Очищенный препарат уратоксидазы, очищенная рекомбинантная уратоксидаза, конъюгат (варианты) и фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, очищенные фрагменты уратоксидазы и способ очистки уратоксидазы.

Очищенный препарат уратоксидазы, очищенная рекомбинантная уратоксидаза, конъюгат (варианты) и фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, очищенные фрагменты уратоксидазы и способ очистки уратоксидазы.

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к очистке и химической модификации белков для увеличения периода их циркуляции и снижения их иммуногенности. Конкретнее, изобретение относится к удалению агрегатов крупнее октамеров из уратоксидаз (уриказ) до конъюгирования их с поли(этиленгликолями) или поли(этиленоксидами). Это практически нивелирует иммуногенность уриказы, не ухудшая ее уриколитическое действие.

Уровень техники

Утверждения, содержащиеся в разделе описания существующего уровня техники, не представляют собой обзор аналогов, но вместо этого отражают собственное субъективное мнение и интерпретации изобретателей относительно уровня техники на момент осуществления изобретения. Эти интерпретации могут включать в себя личные, до сих пор не раскрытые догадки изобретателей, которые сами по себе не являлись частью аналогов.

Уратоксидазы (уриказы; Е.С.1.7.3.3) являются ферментами, которые катализируют окисление мочевой кислоты до лучше растворимого продукта, алантоина, - пуринового метаболита, - который проще выводится. Люди не вырабатывают ферментативно-активную уриказу из-за нескольких мутаций в генеуриказы, произошедших в ходе эволюции высших приматов. Wu, X, et al., (1992) J Mol Evol 34:78-84. Вследствие этого у подверженных индивидов избыточные концентрации мочевой кислоты в крови (гиперурикемия) и в моче (гиперурикозурия) могут приводить к болезненному артриту (подагре), отложениям солей мочевой кислоты (подагрическим узлам) и почечной недостаточности. У некоторых пораженных индивидов доступные медикаменты, такие как аллопуринол (ингибитор синтеза мочевой кислоты) вызывают ограничивающие лечение побочные эффекты или не облегчают эти состояния адекватным образом. Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4:177-192. Инъекции уриказы могут ослабить гиперурикемию и гиперурикозурию, по крайней мере, временно. Однако, поскольку уриказа является чуждым для людей ферментом, даже первая инъекция интактного белка, взятого от Aspergillus flavus, вызывает анафилактические реакции у нескольких процентов подвергавшихся лечению пациентов (Pui, С-Н, et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816), а иммунореактивность ограничивает ее полезность для постоянного или прерывающегося лечения. Donadio, D, et al., (1981) Nouv Presse Med 10:711-712; Leaustic, M, et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554.

Патентная заявка США №09/370084 и международная заявка № PCT/US1999/017514 раскрывают поли(этиленгликоль)-уратоксидазу (ПЭГ-уриказу), которая сохраняет, по меньшей мере, приблизительно 75% уриколитической активности неконъюгированной уриказы и обладает значительно ослабленной иммуногенностью. В одной из таких очищенных уриказ каждая субъединица ковалентно связана со в среднем от 2 до 10 нитей ПЭГ, причем каждая молекула ПЭГ может иметь молекулярный вес приблизительно между 5 кДа и 100 кДа.

Известно, что агрегация белков увеличивает их иммуногенность. Понимание этого внесло свой вклад в разработку способов целенаправленной агрегации белков с помощью такой обработки, как термическое денатурирование и перекрестное связывание посредством выдерживания в глутаральдегиде перед приготовлением вакцин или для иммунизации животных с целью вырабатывания антисывороток.

Обнаружено также, что нежелательная агрегация белков вносит вклад в иммунизацию или сенсибилизацию при клиническом использовании терапевтических белков, например, для гамма-глобулина человека (Henney et al. (1968) N. Engl. J. Med. 278:2244-2246) и для человеческого гормона роста (Moore et al. (1980) J. Clin. Endocrinol. Metab. 51:691-697). Вклад агрегатов в иммуногенность человеческого интерферона альфа был продемонстрирован на мышах BALB/c (Braun et al. (1997) Pharm. Res. 14:1472-1478), а для его измерения был разработан твердофазный иммуно-ферментный тест (ELISA) (Braun et al. (1997) Pharm. Res. 14:1394-1400).

