Автоматическая система для лизиса микроорганизмов, имеющихся в пробе, для извлечения и очистки нуклеиновых кислот указанных микроорганизмов с целью анализа

Автоматическая система для лизиса микроорганизмов, имеющихся в пробе, для извлечения и очистки нуклеиновых кислот указанных микроорганизмов с целью анализа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники настоящего изобретения относится к области биологического анализа. Более конкретно, настоящее изобретение относится, во-первых, к устройству для лизиса микроорганизмов, имеющихся в пробе из окружающей среды или в клинической пробе, для извлечения и для очистки нуклеиновых кислот указанных микроорганизмов. Кроме того, изобретение относится к автоматической системе для лизиса микроорганизмов для извлечения и для очистки нуклеиновых кислот указанных микроорганизмов с целью анализа.

В течение нескольких лет в больницах наблюдается рост назокомиальных инфекций. Данные инфекции объясняются контаминацией госпитализируемых людей, имеющих, вследствие этого, выявленную иммунодепрессию, за счет болезнетворных микроорганизмов, присутствующих в больничной среде и не уничтожаемых несмотря на значительные усилия, постоянно прикладываемые для дезинфекции оборудования и поверхностей и для обработки воздуха. Ввиду этих все более и более частых случаев окружающей микробиологической контаминации, разработка устройств и способов улучшения и облегчения мероприятий по охране окружающей среды становится основной проблемой для работников здравоохранения.

В дополнение к проблеме назокомиальных инфекций, контроль за окружающими условиями в течение многих лет также был текущей проблемой в промышленности, в частности в пищевой промышленности и фармацевтической и косметической промышленности. В пищевой промышленности хорошо известны катастрофические последствия для здоровья потребителей, которые могут произойти из-за заражения продуктов или даже сырья болезнетворными микроорганизмами. Действительно, пищевое отравление по причине бактерий, таких как бактерии рода Listeria или Salmonella, в настоящее время стало обычным явлением. Контроль за качеством воздуха также является ключевым процессом в регулировании качества в фармацевтической и косметической промышленности.

Более того, меры контроля должны соответствовать все более повышающимся требованиям, поскольку нормативные документы все время становятся более жесткими.

В распоряжении работников здравоохранения или производителей, среди инструментов для осуществления мер по контролю за окружающими условиями, приборы для отбора микробиологических проб воздуха являются предпочтительными решениями для обнаружения микроорганизмов, содержащихся в воздухе. Данные устройства помещают в подходящие точки в местах, где требуется измерение микробиологического заражения воздуха. В общем, они состоят из прибора для отбора проб воздуха, соединенного с культуральной средой. Воздух, отобранный посредством прибора для отбора проб воздуха, входит в контакт с культуральной средой; любые микроорганизмы, содержащиеся в отобранном воздухе, будут помещены в культуральную среду. Затем культуральную среду извлекают и помещают в термостат, чтобы способствовать помочь росту микроорганизмов. Таким образом, становится возможным обнаружение и идентифицирование указанных микроорганизмов с помощью общепризнанных микробиологических методик.

Тем не менее, данные устройства имеют основной недостаток, который связан с используемой технологией. Данным недостатком является время, необходимое для получения результата анализа. Действительно, чтобы обеспечить возможность идентификации, использование общепризнанных методик микробиологии, в частности бактериологии, требует инкубационных периодов, необходимых для клеточного роста, или даже фаз повторного посева на специфической культуральной среде. В результате время, требующееся для получения результата, является относительно долгим или даже очень долгим, при попытке обнаружения и идентифицирования патогена, который является ответственным за назокомиальную инфекцию или за пищевое отравление.

Еще один недостаток устройства данного типа состоит в том, что хотя использование культуральной среды делает возможным провести различие между родами и видами бактерий, в общем, это не позволяет проводить различие между штаммами одного и того же вида бактерий. В настоящее время известно, что патогенность микроорганизма может в значительной степени варьировать в зависимости от изучаемого штамма.

Более того, данный тип устройства имеет недостаток, что оно неспособно обнаруживать микроорганизмы, содержащиеся в воздухе, являющиеся жизнеспособными, но которые нельзя культивировать.

