Brassica juncea качества омега-9

Brassica juncea качества омега-9

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ЗАЯВКА НА ПРИОРИТЕТ

По настоящей заявке испрашивается приоритет по дате подачи предварительной патентной заявки США с серийным номером 61/198422, поданной 4 ноября 2008 года, под названием "Omega-9 Quality Brassica Juncea".

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение принадлежит области улучшенных видов Brassica, включая Brassica juncea, улучшенных масла и муки из Brassica juncea, способов получения таких улучшенных видов Brassica и способов селекции линий Brassica. Дополнительные варианты осуществления относятся к семенам Brassica juncea, содержащим эндогенное масло с увеличенным содержанием олеиновой кислоты и сниженным содержанием линоленовой кислоты относительно существующих в настоящее время коммерческих культиваров Brassica juncea, и к семенам Brassica juncea со стабильно внесенными в них характеристиками увеличенного содержания олеиновой кислоты и сниженного содержания линоленовой кислоты в масле семян.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Канола представляет собой генетическую вариацию рапса, специально разработанную канадскими растениеводами из-за характеристик ее масла и муки, в частности ее низкого уровня насыщенных жиров. Как правило, "канола" относится к растениям вида Brassica, которые содержат в масле семян менее 2% эруковой кислоты (Δ13-22:1) по массе и менее чем 30 микромоль глюкозинолатов на грамм не содержащей масла муки. Как правило, масло канолы может включать насыщенные жирные кислоты, известные как пальмитиновая кислота и стеариновая кислота, мононенасыщенную жирную кислоту, известную как олеиновая кислота, и полиненасыщенные жирные кислоты, известные как линолевая кислота и линоленовая кислота. Эти жирные кислоты иногда указывают по длине их углеродной цепи и количеству двойных связей в цепи. Например, олеиновую кислоту иногда обозначают как C18:1, так как она содержит цепь из 18 атомов углерода и одну двойную связь, линолевую кислоту иногда обозначают как C18:2, так как она содержит цепь из 18 атомов углерода и две двойных связи, а линоленовая кислота иногда обозначают как C18:3, так как она содержит цепь из 18 атомов углерода и три двойных связи. Масло канолы может содержать менее чем приблизительно 7% всех насыщенных жирных кислот (в основном пальмитиновой кислоты и стеариновой кислоты) и более 60% олеиновой кислоты (как процент от всех жирных кислот). Как правило, культуры канолы включают сорта Brassica napus и Brassica rapa. Недавно к семейству культур канолы добавлен сорт Brassica juncea качества канолы с качеством масла и муки, сходным с другими типичными представителями канолы (патент США № 6303849 Potts et al., выданный 16 октября 2001 года; патент США № 7423198 Yao et al.; Potts and Males, 1999).

Состав жирных кислот растительного масла влияет на качество масла, устойчивость и полезные для здоровья характеристики. Например, признано, что олеиновая кислота (C18:1 мононенасыщенная жирная кислота) обладает определенной пользой для здоровья, включая эффективность в снижении уровней холестерина в плазме, что делает повышенные уровни содержания олеиновой кислоты в масле семян (>70%) желательной характеристикой. Кроме того, не все жирные кислоты в растительных маслах одинаково чувствительны к высокой температуре и окислению. Скорее, чувствительность индивидуальных жирных кислот к окислению зависит от степени их ненасыщенности. Например, линоленовая кислота (C18:3), содержащая три двойных связи углерод-углерод, окисляется в 98 раз быстрее, чем олеиновая кислота, содержащая только одну двойную связь углерод-углерод, а линолевая кислота, содержащая две двойные связх углерод-углерод, окисляется в 41 раз быстрее, чем олеиновая кислота (R.T. Holman and O.C. Elmer, "The rates of oxidation of unsaturated fatty acid esters", J. Am. Oil Chem. Soc. 24, 127-129 1947). Для дополнительной информации относительно относительных скоростей окисления олеиновой, линолевой и линоленовой жирных кислот, см. Hawrysh, "Stability of Canola Oil", Chap. 7, pp. 99-122, Canola and Rapeseed: Production, Chemistry, Nutrition, and Processing Technology, Shahidi, ed., Van Nostrand Reinhold, NY, 1990.

"Устойчивость" растительного масла можно определить как устойчивость масла к окислению и обусловленной им порче вследствие образования продуктов, вызывающих прогоркание и снижающих качество продукта питания. В условиях одинаковой обработки, технологии получения, упаковки и условий хранения, основные отличия в устойчивости между различными растительными маслами происходят вследствие различия их профилей жирных кислот. Таким образом, растительное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты предпочтительно в кулинарном применении вследствие его увеличенной устойчивости к окислению при нагревании. Плохая устойчивость к окислению приводит, например, к сокращению продолжительности эксплуатации в случае, когда масло используют в качестве масла для жарки, так как окисление приводит к неприятным вкусам и запахам, которые могут значительно снизить рыночную стоимость масла. По этим причинам высокое содержание олеиновой кислоты и низкое содержание линоленовой кислоты могут являться желательными характеристиками в растительных маслах.