Несмотря на известность влияния агрегации на иммуногенность белков, данные о влиянии агрегации на иммуногенность белков, конъюгированных с поли(алкиленгликолями), такими как ПЭГ, отсутствуют. Все еще существует потребность в поли(алкиленгликоль)-уриказных конъюгатах, которые практически устраняют иммуногенность уриказы, не ухудшая ее уриколитическую активность.

Задачей, положенной в основу данного изобретения, является удовлетворение упомянутой существующей общественной потребности.

Раскрытие изобретения

Конъюгирование белков с поли(алкиленгликолями), в особенности с ПЭГ, дает конъюгаты со сниженной иммуногенностью и увеличенным периодом полураспада в кровотоке. При попытках получить практически неиммуногенные конъюгаты уриказы, сохраняющие практически всю уриколитическую активность интактного препарата уриказы, было обнаружено, что следы крупных агрегатов уриказы в исходном материале вызывали неожиданно сильное антителообразование и ускоренное элиминирование из кровотока, что в обоих случаях является ухудшающими факторами для повтора инъекций ПЭГ-конъюгатов, приготовленных из уриказы, содержащей такие агрегаты. Неожиданно изобретатели обнаружили, что присутствие хорошо определенны агрегатов субъединиц уриказы умеренного размера, крупнее оригинального тетрамера, то есть агрегатов, содержащих восемь субъединиц (октамеров), - не вызывает повышение иммуногенности и ускоренное выведение. Октамерная форма уриказы представлена в достаточно высоких концентрациях в большинстве препаратов уриказы, чтобы обнаруживаться по поглощению ею ультрафиолетового излучения, например, с длиной волны 214 нм или 276 нм, или за счет вклада в коэффициент отражения или с помощью других измерений концентрации белка. Тем не менее, было обнаружено, что вклад самих октамеров в иммуногенность и ускоренное выведение ПЭГ-уриказных конъюгатов минимален, в отличие от вклада гораздо меньшего количества еще более крупных агрегатов, которые не обнаруживаются путем ультрафиолетового поглощения в исследуемых условиях, но обнаруживаются путем статического (Рэлеевского) или динамического рассеивания света. Таким образом, было обнаружено, что удаление таких следов очень крупных агрегатов перед конъюгированием с ПЭГ неожиданно сильно снижает иммуногенность и ускоренное выведение получающихся ПЭГ-уриказных конъюгатов.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является очищенная уратоксидаза (уриказа), практически свободная от агрегатов крупнее октамеров. Предпочтительно уриказой является уриказа млекопитающего. Более предпочтительно уриказой является уриказа свиной печени, бычьей печени или овечьей печени.

В одном из аспектов данного предпочтительного варианта осуществления уриказа является рекомбинантной. В еще одном аспекте данного предпочтительного варианта осуществления уриказа в значительной степени имеет последовательность уриказы свиной, бычьей, овечьей печени. Предпочтительно уриказа является химерной. Предпочтительно уриказа является PKS-уриказой.

Предпочтительно уриказа содержит амино-конец и карбоксильный конец, и уриказа усечена на одном конце или на обоих концах. В одном из аспектов данного предпочтительного варианта осуществления описанная выше уриказа конъюгируется с поли(этиленгликолем) или поли(этиленоксидом) при таких условиях, чтобы уриказа в конъюгате была практически свободна от агрегатов крупнее октамеров. Предпочтительно уриказа конъюгируется с поли(этиленгликолем или поли(этиленоксидом) через уретановую (карбаматную), вторичную аминную или амидную связь. В одном из аспектов данного предпочтительного варианта осуществления поли(этиленгликоль) является монометокси поли(этиленгликолем). В еще одном аспекте данного предпочтительного варианта осуществления поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют молекулярный вес приблизительно между 5 кДа и 30 кДа. Предпочтительно поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют молекулярный вес приблизительно между 10 кДа и 20 кДа. Преимущественно среднее количество нитей упомянутого поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида) составляет приблизительно между 2 и 12 нитями на субъединицу уриказы. Более предпочтительно среднее количество нитей упомянутого поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида) составляет приблизительно между 6 и 10 на субъединицу уриказы. Наиболее предпочтительно среднее количество нитей упомянутого поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида) составляет приблизительно между 7 и 9 на субъединицу уриказы. Предпочтительно поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) является линейным. Альтернативно поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) является разветвленным.

Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию для снижения уровня мочевой кислоты в жидкости или ткани организма, содержащую описанный выше конъюгат уриказы и фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно композиция стабилизируется путем лиофилизации и растворяется после восстановления для обеспечения растворов, пригодных для парентерального введения.

Еще одним объектом изобретения является способ очистки уриказы, имеющей пониженную иммуногенность, включающий в себя стадию отделения агрегатов уриказы крупнее октамеров, во фракциях уриказы, и исключения таких агрегатов из очищенной уриказы. Предпочтительно, стадия отделения включает в себя операцию обнаружения агрегатов крупнее октамеров, по меньшей мере в части фракций уриказы, и исключения фракций, содержащих эти агрегаты. Преимущественно операция обнаружения содержит измерение рассеивания света.

Настоящее изобретение также обеспечивает выделенную уриказу, приготовленную в соответствии с вышеописанным способом.

Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является выделенная уратоксидаза (уриказа), в которой, по меньшей мере, 95% от общего количества ее молекул входит в состав тетрамеров и октамеров.

В частном варианте осуществления уратоксидаза выделена из организма млекопитающего.

В предпочтительном варианте осуществления уратоксидаза является выделенной из печени свиньи или печени овцы.

В еще одном частном варианте осуществления уратоксидаза является рекомбинантной.

В предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная уриказа имеет аминокислотную последовательность уриказы печени свиньи, уриказы печени быка, уриказы печени овцы или уриказы печени бабуина.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная уриказа является химерной.

В более предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная химерная уратоксидаза включает в себя часть от уриказы, выделенной из печени свиньи, и часть от уриказы, выделенной из печени бабуина.

В еще более предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная химерная уратоксидаза имеет аминокислотную последовательность свиной уратоксидазы SEQ ID NO:1 с остатком лизина вместо остатка аргинина в положении 291 (R291K) и с остатком серина вместо остатка треонина в положении 301 (T301S) (CKS-уриказа).

В другом предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная уратоксидаза имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 с остатком гистидина вместо тирозина в положении 97 (Y97H).

В другом частном варианте осуществления источник, из которого выделена уратоксидаза, представляет собой организм гриба или микроба.

В предпочтительном варианте осуществления уратоксидаза является выделенной или рекомбинантной и притом имеет аминокислотную последовательностью организма гриба или микроба, выбранного из группы, состоящей из Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis, Bacillus sp. и Candida utilis.

В частном варианте осуществления источник, из которого выделена уратоксидаза, представляет собой организм беспозвоночного животного.

В предпочтительном варианте осуществления уратоксидаза является выделенной или рекомбинантной и притом имеет аминокислотную последовательность организма беспозвоночного животного, выбранного из группы, состоящей из Drosophila melanogaster и Drosophila pseudoobscura.

В еще одном частном варианте осуществления источник, из которого выделена уратоксидаза, представляет собой растительный организм.

В предпочтительном варианте осуществления уратоксидаза является выделенной или рекомбинантной и притом имеет аминокислотную последовательность растительного организма Glycine max.

В другом частном варианте осуществления, по меньшей мере, 97% от общего количества молекул уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.

Вторым объектом настоящего изобретения является очищенная химерная уратоксидаза (уриказа), по меньшей мере, 95% от общего количества молекул которой входит в состав тетрамеров и октамеров, при этом она имеет аминокислотную последовательность свиной уратоксидазы SEQ ID NO:1 с остатком лизина вместо остатка аргинина в положении 291 (R291K) и с остатком серина вместо остатка треонина в положении 301 (T301S) (CKS-уриказа).

Третьим объектом настоящего изобретения являются конъюгаты, включающие очищенную уратоксидазу (уриказу) и поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид), в которых, по меньшей мере, 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.