Более того, существуют устройства, предназначенные для извлечения взвешенных в воздухе частиц, в частности микроорганизмов. Так, документ GB-2 254024 описывает устройство для отбора взвешенных в воздухе частиц, принцип которого основан на циклонном эффекте. Как обнаружено, несмотря на то что данное устройство подходит для отбора взвешенных в воздухе частиц, включая микроорганизмы, оно никогда не рассматривалось для обработки полученных таким образом образцов, в частности для выделения генетического материала, предназначенного для использования для анализа.

В более общем смысле, методики, которые наиболее релевантны для целей идентификации микроорганизмов и/или скорости доставки результатов, по отношению либо к клиническим пробам, либо пробам из окружающей среды, несомненно, являются методиками молекулярной диагностики. Данные методики, основанные на анализе генетического материала микроорганизмов и, в частности, определенных интересующих специфических последовательностей, делают возможным получение очень точной идентификации микроорганизмов во время регистрации, поскольку они предоставляют возможность исключения стадий культивирования.

Тем не менее, использование подобных методик имеет определенные ограничения, наиболее важным из которых является потенциально ограниченное количество микроорганизмов, которые присутствуют в воздухе и, вследствие этого, могут быть извлечены для проведения анализа. В действительности, известно, что пробы из окружающей среды, а также некоторые клинические пробы содержат относительно небольшое количество микроорганизмов. Следовательно, из такого исходного материала получают только небольшое количество генетического материала. Вследствие этого, критическим параметром становится эффективность методики, используемой для выделения нуклеиновых кислот, на основании выхода.

Более того, большинство существующих методик для лизиса микроорганизмов не имеют общего применения для всех микроорганизмов и/или требуют вмешательства квалифицированного персонала обслуживания стадий, выполняемых вручную.

Документ WO-A-2005/038025 описывает способ выделения нуклеиновых кислот из микроорганизмов, в частности из проб воздуха. Данный способ включает использование трех различных способов лизиса, а именно химического лизиса, лизиса за счет теплового удара и механического лизиса. Несмотря на то что подобный способ, несомненно, предоставляет возможность оптимизации эффективности выделения нуклеиновых кислот и, вследствие этого, увеличения количества генетического материала, доступного для анализа, данная эффективность все-таки зависит от количества извлекаемых микроорганизмов. Кроме того, в данном документе ничего не описано для оптимизации выделения указанных микроорганизмов.

Документ US-5707861 описывает устройство для разрушения живых клеток, таких как микроорганизмы. Данное устройство делает возможным лизис клеток посредством использования стеклянных шариков, но в дополнение посредством действия колебания благодаря зазору, который имеется между пробирками, содержащими микроорганизмы, и отверстиями в опоре, поддерживающей указанные пробирки. Таким образом, устройство данного типа обеспечивает возможность оптимизации клеточного лизиса и, вследствие этого, оптимизации выделения генетического материала. Указанное устройство и способ, используемый последним, имеют те же ограничения, которые упомянуты выше, а именно, они все-таки зависят от количества выделяемых микроорганизмов. Более того, они имеют дополнительный недостаток, состоящий в необходимости последующей стадии концентрирования нуклеиновых кислот для того, чтобы изолировать их от продуктов распада клеток. В заключение, они требуют ручного выделения нуклеиновых кислот в конце стадии концентрирования.

Данные проблемы также возникают с устройством, описанным в документе US-5567050.

Также были описаны системы, которые являются более интегрированными. Так, документ WO-А-2004/018704 описывает устройство и связанный с ним способ, использующий методику ПЦР (Полимеразной Цепной Реакции) усиления, для отбора микроорганизмов из воздуха и их идентификации. Данная система особенно подходит для борьбы с попытками нападения посредством биологического заражения в почтовых сортировочных центрах. Данная система состоит из пробоотборника воздуха, расположенного вдоль контура для транспортировки почты, устройства для фильтрации/сепарации частиц с помощью циклонного действия, устройства для концентрирования/выделения частиц в пробе жидкости и устройства для переноса фракции пробы в картридж GeneXpert^TM для ПЦР анализа от компании Cepheid. Затем картридж вручную переносят в отдельный автоматический биологический анализатор для идентификации микроорганизма или микроорганизмов, отобранных из воздуха.