Растения синтезируют жирные кислоты в своих пластидах в виде пальмитоил-ACP (16:0-ACP) и стеароил-ACP. Преобразование стеароил-ACP в олеоил-ACP (18:1-ACP) катализирует растворимый фермент стеароил-ACP-Δ9-десатуразу (Shanklin and Somerville, 1991). Эти ацил-ACP используются или для синтеза гликолипидов в хлоропластах, или транспортируются из хлоропластов в цитоплазму в виде ацил-CoA. Дополнительная десатурация олеиновой кислоты происходит только после того, как она будет использована при синтезе глицеролипидов и встроится в мембраны, что приводит к синтезу полиненасыщенных жирных кислот.

Специалистам в данной области широко известно, что ненасыщенность жирных кислот в семенах масличных культур частично контролируется ферментами десатуразами жирных кислот (FAD). Ферменты FAD регулируют ненасыщенность жирных кислот, таких как стеариновая кислота (C18:0), олеиновая кислота (C18:l) и линолевая кислота (C18:2), посредством отщепления атомов водорода от определенных атомов углерода ацильной цепи жирной кислоты, образуя двойные связи углерод-углерод. Синтез полиненасыщенных жирных кислот, линолевой (Δ9, 12-18:2) и α-линолевой (Δ9, 12, 15-18:3), начинается с преобразования олеиновой кислоты (Δ9-18:1) в линолевую кислоту, ферментативный этап, катализируемый микросомальной ω-6-десатуразой олеиновой кислоты (FAD2). Затем линолевая кислота преобразуется в ω-линоленовую кислоту посредством дополнительной десатурации ω-3-десатуразой линолевой кислоты (FAD3). Существуют публикации, что манипуляции с геном FAD2 посредством генетической инженерии могут изменять профили жирных кислот. Например, гетерологическая экспрессия гена fad2 сои в мутантной линии Arabidopsis приводит к значительному увеличению накопления полиненасыщенных жирных кислот (Heppard et al., 1996). В отличие от этого, мутантная линия Arabidopsis fad2-5, где транскрипция гена fad2 значимо снижена вследствие вставки Т-ДНК, демонстрирует значительное увеличение накопления олеиновой кислоты и значимое снижение уровней линолевой кислоты и линоленовой кислоты (Okuley et al., 1994). Эти изыскания позволяют предположить, что ген FAD2 играет важную роль в контроле преобразования олеиновой кислоты в линолевую кислоту у хранящихся в семенах липидов.

Предприняты значительные усилия для манипуляции профилем жирных кислот растений, в частности сортов с маслосодержащими семенами, таких как виды Brassica, которые используют для широкомасштабного производства коммерческих жиров и масел (см., например, патенты США №№ 5625130, выданный 29 апреля 1997 года, 5668299, выданный 16 сентября 1997 года, 5767338, выданный 16 июня 1998 года, 5840946, выданный 24 ноября 1998 года, 5850026, выданный 15 декабря 1998 года, 5861187, выданный 19 января 1999 года, 6063947, выданный 16 мая 2000 года, 6084157, выданный 4 июля 2000 года, 6169190, выданный 2 января 2001 года, 6323392, выданный 27 ноября 2001 года, и международные патентные заявки WO 97/43907, опубликованную 27 ноября 1997 года, и WO 00/51415, опубликованную 8 сентября 2000 года).