В частном варианте осуществления, по меньшей мере, 97% от общего количества молекул уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.

В еще одном частном варианте осуществления, в качестве указанного поли(этиленгликоля) конъюгаты включают в себя монометокси поли(этиленгликоль).

В другом частном варианте осуществления конъюгаты имеют ковалентный линкер между указанными поли(этиленгликолем) или поли(этиленоксидом) и уратоксидазой, выбранный из группы, состоящей из уретанового (карбаматного) линкера, вторичного аминового линкера и амидного линкера.

В частном варианте осуществления конъюгатов, указанные поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют средний молекулярный вес примерно от десяти до шестидесяти тысяч дальтон.

В предпочтительном варианте осуществления конъюгатов, указанные поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют средний молекулярный вес примерно от десяти до тридцати тысяч дальтон.

В еще одном частном варианте осуществления конъюгатов, среднее количество нитей указанных поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида), ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от двух до двенадцати.

В предпочтительном варианте осуществления конъюгатов, среднее количество нитей указанных поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида), ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от шести до десяти.

В более предпочтительном варианте осуществления конъюгатов, среднее количество нитей указанных поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида), ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от семи до девяти.

В другом частном варианте осуществления конъюгатов, в качестве указанного поли(этиленгликоля) они включают в себя линейный поли(этиленгликоль), а в качестве поли(этиленоксида) они включают в себя линейный поли(этиленоксид).

В частном варианте осуществления конъюгатов, в качестве указанного поли(этиленгликоля) они включают в себя разветвленный поли(этиленгликоль), а в качестве указанного поли(этиленоксида) они включают в себя разветвленный поли(этиленоксид).

Четвертым объектом настоящего изобретения являются очищенные фрагменты уратоксидазы (уриказы), представляющие собой укороченную с амино-конца и/или с карбоксильного конца рекомбинантную уриказу.

В частном варианте осуществления, по меньшей мере, 97% от общего количества фрагментов входит в состав тетрамеров и октамеров.

Пятым объектом настоящего изобретения являются конъюгаты, включающие в себя очищенную уратоксидазу (уриказу) и поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид), в которых, по меньшей мере, 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров, притом что среднее количество нитей указанных поли(этиленгликоля) илиполи(этиленоксида), ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от двух до десяти.

В частном варианте осуществления, по меньшей мере, 97% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.

В предпочтительном варианте осуществления конъюгатов, указанные поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют средний молекулярный вес примерно от десяти до шестидесяти тысяч дальтон.

В более предпочтительном варианте осуществления конъюгатов, указанные поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют средний молекулярный вес примерно от десяти до тридцати тысяч дальтон.

Шестым объектом настоящего изобретения является конъюгаты, включающие в себя очищенную уратоксидазу (уриказу) и поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид), в которых, по меньшей мере, 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров, притом что среднее количество нитей указанного поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида), ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от двух до десяти, а средний молекулярный вес названных поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида) составляет примерно от десяти до шестидесяти тысяч дальтон.

В частном варианте осуществления, по меньшей мере, 97% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.

Седьмым объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, включающая в себя конъюгат очищенной уриказы с поли(этиленгликолем) или поли(этиленоксидом) и фармацевтически приемлемый носитель, в которой, по меньшей мере, 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.

В частном варианте осуществления, композиция имеет стабилизированную лиофилизированную форму, быстро восстанавливаемую растворением с получением раствора, пригодного для парентерального введения.

Восьмым объектом настоящего изобретения является способ очистки уратоксидазы (уриказы) с сохранением ее уриколитической активности, в котором из фракций уратоксидазы выделяют агрегаты уриказы крупнее октамеров и отбрасывают их с получением очищенной уриказы, по меньшей мере, 95% от общего количества молекул которой входит в состав тетрамеров и октамеров.

В частном варианте осуществления способа, выделение осуществляют посредством ионнообменной хроматографии, размерно-эксклюзионной хроматографии или ультрафильтрации.

В еще одном частном варианте осуществления способа при выделении детектируют и отбрасывают фракции уриказы, содержащие агрегаты крупнее октамеров.

В другом частном варианте осуществления способа детекцию осуществляют посредством измерения светорассеяния.