Несмотря на то что данная система обеспечивает возможность решения многих технических проблем, связанных с устройствами и способами, описанными выше, тем не менее, она имеет несколько основных недостатков. Первый из данных недостатков состоит в том, что система для обработки пробы (отбор, сепарация, концентрация/выделение) до переноса в картридж для анализа является относительно сложной и дорогой. Еще один недостаток состоит в том, что не существует картриджа GeneXpert^TM, который может выполнять как лизис, так и очистку нуклеиновых кислот. Дополнительный второй недостаток состоит в том, что отобранные микроорганизмы, выделяются в пробе жидкости, только часть которой анализируется. Это означает, что риск выделения не всех микроорганизмов и, вследствие этого, не всех нуклеиновых кислот является очень большим, значительно ограничивая релевантность анализа. Более того, несмотря на сложность, данная система требует ручного переноса картриджа в автоматический анализатор GeneXpert^TM.

Таким образом, первая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить устройство, систему и универсальный способ лизиса, который является эффективным для проб как из окружающей среды, так и клинических, для большого многообразия микроорганизмов, являются ли они бактериями, вирусами или грибами, по выбору в состоянии вегетативного развития, либо в виде спор.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить устройство, подходящее для эффективного лизиса указанных микроорганизмов, содержащихся в пробе из окружающей среды, например из воздуха, или в клинической пробе, для того чтобы выделить из нее нуклеиновые кислоты с целью анализа интегрированным образом.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить устройство, подходящее для отбора всех микроорганизмов, содержащихся в пробе воздуха.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить устройство простой конструкции, с минимизацией количества и сложности ручных стадий.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить устройство, являющееся чрезвычайно компактным.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить замкнутое устройство, в котором различные стадии, перечисленные выше, происходят без риска внешнего заражения.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить устройство, в котором указанные стадии происходят без переноса пробы оператором, предотвращая, таким образом, заражения последнего.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить устройство и систему, которая ограничивает вмешательство человека и улучшает возможность отслеживания обработки пробы.

В заключение, еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить устройство и автоматическую систему, допускающие подачу намеченных нуклеиновых кислот в буфер, который может быть использован непосредственно на стадиях молекулярной диагностики, включающих, например, стадии амплификации и обнаружения, без дополнительных стадий предварительной обработки, таких как центрифугирование или фильтрация.

Данные цели, среди прочих, достигаются с помощью настоящего изобретения, которое относится, во-первых, к устройству для отбора микроорганизмов, содержащихся в воздухе, при этом указанное устройство имеет:

- модуль для забора воздуха, включающий:

1) верхний элемент, имеющий проход для впуска воздуха, обеспечивающий поступление воздушной струи в указанный модуль, причем указанный проход снабжен в своем основании средством возмущения воздушной струи,

2) нижний элемент, имеющий средство выпуска воздуха, обеспечивающее выход созданной воздушной струи,

при этом указанные верхний и нижний элементы могут быть изготовлены в виде единого целого друг с другом таким образом, чтобы внутри указанного модуля для забора воздуха могла создаваться воздушная струя;

- картридж ориентировочно цилиндрической формы, имеющий зону задерживания микроорганизмов, при этом указанная зона задерживания имеет лизирующее средство микроорганизмов, причем указанный картридж расположен внутри указанного модуля для забора воздуха.

Предпочтительно, зона задерживания микроорганизмов картриджа устройства для отбора микроорганизмов дополнительно включает материал, который способен задерживать микроорганизмы, удерживать на своем месте лизирующее средство и растворяться в присутствии жидкости.

В устройстве согласно изобретению, средство возмущения воздушной струи включает конус стрельчатой формы, расположенный в центре высверленного отверстия прохода для впуска воздуха, и, по меньшей мере, одну лопасть, соединяющую указанную стрелообразную деталь с внутренней поверхностью канала для впуска воздуха.

Преимущественно, модуль для забора воздуха предназначен для соединения с контуром циркуляции воздуха или с устройством для аспирации воздуха.