Brassica juncea (геном AA BB; n=18) (также обозначаемая в настоящем документе как "B. juncea") представляет собой амфидиплоидное растение рода Brassica, которое, как в основном полагают, является результатом гибридизации Brassica rapa (геном AA; n=10) и Brassica nigra (геном BB; n=8). Brassica napus (геном AA CC; n=19) (также обозначаемая в настоящем документе как "B. napus") также представляет собой амфидиплоидное растение гена Brassica, но, как полагают, являющаяся результатом гибридизации Brassica rapa и Brassica oleracea (геном CC; n=9). В некоторых условиях роста B. juncea может обладать определенными превосходными признаками B. napus. Эти превосходные признаки могут включать повышенную урожайность, улучшенную засухо- и жароустойчивость и лучшую устойчивость к заболеваниям. Интенсивные попытки селекции позволили получить растения видов Brassica, масло семян которых содержит менее 2% эруковой кислоты, и обезжиренная мука которых содержит менее 30 микромоль глюкозинолатов на грамм. Термин "канола" используют для описания сортов видов Brassica, содержащих малые количества эруковой кислоты (Δ13-22:1) и малые количества глюкозинолатов. Как правило, масло канолы может содержать менее чем приблизительно 7% всех насыщенных жирных кислот и более 60% олеиновой кислоты (как процент от всех жирных кислот). Например, в Соединенных Штатах Америки, по 21 CFR 184.1555, рапсовое масло с низким содержанием эруковой кислоты, полученное из Brassica napus или Brassica rapa, признают маслом канолы, когда его содержание эруковой кислоты составляет не более 2% от компонента жирных кислот, содержание олеиновой кислоты (C18:1) составляет более 50,0% по массе, содержание линолевой кислоты (C18:2) составляет менее 40,0% по массе, а содержание линоленовой кислоты (C18:3) составляет менее 14,0% по массе. В Канаде добавление Brassica juncea к определению канолы Canola Council of Canada устанавливает дополнительные требования, чтобы сорта канолы Brassica juncea должны давать семена, содержание олеиновой кислоты в масле которых равно или больше 55% от всех жирных кислот в семенах, а мука, получаемая из семян канолы Brassica juncea, должна содержать менее 1 микромоль аллил-(2-пропенил)глюкозинолатов на грамм не содержащей масла муки.

Различия между составами масел Brassica juncea и Brassica napus хорошо известны в данной области. Например, известно, что у Brassica juncea существуют различия по многим составляющим, включая в качестве неограничивающих примеров фенольные составляющие (например, токоферолы), стеролы, сульфиды, составы жирных кислот, минеральные вещества и изотиоцианаты. Brassica juncea также содержит летучие вещества с сильными противомикробными (бактерии и грибы) свойствами.

Растениеводы-селекционеры уже селекционировали сорта канолы с низким содержанием глюкозинолатов, таких как 3-бутенил-, 4-пентенил-, 2-гидрокси-3-бутенил- или 2-гидрокси-4-пентенилглюкозинолат. Муку качества канолы можно определить, например, как содержащую глюкозинолатов менее чем 30 микромоль алифатических глюкозинолатов на грамм не содержащей масла муки. В настоящее время основные коммерческие культуры канолы включают сорта Brassica napus и Brassica rapa (campestris). В патенте США № 6303849, выданном Potts et al. 16 октября 2001 года, описаны линии Brassica juncea, содержащие пищевое масло со свойствами, сходными с канолой. Описанные в нем линии Brassica juncea имеют происхождение, включающее линии Brassica juncea J90-3450 и J90-4316, депонированные под инвентарными номерами ATCC 203389 и 203390, соответственно (которые обе депонированы Agriculture and Agri-Food Canada по условиям Budapest Treaty 23 октября 1998 года в American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Va. USA 20110-2209).

Указанные выше примеры из связанной области и связанные с ними ограничения предназначены для иллюстрации, а не для исключения. Другие ограничения связанной области будут очевидны специалистам в данной области при чтении описания и изучения фигур.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Приведенные ниже варианты осуществления и его аспекты описаны и проиллюстрированы в сочетании с системами, средствами и способами, которые полагают приведенными для примера и иллюстративными, не ограничивающими объема. В различных вариантах осуществления уменьшены или устранены одна или несколько из описанных выше проблем, тогда как другие варианты осуществления относятся к другим улучшениям.

Изобретение в различных аспектах относится к растениям, семенам, клеткам, аллельным вариантам последовательностей нуклеиновой кислоты и маслам Brassica juncea. Пищевое масло в семенах растений по изобретению может иметь значимо большее содержание олеиновой кислоты и меньшее содержание линоленовой кислоты, чем находится в семенах других растений Brassica juncea. Ряд линий с высоким содержанием олеиновой кислоты/низким содержанием линоленовой кислоты ("HOLL") Brassica juncea описаны в настоящем изобретении. В одном из вариантов осуществления линия Brassica juncea содержит гены FAD2 и FAD3, как описано в международной публикации № US 2006/0248611 A1 (содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки), которые проиллюстрированы на фиг. 1 и 3 и в SEQ ID NO: 1-4. Полученный мутантный аллель кодирует белки дельта-12-десатураз жирных кислот, которые проиллюстрированы на фиг. 2 и в SEQ ID NO: 5-7. В других вариантах осуществления линия Brassica juncea может содержать мутации в генных локусах fad2-a и fad3-a, и полученные мутантные аллели могут кодировать одну или несколько мутаций в последовательности прогнозируемых белков BjFAD2-A и BjFAD3-A. Характерные примеры мутантных генов fad2-a и fad3-a и белков, пригодных для использования по настоящему изобретению, также включают в качестве неограничивающих примеров белки и гены, описанные в: международной публикации № WO 2006/079567 A2 (например, фиг. 1 и 2), такие как SEQ ID NO: 8 и 9; международной публикации № WO 2007/107590 A2, такие как SEQ ID NO: 10-21; патент США № 6967243 B2 (например, фиг. 2 и 3), такие как SEQ ID NO: 22-27; и европейская публикация No. 1862551 A1 (например, фиг. 1-10), такие как SEQ ID NO: 28-39. Содержание каждой из указанных выше патентных публикаций включено в настоящий документ в качестве ссылки. В альтернативных вариантах осуществления преобразованные линии BNfad2-a и Bnfad23-a можно использовать для поиска природных вариаций в BJFAD2B и BJFAD3B в растениях Brassica, так как в растениях Brassica juncea, содержащих BnFad2A, BnFad3A, можно выявить значительные вариации профилей жирных кислот.

