раком печени, раком мочевого пузыря, раком мочевыводящих путей, раком щитовидной железы, раком почки, карциномой, меланомой, раком головы и шеи, а также раком мозга.

"Патология" рака включает в себя все явления, которые ставят под угрозу благополучие пациента. Это включает в себя, но не ограничивается этим, нарушение или неконтролируемый рост клеток, метастазирование, вмешательство в нормальное функционирование соседних клеток, секреция цитокинов или других секреторных продуктов в аномальных количествах, подавление или обострение воспалительной или иммунологической реакции, неоплазию, предопухолевое состояние, злокачественные опухоли, инвазию в окружающие или отдаленные ткани или органы, такие как лимфатические узлы, и т.д.

Термины "раковый рецидив" и "опухолевый рецидив", как они используются здесь, и их грамматические варианты обозначают дальнейший рост опухолевых или раковых клеток после установления диагноза рак. В частности, рецидив может произойти, когда дальнейший рост раковой клетки происходит в раковой ткани. "Распространение опухоли" также происходит, когда клетки опухоли распространяются в местных или отдаленных тканях и органах, поэтому распространения опухоли включает в себя метастазирование опухоли. "Инвазия опухоли" возникает, когда рост опухоли распространился на местном уровне, нарушая функции участвующих тканей за счет сжатия, деструкции или предотвращения нормальной функции органа.

Термин "метастазирование", как он использован здесь, относится к росту раковой опухоли в органе или части тела, которые непосредственно не связаны с органом первоначальной раковой опухоли. Метастазирование также включает микрометастазирование - присутствие некоторого неопределяемого количества раковых клеток в органе или части тела, которые непосредственно не связаны с органом первоначальной раковой опухоли. Метастазирование может быть определено как несколько шагов процесса, таких как выход раковых клеток из места первоначальной опухоли, миграция и/или инвазия раковых клеток в другие части тела. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает способ определения риска дальнейшего роста одной или нескольких раковых опухолей в органе или части тела, которые непосредственно не связаны с органом первоначальной раковой опухоли, и/или любые шаги в процессе подготовки для этого роста.

В зависимости от характера рака получается соответствующий образец пациента. Используемое здесь выражение "раковый образец ткани" относится к любым клеткам, полученным из раковой опухоли. В случае твердых опухолей, которые не метастазируют, образец ткани получают из опухоли удаленной хирургическим путем, и готовят к тестированию с помощью обычных методик.

Для определения используется кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, твердые образцы тканей, такие как биопсия или тканевые культуры, или клетки, полученные из нее и их потомство. При определении также используются образцы, которые были изменены после их получения каким либо образом, например, путем обработки реагентами; промыванием; или обогащением определенных клеточных популяций, таких как раковые клетки. Образец также может быть обогащен отдельными видами молекул, например, нуклеиновыми кислотами, полипептидами и т.д. Термин «биологический образец» включает в себя клинический образец, а также ткань, полученную при хирургической резекции, ткань, полученную при биопсии, клетки в культуре, супернатанты клеток, клеточные лизаты, образцы тканей, органов, костного мозга, крови, плазмы, сыворотки, и тому подобное. «Биологический образец» также включает в себя образец, полученный от раковых клеток пациента, например, образец, включающий полинуклеотиды и/или полипептиды, которые получаются из раковых клеток пациента (например, лизат клеток или других клеточных экстрактов, включающих полинуклеотиды и/или полипептиды); а также образец, включающий раковые клетки пациента. Биологический образец, содержащий раковые клетки от пациента, также может включать нераковые клетки.

Термин "диагностика" используется здесь для обозначения определения молекулярного или патологического состояния или болезни, таких как идентификация молекулярных подтипов рака молочной железы, рака предстательной железы или других видов рака.

Термин "прогноз" используется здесь для обозначения предсказания вероятности связанных с раком смерти или прогрессирования, в том числе рецидивов, метастазирования и лекарственной устойчивости опухолевых заболеваний, таких как рак яичников. Термин "предсказание" используется здесь для обозначения акта предсказания или оценки, основанного на наблюдениях, опыте и научных рассуждениях. В одном примере врач может предсказать вероятность того, что пациент выживет после хирургического удаления первичной опухоли и/или химиотерапии в течение определенного периода времени без рецидива рака.

Используемые здесь термины "лечение", "лечить" и тому подобные, относятся к введению агента или проведению процедуры (например, облучение, хирургическое вмешательство и т.д.) в целях получения эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения болезни или ее симптома, и/или может быть терапевтическим с точки зрения осуществления частичного или полного излечения от болезни и/или симптомов заболевания. "Лечение", используемое здесь, включает в себя любое лечение любой метастатической опухоли у млекопитающих, в час