Настоящее изобретение также относится к устройству для лизиса микроорганизмов, при этом указанное устройство имеет:

- картридж ориентировочно цилиндрической формы, имеющий зону задерживания для микроорганизмов, при этом указанный картридж выполняет роль статора;

- ротор, который может быть установлен в картридже, при этом указанный ротор имеет средство вращения.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, данное устройство дополнительно включает крышку, предназначенную для удерживания ротора в виде единого целого с картриджем.

Преимущественно, средство вращения состоит из желобков, сделанных в стенке сплошного прохода, при этом указанные желобки являются диаметрально противоположными и предназначены для приема конца трансмиссионного вала средства вращения указанного ротора.

Согласно заслуживающей упоминания характеристике устройства для лизиса микроорганизмов, внутренний диаметр картриджа больше, чем наружный диаметр ротора, так что, когда ротор вставляют в картридж, расстояние, отделяющее внутреннюю стенку картриджа от наружной стенки ротора, является достаточно большим, чтобы предоставить возможность расположения лизирующего средства в данном промежуточном пространстве, и достаточно маленьким для того, чтобы лизирующее средство находилось в контакте с одной или другой из указанных стенок.

Кроме того, настоящее изобретение относится к системе для лизиса микроорганизмов и очистки нуклеиновых кислот указанных микроорганизмов, имеющей:

- средство позиционирования устройства для лизиса микроорганизмов согласно изобретению;

- средство вращения ротора, когда устройство для лизиса устанавливают на средство позиционирования;

- по меньшей мере, один контейнер для приема нуклеиновых кислот;

- по меньшей мере, одно средство для аспирации/выпускания жидкости;

- многоходовой клапан, в жидкостном сообщении с устройством для лизиса микроорганизмов, контейнером для приема очищенных нуклеиновых кислот и средством для аспирации/выпускания жидкости.

Предпочтительно, данная система лизиса согласно предшествующему пункту дополнительно включает средство намагничивания. Она может включать также нагревающее средство.

Согласно особому варианту осуществления изобретения, многоходовой клапан включает средство аспирации-выталкивания.

Изобретение также относится к способу сбора микроорганизмов, содержащихся в воздухе, при этом указанный способ включает стадии, состоящие из:

а) установки картриджа внутри модуля для забора воздуха для того, чтобы получить устройство для отбора микроорганизмов согласно изобретению, при этом зона задерживания внутри указанного картриджа находится в сообщении с проходом для впуска воздуха модуля для забора воздуха,

b) вызывания прохождения воздуха в указанный модуль для забора воздуха посредством любого подходящего средства,

с) накапливания микроорганизмов, содержащихся в воздухе, в зоне задерживания картриджа.

Изобретение также относится к способу лизиса микроорганизмов, содержащихся в воздухе, при этом указанный способ имеет стадии, состоящие из:

а) установки картриджа внутри модуля для забора воздуха для того, чтобы получить устройство для отбора микроорганизмов согласно изобретению, при этом зона задерживания внутри указанного картриджа находится в сообщении с проходом для впуска воздуха модуля для забора воздуха,

b) вызывания прохождения воздуха в указанный модуль для забора воздуха посредством любого подходящего средства,

с) накапливания микроорганизмов, содержащихся в воздухе, в зоне задерживания картриджа,

d) извлечения картриджа из модуля для забора воздуха,

е) установки ротора в картридже для того, чтобы получить устройство для лизиса микроорганизмов,

f) позиционирования устройства для лизиса микроорганизмов в системе для лизиса микроорганизмов и очистки нуклеиновых кислот,

g) введения элюирующей жидкости в картридж для суспендирования лизирующего средства, расположенного в зоне задерживания микроорганизмов картриджа, и

h) механического лизиса микроорганизмов посредством вращения ротора внутри картриджа с помощью средства вращения указанного ротора, при этом указанный ротор вызывает вращение лизирующего средства микроорганизмов.