В одном из аспектов изобретения неожиданно обнаружили, что замена, делеция или сайленсинг ферментативной активности FAD2 и/или FAD3 в растении Brassica приводит к растениям, способным к продукции масла с содержанием олеиновой кислоты более чем приблизительно 70% по массе и с содержанием линоленовой кислоты менее чем приблизительно 5% по массе. В другом варианте осуществления неожиданно обнаружили, что удаление или перенос генов, модифицирующих ферментативную активность FAD2 и/или FAD3 в растении Brassica, приводит к растениям, способным к продукции масла с содержанием олеиновой кислоты более чем приблизительно 70% по массе и с содержанием линоленовой кислоты менее чем приблизительно 5% по массе. Такие растения, например, могут представлять собой тетраплоидные растения или амфидиплоидные растения, такие как Brassica juncea или Brassica napus. Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к делеции или сайленсингу в растении, таком как в линиях Brassica juncea, выбранных кодирующих последовательностей FAD2 и FAD3. Пищевое масло, получаемое из растений по изобретению, можно охарактеризовать одной или несколькими из следующих характеристик: содержание олеиновой кислоты по меньшей мере 70% по массе, содержание линоленовой кислоты менее чем приблизительно 5% по массе, и общее содержание насыщенных жирных кислот менее чем приблизительно 7% по массе.

Альтернативные аспекты изобретения включают растения и части растений. Как применяют в настоящем документе, "части растений" включают растительные клетки, семена, пыльцу, содержащие нуклеиновые кислоты по изобретению, или содержащие кодирующие последовательности fad2/fad3 по изобретению, или содержащие регуляторные последовательности, такие как последовательности, расположенные выше кодирующих последовательностей FAD2/FAD3, которые экспрессируют ферменты FAD2 и/или FAD3 из Brassica napus. Предоставлены способы использования растений по изобретению, включая растения-потомки, выбираемые по маркерам по изобретению, с получением растительных продуктов. Как применяют в настоящем документе, "растительные продукты" включают все, что получают из растения по изобретению, включая части растений, такие как семена, муку, жиры или масла, включая растительные продукты с измененными концентрациями олеиновой кислоты и линоленовой кислоты. Предоставлены способы модификации растений так, чтобы они содержали перенесенные кодирующие последовательности fad2/fad3 из Brassica napus, способные к экспрессии активного фермента FAD2 и/или фермента FAD3. Например, такие способы могут включать перенос одной или нескольких кодирующих последовательностей fad2-a и/или fad3-a из Brassica napus в растение посредством межвидовой гибридизации так, чтобы растение содержало замещенные кодирующие последовательности fad2 и/или fad3a. Такие способы обеспечивают идентификацию и точное введение проводимых мутаций в Brassica juncea.

Предоставлены праймеры для амплификации для идентификации частей кодирующих последовательностей fad2/fad3 по изобретению, которые можно использовать, например, для определения различных аллелей выбранных локусов FAD2 и/или FAD3. Предоставлены способы получения растений с использованием кодирующих последовательностей fad2/fad3 по изобретению или областей, расположенных выше кодирующих последовательностей fad2/fad3 по изобретению. Например, последовательности по изобретению можно использовать для проведения или направления сайт-специфических мутаций, которые могут подавлять или изменять экспрессию выбранных кодирующих последовательностей FAD2 и/или FAD3, так как посредством подавления или изменения экспрессии гена FAD2 и/или FAD3 из выбранного локуса FAD2 или FAD3 или посредством укорочения белка FAD2 и/или FAD3, кодируемого геном FAD2 и/или FAD3. Для введения кодирующих последовательностей fad2 и/или fad3a по изобретению в потомство растений по изобретению можно использовать общепринятые способы селекции растений, такие как скрещивание и обратное скрещивание, и другие способы селекции.

Альтернативный вариант осуществления включает масло в семенах сорта Brassica juncea с содержанием жирных кислот, включающим, по меньшей мере, 68,0% олеиновой кислоты по массе и менее чем 4,0% линоленовой кислоты по массе.

Кроме того, настоящее изобретение включает муку, получаемую из семян растений B. Juncea, описываемых в настоящем документе, где такая мука может находиться в форме молотых семян, жмыха, белых хлопьев или муки после применения общепринятых способов помола и экстракции растворителем.

В дополнение к иллюстративным аспектам и вариантам осуществления, описанным выше, дополнительные аспекты и варианты осуществления станут очевидны на основе рисунков и при изучении следующего описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1 проиллюстрированы частичные геномные нуклеотидные последовательности гена fad2, клонированные из DMS100 и Quantum. Вверху представлена последовательность DMS100 ( SEQ ID NO: 1), а внизу представлена последовательность Quantum ( SEQ ID NO: 2). Стрелкой указана однонуклеотидная мутация C в T, приводящая к образованию стоп-кодона (TAG) (заштриховано). Прямой и обратный праймеры для основанного на ПЦР аллелеспецифического маркера мутантного аллеля приведены полужирным шрифтом и подчеркнуты.

На фиг. 2 предоставлены аминокислотные последовательности гена fad2, вырожденные с геномной нуклеотидной последовательностью, клонированные из DMS100 ( SEQ ID NO: 5), Quantum ( SEQ ID NO: 6) и из опубликованного гена FAD2 Brassica napus (BNFAD2) ( SEQ ID NO: 7). Стрелкой указано положение стоп-кодона, являющегося результатом однонуклеотидной мутации (C в T) в DMS100.

На фиг. 3 представлены геномные нуклеотидные последовательности гена fad3c, клонированные из DMS100 и Quantum. Вверху представлена последовательность DMS100 ( SEQ ID NO: 3), а внизу представлена последовательность Quantum ( SEQ ID NO: 4). Экзоны заключены в рамки, интроны не заключены в рамки, что соответствует экзонам 4, 5, 6 и 7 и интронам 4, 5 и 6 гена fad3 в Brassica rapa и Arabidopsis. Стрелкой указана однонуклеотидная мутация G в A. Прямой и обратный праймеры для основанного на ПЦР аллелеспецифического маркера мутантного аллеля приведены полужирным шрифтом и подчеркнуты.

На фиг. 4 проиллюстрированы одно или несколько обратных скрещиваний (BC3 и BC4) между родителями вариантов отбора с высоким содержанием олеиновой кислоты - низким содержанием линоленовой кислоты и B. juncea (Zem1, Zem2 и ZE Skorospelka) в соответствии с основными положениями настоящего изобретения.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности нуклеиновых кислот, перечисленные в приложенном списке последовательностей, приведены с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеиновых оснований, как определено в 37 C.F.R. § 1.822. Приведена только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но понятно, что комплементарная цепь включена в качестве ссылки на приведенную цепь. В приложенном списке последовательностей:

SEQ ID NO: 1 демонстрирует ген FAD2, клонированный из сорта Brassica napus, DMSI00, обозначаемый в международной публикации № US 2006/0248611 A1 как SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 2 демонстрирует ген FAD2, клонированный из сорта B. napus Quantum, обозначаемый в международной публикации № US 2006/0248611 A1 как SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 3 демонстрирует ген FAD3, клонированный из сорта B. napus DMS100, обозначаемый в международной публикации № US 2006/0248611 A1 как SEQ ID NO: 12.

SEQ ID NO: 4 демонстрирует ген FAD3, клонированный из сорта B. napus Quantum, обозначаемый в международной публикации № US 2006/0248611 A1 как SEQ ID NO: 13.

SEQ ID NO: 5 демонстрирует аминокислотную последовательность белка дельта-12-десатуразы жирных кислот, кодируемую геном FAD2, клонированным из сорта B. napus DMS100, обозначаемую в международной публикации № US 2006/0248611 A1 как SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO: 6 демонстрирует аминокислотную последовательность белка дельта-12-десатуразы жирных кислот, кодируемую геном FAD2, клонированным из сорта B. napus Quantum, обозначаемую в международной публикации № US 2006/0248611 A1 как SEQ ID NO: 10.

SEQ ID NO: 7 демонстрирует аминокислотную последовательность белка дельта-12-десатуразы жирных кислот, кодируемую опубликованным геном FAD2 (Bnfad2), клонированным из B. napus, обозначаемую в международной публикации № US 2006/0248611 A1 как SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 8 демонстрирует мутантный ген fad2-a, как описано в международной публикации № WO 2006/079567 A2.

SEQ ID NO: 9 демонстрирует мутантный белок fad2-a, кодируемый SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO: 10 демонстрирует ген fad2-a B. napus, обозначаемый в международной публикации № WO 2007/107590 A2 как SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 11 демонстрирует аминокислотную последовательность белка fad2-a, кодируемую SEQ ID NO: 10.