«Элюирующая жидкость» подразумевает любую жидкость, подходящую для осуществления лизиса или даже выделения и извлечения нуклеиновых кислот в хорошем состоянии. Указанная жидкость, в общем, представляет собой буфер. В случае, когда применение способа согласно изобретению происходит с целью выделения нуклеиновых кислот и извлечения их с целью анализа, указанный буфер должен предоставлять возможность сохранения указанных нуклеиновых кислот. Жидкости данного типа хорошо известны квалифицированным специалистам в данной области.

Изобретение также относится к способу выделения нуклеиновых кислот из микроорганизмов, содержащихся в воздухе, при этом указанный способ имеет стадии, состоящие из:

а) установки картриджа внутри модуля для забора воздуха для того, чтобы получить устройство для отбора микроорганизмов согласно изобретению, при этом зона задерживания внутри указанного картриджа находится в сообщении с проходом для впуска воздуха модуля для забора воздуха,

b) вызывания прохождения воздуха в указанный модуль для забора воздуха посредством любого подходящего средства,

с) накапливания микроорганизмов, содержащихся в воздухе, в зоне задерживания картриджа,

d) извлечения картриджа из модуля для забора воздуха,

е) установки ротора в картридже,

f) введения элюирующей жидкости в картридж с помощью средства аспирации-выпускания для суспендирования лизирующего средства, содержащегося в картридже, и

g) механического лизиса микроорганизмов посредством вращения ротора внутри картриджа с помощью средства вращения указанного ротора, при этом указанный ротор вызывает вращение лизирующего средства, и

h) аспирации элюирующей жидкости, заключающей в себе нуклеиновые кислоты указанных микроорганизмов, высвобожденные в процессе лизиса, и

i) переноса элюирующей жидкости в контейнер для приема и очистки нуклеиновых кислот.

Предпочтительно, способы лизиса микроорганизмов и выделения нуклеиновых кислот, описанные выше, включают дополнительную стадию d'), состоящую из выращивания микроорганизмов, локализованных в зоне задерживания картриджа.

Предпочтительно, выращивание достигается посредством инкубирования картриджа в термостате в течение периода времени в диапазоне от 2 до 24 часов.

Предпочтительно, стадии с f) по i) способов лизиса микроорганизмов и выделения нуклеиновых кислот, описанные выше, осуществляют в системе для лизиса микроорганизмов и очистки нуклеиновых кислот.

Изобретение также относится к способу лизиса микроорганизмов, при этом указанный способ имеет стадии, состоящие из:

а) получения картриджа, в котором микроорганизмы локализованы в зоне задерживания указанного картриджа,

b) установки ротора в картридже,

с) введения интересующей жидкости в картридж для суспендирования лизирующего средства, расположенного в зоне задерживания микроорганизмов картриджа, и

d) механического лизиса микроорганизмов посредством вращения ротора внутри картриджа, при этом указанный ротор вызывает вращение лизирующего средства микроорганизмов.

Изобретение также относится к способу выделения нуклеиновых кислот из микроорганизмов, при этом указанный способ имеет стадии, состоящие из:

а) получения картриджа, в котором микроорганизмы локализованы в зоне задерживания,

b) установки ротора в картридже,

с) введения элюирующей жидкости в картридж для суспендирования лизирующего средства, расположенного в зоне задерживания микроорганизмов картриджа, и

d) механического лизиса микроорганизмов посредством вращения ротора внутри картриджа, при этом указанный ротор вызывает вращение лизирующего средства микроорганизмов, и

е) аспирации элюирующей жидкости, содержащей нуклеиновые кислоты указанных микроорганизмов, высвобожденные в процессе лизиса, и

f) переноса элюирующей жидкости в контейнер для приема и очистки нуклеиновых кислот.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лизиса микроорганизмов, содержащихся в пробе жидкости, при этом указанный способ имеет стадии, состоящие из:

а) введения пробы жидкости, содержащей указанные микроорганизмы, в картридж поблизости от зоны задерживания таким образом, чтобы указанная проба жидкости приводила к суспендированию лизирующего средства, расположенного в указанной зоне задерживания микроорганизмов картриджа,

b) установки ротора в картридже,

с) механического лизиса микроорганизмов посредством вращения ротора внутри картриджа, при этом указанное вращение приводит к суспендированию лизирующего средства, расположенного в указанной зоне задерживания микроорганизмов картриджа, причем указанный ротор вызывает вращение лизирующего средства, на котором задерживаются микроорганизмы.