SEQ ID NO: 12 демонстрирует ген fad2-a B. napus, обозначаемый в международной публикации № WO 2007/107590 A2 как SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 13 демонстрирует аминокислотную последовательность белка fad2-a, кодируемую SEQ ID NO: 12.

SEQ ID NO: 14 демонстрирует ген fad2-a B. napus, обозначаемый в международной публикации № WO 2007/107590 A2 как SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 15 демонстрирует аминокислотную последовательность белка fad2-a, кодируемую SEQ ID NO: 14.

SEQ ID NO: 16 демонстрирует ген fad2-a B. napus, обозначаемый в международной публикации № WO 2007/107590 A2 как SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 17 демонстрирует аминокислотную последовательность белка fad2-a, кодируемую SEQ ID NO: 16.

SEQ ID NO: 18 демонстрирует ген fad2-a B. napus, обозначаемый в международной публикации № WO 2007/107590 A2 как SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 10 демонстрирует ген fad2-a B. napus, обозначаемый в международной публикации № WO 2007/107590 A2 как SEQ ID NO: 10.

SEQ ID NO: 20 демонстрирует ген fad2-a B. napus, обозначаемый в международной публикации № WO 2007/107590 A2 как SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 21 демонстрирует ген fad2-a B. napus, обозначаемый в международной публикации № WO 2007/107590 A2 как SEQ ID NO: 12.

SEQ ID NO: 22 демонстрирует мутантный ген "Fad2-D" B. napus, обозначаемый в патенте США 6967243 как SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 23 демонстрирует аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 22, обозначаемую в патенте США 6067243 как SEQ ID NO: 12.

SEQ ID NO: 24 демонстрирует мутантный ген "Fad2-F" B. napus, обозначаемый в патенте США 6067243 как SEQ ID NO: 15.

SEQ ID NO: 25 демонстрирует аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 24, обозначаемую в патенте США 6067243 как SEQ ID NO: 16.

SEQ ID NO: 26 демонстрирует мутантный ген "Fad2-F" B. napus, обозначаемый в патенте США 6067243 как SEQ ID NO: 17.

SEQ ID NO: 27 демонстрирует аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 26, обозначаемую в патенте США 6067243 как SEQ ID NO: 18.

SEQ ID NO: 28 демонстрирует мутантный ген FAD2 B. napus, обозначаемый в публикации европейского патента № 1862551 A1 как SEQ ID NO: 22.

SEQ ID NO: 29 демонстрирует продукт мутантного гена FAD2 B. napus, обозначаемый в публикации европейского патента № 1862551 A1 как SEQ ID NO: 23.

SEQ ID NO: 30 демонстрирует мутантный ген fad2-a B. napus, обозначаемый в публикации европейского патента № 1862551 A1 как SEQ ID NO: 24.

SEQ ID NO: 31 демонстрирует аминокислотную последовательность, кодируемую мутантным геном fad2-a B. napus с SEQ ID NO: 30, которая в публикации европейского патента № 1862551 A1 обозначена как SEQ ID NO: 25.

SEQ ID NO: 32 демонстрирует мутантный ген fad2-a B. napus, обозначаемый в публикации европейского патента № 1862551 A1 как SEQ ID NO: 26.

SEQ ID NO: 33 демонстрирует аминокислотную последовательность, кодируемую мутантным геном fad2-a B. napus с SEQ ID NO: 32, которая в публикации европейского патента № 1862551 A1 обозначена как SEQ ID NO: 27.

SEQ ID NO: 34 демонстрирует мутантный ген fad2-a B. napus, обозначаемый в публикации европейского патента № 1862551 A1 как SEQ ID NO: 28.

SEQ ID NO: 35 демонстрирует аминокислотную последовательность, кодируемую мутантным геном fad2-a B. napus с SEQ ID NO: 34, которая в публикации европейского патента № 1862551 A1 обозначена как SEQ ID NO: 29.

SEQ ID NO: 36 демонстрирует мутантный ген fad2-a B. napus, обозначаемый в публикации европейского патента № 1862551 A1 как SEQ ID NO: 30.

SEQ ID NO: 37 демонстрирует аминокислотную последовательность, кодируемую мутантным геном fad2-a B. napus с SBQ ID NO: 36, которая в публикации европейского патента № 1862551 A1 обозначена как SEQ ID NO: 31.

SEQ ID NO: 38 демонстрирует мутантный ген fad2-a B. napus, обозначаемый в публикации европейского патента № 1862551 A1 как SEQ ID NO: 32.