«Проба жидкости» подразумевает любую пробу жидкости, которая может содержать в себе микроорганизмы. Она может представлять собой пробу жидкости человеческого или животного происхождения. Указанной пробой может быть, например, моча, цельная кровь, плазма или любая другая текучая среда организма. Проба жидкости может быть пищевого происхождения, как, например, напиток. Также она может иметь происхождение из окружающей среды, как, например, вода. Более того, проба жидкости может также представлять собой так называемую переносящую жидкость, в которой любые микроорганизмы, присутствующие на поверхности устройства для взятия проб, типа тампона на стержне, такого как тампоны на стержне, продаваемые компанией COPAN под названием flockedSWABS, были ресуспендированы посредством встряхивания указанного тампона на стержне в указанной переносящей жидкости.

Изобретение также относится к способу выделения нуклеиновых кислот из микроорганизмов, содержащихся в пробе жидкости, при этом указанный способ имеет стадии, состоящие из:

а) введения пробы жидкости, содержащей указанные микроорганизмы, в картридж, поблизости от зоны задерживания, таким образом, чтобы указанная проба жидкости приводила к суспендированию лизирующего средства, расположенного в указанной зоне задерживания микроорганизмов картриджа,

b) установки ротора в картридже,

с) механического лизиса микроорганизмов посредством вращения ротора внутри картриджа, при этом указанное вращение приводит к суспендированию лизирующего средства, расположенного в указанной зоне задерживания микроорганизмов указанного картриджа, причем указанный ротор вызывает вращение лизирующего средства, на котором задерживаются микроорганизмы,

d) аспирации пробы жидкости, содержащей нуклеиновые кислоты указанных микроорганизмов, высвобожденные в процессе лизиса, и

е) переноса пробы жидкости в контейнер для приема нуклеиновых кислот.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу выделения нуклеиновых кислот из пробы клеточной ткани, при этом указанный способ имеет стадии, состоящие из:

а) введения пробы клеточной ткани в картридж в присутствии элюирующей жидкости,

b) установки ротора в картридже,

с) механического лизиса клеток клеточной ткани посредством вращения ротора внутри картриджа, при этом указанный ротор вызывает вращение лизирующего средства, содержащегося в картридже,

d) аспирации элюирующей жидкости, содержащей нуклеиновые кислоты, из указанных клеток, высвобожденные в процессе лизиса, и

е) переноса элюирующей жидкости в контейнер для приема и очистки нуклеиновых кислот.

«Тканевая проба» подразумевает любую тканевую пробу человеческого или животного происхождения, из которой есть возможность выделить нуклеиновые кислоты. Подобный образец может быть получен посредством биопсии, например, органа, мышцы или кожи. Данные ткани могут быть здоровыми или патологическими, а именно опухолевыми.

Необходимо заметить, что все способы выделения нуклеиновых кислот согласно изобретению могут иметь, согласно предпочтительному варианту осуществления, дополнительную стадию очистки данных нуклеиновых кислот с целью последующей обработки, такой как амплификация. Данная стадия очистки обеспечивает возможность разделения между нуклеиновыми кислотами и другими клеточными составляющими, обессоленными на стадии лизиса. Данная стадия в целом делает возможным концентрирование нуклеиновых кислот и может быть приспособлена для очистки ДНК и РНК. Она может быть выполнена посредством магнитных частиц. В качестве примера, можно использовать магнитные частицы, необязательно покрытые олигонуклеотидами, за счет адсорбции или ковалентных связей (см. патенты США 4675040 и 5750338), и таким образом очищать нуклеиновые кислоты, которые прилипли к данным магнитным частицам, посредством стадии очистки. Данная стадия очистки нуклеиновых кислот особенно полезна, если требуется последующая амплификация указанных нуклеиновых кислот. Особенно любопытный вариант осуществления данных магнитных частиц описан в патентных заявках WO-A-97/45202 и WO-A-99/35500. Еще одним любопытным примером способа очистки нуклеиновых кислот является использование диоксида кремния либо в виде колонны, либо в виде инертных частиц (Boom R. Et al., J. Clin. Microbiol., 1990, № 28(3), p. 495-503) или магнитных частиц (Merck: MagPrep^® Silica, Promega: MagneSil^TM Paramagnetic particles). Другие широко используемые способы основаны на ионообменных смолах в колонне или в формате парамагнитных частиц (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Еще одним способом, который является очень подходящим, но не эксклюзивным для изобретения, является адсорбция на подложке из оксида металла (от компании Xtrana: Xtra-Bind^TM matrix).

Более того, в различных способах, описанных выше, все стадии, следующие за воссозданием устройства для лизиса микроорганизмов, т.е. как только ротор был установлен в картридже, могут преимущественно быть использованы в системе для лизиса микроорганизмов и очистки нуклеиновых кислот.

Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию устройства для лизиса микроорганизмов согласно изобретению для лизиса клеток пробы клеточной ткани.

Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию системы для лизиса микроорганизмов и очистки нуклеиновых кислот указанных микроорганизмов согласно изобретению для лизиса клеток пробы клеточной ткани и очистки нуклеиновых кислот указанных клеток с целью анализа.

Микроорганизмы взяты из группы, включающей бактерии, вирусы, дрожжи, плесень и паразитов.

Пробы, из которых изолируют микроорганизмы, имеют происхождение из окружающей среды. Таким образом, это может быть проба воздуха или жидкости, такой как вода; или пробы с поверхности. Пробы также могут иметь клиническое происхождение, т.е. любая проба человеческого или животного происхождения, которая может являться объектом анализа для обнаружения и идентификации микроорганизма, необязательно болезнетворного.

Наличие намеченных нуклеиновых кислот может быть продемонстрировано с помощью визуализации реакций гибридизации. Реакция гибридизации подразумевает любую реакцию между зарегистрированной нуклеиновой кислотой и намеченной нуклеиновой кислотой, выделенной или созданной на стадии транскрипции, обратной транскрипции или амплификации типа NASBA (Амплификация, Основанная на Последовательности Нуклеиновых Кислот) или ПЦР (Полимеразная Цепная Реакция).

Нуклеиновая кислота подразумевает олигонуклеотиды, деоксирибонуклеиновые кислоты и рибонуклеиновые кислоты, а также их производные. Термин олигонуклеотид обозначает последовательность, по меньшей мере, двух нуклеотидов (деоксирибонуклеотидов, или рибонуклеотидов, или обоих), натуральных или модифицированных, допускающую гибридизацию, в подходящих условиях гибридизации, с олигонуклеотидом, который является, по меньшей мере, частично комплементарным. Модифицированный нуклеотид подразумевает, например, нуклеотид, имеющий модифицированное основание и/или имеющий модификацию межнуклеотидной связи и/или остова. В качестве примера модифицированного основания можно привести инозин, метил-5-деоксицитидин, диметиламино-5-деоксиуридин, диамино-2,6-пурин и бромо-5-деоксиуридин.

Для иллюстрации модифицированной межнуклеотидной связи можно привести фосфоротиоат, N-алкилфосфорамидат, алкилфосфонат и алкилфосфодиэфирные связи.

Альфа-олигонуклеотиды, такие как альфа-олигонуклеотиды, описанные в FR-A-2 607507, ЗНК, такие как фосфоротиоат-ЗНК и 2'-тио-ЗНК, описанные в Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 8, Issue 16, 18 August 1998, pages 2219-2222, и PNA (пептид-нуклеиновые кислоты), обсуждавшиеся в статье M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114, 1895-1897, являются примерами олигонуклеотидов, составляющих нуклеотиды с модифицированным остовом.

Реакции гибридизации могут быть наглядно представлены с помощью любого средства обнаружения, такого как прямое или опосредованное средство.

В случае прямого обнаружения, т.е. без применения введения меток, реакции гибридизации наблюдают посредством плазмонного резонанса или посредством циклической вольтамперометрии на электроде, несущем проводящий полимер.

В случае опосредованного обнаружения, т.е. посредством введения меток, введение метки может быть осуществлено либо непосредственно на намеченных нуклеиновых кислотах, либо через специфического связывающего партнера указанных нуклеиновых кислот, которые были заблаговременно помечены.