SEQ ID NO: 39 демонстрирует аминокислотную последовательность, кодируемую мутантным геном fad2-a B. napus с SEQ ID NO: 38, которая в публикации европейского патента № 1862551 A1 обозначена как SEQ ID NO: 33.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для ясности описания ниже определены некоторые термины, еприменяемые в настоящем документе.

Термин "линия" относится к группе растений, демонстрирующий очень небольшую общую вариативность между индивидуальными растениями, к которым относится это обозначение. Как правило, "линия" относится к группе растений, демонстрирующей небольшую генетическую вариативность или ее отсутствие между индивидуальными растениями по меньшей мере для одного признака. Как применяют в настоящей заявке, "DH (двойная гаплоидная) линия" относится к группе растений, получаемой посредством культивирования гаплоидной ткани, а затем удвоения содержания хромосом без сопровождающего клеточного деления с получением растения с диплоидном количеством хромосом, где каждая пара хромосом состоит из двух дуплицированных хромосом. Таким образом, DH линия в норме демонстрирует небольшую генетическую вариативность признаков или ее отсутствие между индивидуальными растениями.

"Сорт" или "культивар" представляет собой линию растений, которые используют для коммерческого получения, которая четко отличима, устойчива и однородна по своим признакам при выращивании.

"Двойная гаплоидная" (DH) линия относится к линии, получаемой способом микроспорического эмбриогенеза, при котором растение получают из отдельной микроспоры. Этим способом получают линии, которые гомогенны, т.е. все растения в линии имеют одинаковую генетическую структуру. Исходное DH растение обозначают как DH1, тогда как последующие поколения обозначают как DH2, DH3 и т.д. Способы двойных гаплоидов хорошо известны и разработаны для нескольких культур. Способ для Brassica juncea описан Thiagrarajah and Stringham (1993) (A comparison of genetic segregation in traditional and microspore-derived populations of Brassica juncea в L. Czern and Coss. Plant Breeding 111:330-334).

Термин "высокое содержание олеиновой кислоты" относится к Brassica juncea или другим видам Brassica, как может быть продиктовано контекстом, с содержанием олеиновой кислоты большим, чем содержание олеиновой кислоты в диком типе или у других эталонных сорте или линии, более широко, это указывает на состав жирных кислот, содержащий по меньшей мере 70,0% по массе олеиновой кислоты.

"Все насыщенные углеводородные соединения" относится к объединенной доле пальмитиновой (C16:0), стеариновой (C18:0), арахидиновой (C20:0), бегеновой (C22:0) и тетракозановой (C24:0) жирных кислот. Концентрации жирных кислот, описываемые в настоящем документе, определяют стандартными способами, хорошо известными специалистам в данной области. Конкретные способы описаны в примерах. Концентрации жирных кислот выражают в виде процента по массе от содержания всех жирных кислот.

Анализ "полусемени" относится к способу, в котором анализ жирных кислот проводят на одной семядоле (полусемени), а оставшееся полусемя используют для получения растения, если результат анализа является положительным.

"Мутагенез" представляет собой способ, в котором к растительному материалу применяют средство, о котором известно, что оно вызывает мутации в генетическом материале. Используемое в экспериментальной работе мутагенное средство представляло собой этилметилсульфонат (EMS). Целью является получение новой генетической изменчивости в видах, и, как правило, ее осуществляют, имея в виду конкретный признак. Пример мутагенеза, используемого для гаплоидов с индукцией новой изменчивости, описан в Swanson et al. (Plant cell Rep. 7:83-87, 1988). Следует понимать, что для получения мутантов может подходить ряд других способов, таких как рекомбинация с фрагментами чужеродной нуклеиновой кислоты, и что, используя различные способы, получение мутантов можно проводить в направлении замены конкретных нуклеотидов или аминокислот, а не оставлять его полностью случайным. Следует понимать, что все такие способы проведения замен последовательности нуклеиновой кислоты включены в термин "мутагенез", как применяют в настоящем документе.

"Регенерация" включает отбор из селекционируемого растения или сорта клеток, способных к регенерации (например, семян, микроспор, яйцеклеток, пыльцы, вегетативных частей). Эти клетки необязательно можно подвергать мутагенезу, после чего из клеток выращивают растение с использованием регенерации, опыления и/или способов выращивания на основе видов клеток, подвергаемых мутагенезу. Применимые способы регенерации известны специалистам в данной области; см., например, Pua et al., Bio/Technology 5:815-817 (1987); Jain et al., Euphytica 40:75-81 (1989); Szarejko et al., Proceedings of an International Symposium on the Contribution of Plant Mutation Breeding to Crop Improvement, 2:355-378 (1991); Cegielska-Taras and Szala, Rosliny Oleiste - Oilseed Crops, XVIII, 21-30 (1997); Ferrie and Keller, Proc. 9th International Rapeseed Congr., Cambridge, 3:807-809 (1995); Martini et al., Vortr. Pfl anzenzüchtg. 45:133-154 (1999); Swanson et al., Theoretical and Applied Genetics. 78:525-530 (1989); и Kirti and Chopra, Plant Breeding 102:1, 73-78 (1988). В этом контексте "M0" относится к необработанным семенам; "M1" относится к семенам, подвергаемым действию мутагенов, и полученным растениям; "M2" представляет собой потомство (семена и растения) самоопыляемых растений M1; "M3" представляет собой потомство (семена и растения) самоопыляемых растений M2; "M4" представляет собой потомство (семена и растения) самоопыляемых растений M3; "M5" представляет собой потомство (семена и растения) самоопыляемых растений M4 и т.д.