Специфический связывающий партнер намеченных нуклеиновых кислот подразумевает любой партнер, допускающий связывание с намеченной нуклеиновой кислотой, а в качестве примера можно привести нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды или полинуклеотиды и ферментные субстраты.

«Введение метки» подразумевает прикрепление маркера, допускающего генерирование, непосредственно или опосредованно, различимого сигнала. Неисчерпывающий список данных маркеров включает: энзимы, которые продуцируют сигнал, который может быть обнаружен, например, с помощью электрохимии, колориметрии, флуоресценции, люминесценции, энзимов, таких как пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза (ALP), α-галактозидаза, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа; ингибиторов энзимов; кофакторов энзимов; частиц, таких как частицы золота, магнитные латексы, липосомы; хромофоров, таких как люминесцентные соединения, красителей, радиоактивных молекул, таких как ³²P, ³⁵S или ¹²⁵I, флуоресцентных молекул, таких как флуоросцеин, родамин, Alexa^®, умбеллиферон, люминол или фикоцианины. В случае флуоресценции, это может быть флуоресцентный продукт реакции энзим-субстрат, комбинация флуорофор-тушитель флуоресценции, затухание флуоресценции или любая другая система, основанная на свойствах флуоресценции.

Также могут быть использованы непрямые системы, например, посредством еще одной пары лиганд/антилиганд. Пары лиганд/антилиганд хорошо известны квалифицированным специалистам в данной области, и можно привести, например, следующие пары: биотин/стрептавидин, сахар/лектин, полинуклеотид/комплементарный полинуклеотид. В данном случае, это лиганд, который несет связывающий агент. Антилиганд может быть обнаружен непосредственно с помощью маркеров, описанных в предшествующем параграфе, или может сам быть различимым посредством лиганда/антилиганда.

Данные непрямые системы обнаружения в определенных условиях могут приводить к усилению сигнала. Данная методика усиления сигнала хорошо известна квалифицированным специалистам в данной области, и можно сослаться на предыдущую патентную заявку заявителей FR-A-2 781802 или WO-A-95/08000 или на статью J. Histochem. Cytochem. 45: 481-491,1997.

Намеченные нуклеиновые кислоты могут быть заблаговременно помечены посредством прямого или опосредованного включения маркера с помощью полимеразы, киназы, случайно или определенным образом, на концах или посредством включения «внутрь» молекул.

Введение метки специфичным связывающим партнерам намеченных веществ, определяемых при анализе, широко известно квалифицированным специалистам в данной области и описано, например, Greg T. Hermanson в Bioconjugate Techniques, 1996, Academic Press Inc, 525B Street, San Diego, CA92101 USA.

В зависимости от типа введения метки используемого конъюгата, например, с использованием энзима, квалифицированный специалист в данной области добавит реагенты, предоставляющие возможность визуализации введения метки. Данная стадия соответствует обнаружению. Она предшествует использованию промывающего буфера для извлечения фракций веществ, определяемых при анализе, или элементов, не вовлеченных в реакцию или присоединенных слабо и неспецифично, для того, чтобы ограничить фоновые помехи.

Цели и преимущества устройства согласно настоящему изобретению будут лучше понятны из примера, приведенного ниже, который никоим образом не является ограничением, со ссылкой на чертежи, на которых:

Фиг.1 показывает изображение в продольном сечении картриджа, используемого для отбора и лизиса микроорганизмов;

Фиг.2 показывает изображение в продольном сечении устройства для отбора содержащихся в воздухе микроорганизмов согласно отдельному варианту осуществления;

Фиг.3 показывает увеличенное частичное изображение в продольном сечении устройства для отбора микроорганизмов, которое показано на Фиг.1;

Фиг.4 показывает перспективное изображение внутренней части верхнего элемента устройства для отбора микроорганизмов;

Фиг.5 показывает частичное перспективное изображение внутренней части верхнего элемента устройства для отбора микроорганизмов, которое показано на Фиг.3;

Фиг.6 показывает изображение в продольном сечении устройства для лизиса микроорганизмов;

Фиг.7 показывает изображение в продольном сечении узла, состоящего из устрой