Как применяют в настоящем документе, термин "устойчивость" или "устойчивый" в отношении данного генетически контролируемого компонента жирных кислот означает, что компонент жирных кислот сохраняется от поколения к поколению в течение по меньшей мере двух поколений, а предпочтительно - по меньшей мере три поколения по существу на одинаковом уровне, например, предпочтительно ±5%. Способы по изобретению могут приводить к получению линии Brassica juncea с улучшенным составом жирных кислот, устойчивым в пределах ±5% от поколения к поколению. Специалистам в данной области следует понимать, что на указанную выше устойчивость может влиять температура, местоположение, давление и время выращивания. Таким образом, сравнения профилей жирных кислот между линиями канолы следует проводить с использованием семян, полученных в сходных условиях выращивания.

Когда в контексте настоящего изобретения используют термин "растение Brassica", он также включает любые конверсии одного гена в этой группе. Как применяют в настоящем документе, термин "растение с конверсией одного гена" относится к растениям Brassica, которые получают способом селекции растений, называемым обратным скрещиванием, где в дополнение к одному гену, переносимому в сорт способом обратного скрещивания, восстанавливают по существу все из желаемых морфологических и физиологических признаков сорта. Способы обратного скрещивания можно использовать по настоящему изобретению для улучшения признака в сорте или введения признака в сорт. Как применяют в настоящем документе, термин "обратное скрещивание" относится к повторному скрещиванию гибридного потомства снова с рекуррентным родителем, т.е. к обратному скрещиванию один или несколько раз с рекуррентным родителем (определяемым как "BC1", "BC2" и т.д.). Родительское растение Brassica, которое предоставляет ген для получения желаемого признака, называют "нерекуррентным" или "донорским родителем". Эта терминология относится к тому обстоятельству, что нерекуррентного родителя используют в протоколе обратного скрещивания один раз и, таким образом, его использование не повторяется. Родительское растение Brassica, которому переносят ген или гены от нерекуррентного родителя, известно как рекуррентный родитель, так как в протоколе обратного скрещивания его используют в нескольких циклах (Poehiman & Sleper, 1994; Fehr, 1987). В типичном протоколе обратного скрещивания исходный сорт, представляющий интерес (рекуррентный родитель), скрещивают со вторым сортом (нерекуррентный родитель), который несет один представляющий интерес ген для переноса. Затем полученное потомство этого скрещивания снова скрещивают с рекуррентным родителем и процесс повторяют до получения растения Brassica, где в изменяемом растении восстановлены по существу все из желаемых морфологических и физиологических признаков рекуррентного родителя, кроме одного переносимого гена от нерекуррентного родителя, как определяют на уровне значимости 5% при выращивании в одинаковых условиях окружающей среды.

Выбор подходящего рекуррентного родителя является важным этапом для успешной процедуры обратного скрещивания. Целью протокола обратного скрещивания является изменение или замена конкретного свойства или признака в исходном сорте. Для осуществления этого один ген рекуррентного сорта модифицируют или заменяют желаемым геном от нерекуррентного родителя, оставляя по существу весь оставшийся желательный генетический материал и, таким образом, желательное физиологическое и морфологическое строение исходного сорта. Выбор конкретного нерекуррентного родителя зависит от цели обратного скрещивания. Одной из основных целей является добавление растению коммерчески желательного, агрономически важного свойства. Точный протокол обратного скрещивания зависит от изменяемого признака или свойства для определения соответствующего протокола тестирования. Хотя способы обратного скрещивания, когда признак для переноса представляет собой доминантный аллель, упрощаются, рецессивный аллель также можно переносить. В этом случае для определения того, что желаемый признак успешно перенесен, может являться необходимым применять тестирование потомства.

Определено множество контролируемых одним геном свойств, которые регулярно не отбирают при получении нового сорта, но которые можно улучшать способами обратного скрещивания. Контролируемые одним геном свойства могут являться трансгенными или нет, примеры этих свойств включают в качестве неограничивающих примеров м