Девятым объектом настоящего изобретения является выделенная уратоксидаза (уриказа), полученная способом, в котором от тетрамеров уриказы отделяют агрегаты уриказы крупнее октамеров и отбрасывают их с получением очищенной уриказы, по меньшей мере, 95% от общего количества молекул которой входит в состав тетрамеров и октамеров.

В частном варианте осуществления, по меньшей мере, 97% от общего количества молекул уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 иллюстрирует активность уриказы, общие концентрации белков и солей во фракциях, полученных из анионообменной колонки от Pharmacia Biotech Mono Q (1×10 см). Активность уриказы измерялась при комнатной температуре путем отслеживания уменьшения поглощения длины волны 292 нм 100 мкмоль мочевой кислоты в 200 ммоль бората натрия, рН 9,2. Общее количество белка определяют по площади под кривой пика поглощения уриказы при анализах ВЭЖХ с исключением по размеру.

Фиг.2 иллюстрирует анализ с помощью ВЭЖХ с исключением по размеру в колонке Pharmacia Superdex 200 (1×30 см) загрузки и избранных фракций, полученных при Mono Q хроматографии свиной уриказы, содержащей мутации R291K и T301S (PKS уриказа), показывающий данные, полученные детектором светорассеивания при 90°C (верхние кривые) и по поглощению при 276 нм (нижние кривые). Очевидны различные силы сигнала тетрамерных, октамерных и более высокоагрегированных форм уриказы в не разделенном на фракции образце (загрузке) и в различных фракциях. Загрузка была разбавлена в соотношении 1/5 с помощью буфера колонки Mono Q, фракция 5 была разбавлена в соотношении 1/3, а фракция 6 была разбавлена в соотношении 1/9. Фракции 5 и 6 комбинировались, формируя "слабосолевой пул".

Фиг.3 иллюстрирует анализы с исключением по размеру фракций, полученных из колонки Mono Q по фиг.1, показывающие данные, полученные детектором светорассеивания при 90°C и по поглощению при 276 нм, как на фиг.2. Фракции, показанные на данном чертеже, использовались для формирования "сильносолевого пула", из которого ПЭГ-конъюгаты были приготовлены и инъецированы мышам BALB/c. Результирующие активности сыворотки и иммунологические реакции мышей BALB/c показаны на фиг.5 и 6.

Фиг.4 иллюстрирует содержание октамеров, определенное путем поглощения длины волны 276 нм и с помощью рассеивания света при 90 градусах, рассчитанное по данным фиг.2 и 3, в не разделенной на фракции PKS уриказе и в избранных фракциях, полученных с помощью хроматографии PKS уриказы в колонне Mono Q (фиг.1).

Фиг.5 иллюстрирует УФ-исследования, как и на фиг.1, активности уриказы после 4 часов инкубирования при 37°C, в сыворотках, изъятых спустя 24 часа после каждой из шести еженедельных инъекций 6×10 кДа ПЭГ-конъюгатов PKS уриказы или пулов фракций из колонны Mono Q.

Фиг.6 иллюстрирует твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) формирования антитела IgG к ПЭГ-конъюгатам PKS уриказы и к ПЭГ-конъюгатам пулов фракций из колонки Mono Q, показанной на фиг.1, в сыворотках, изъятых спустя 24 часа после каждой из шести еженедельных инъекций 0,2 мг уриказного белка на каждые 20 граммов веса тела самок мышей BALB/c. Для каждой мыши данные по крови через 24 часа после первой-шестой инъекции показаны слева направо. Условия исследования описаны в примере 6. Данные для восьми мышей в каждой группе организованы в порядке возрастания иммунной реакции, слева направо.

Осуществление изобретения

Предыдущие исследования показали, что когда значительное снижение иммуногенности и/или антигенности уриказы достигается посредством ее конъюгирования с ПЭГ (ПЭГ-илирования), оно неизменно связано со значительной потерей уриколитической активности. Настоящее изобретение в частности эксплуатирует тот факт, что следы агрегатов уратоксидаз крупнее октамеров, вносят значительный вклад в иммуногенность и ускоренное выведение ПЭГ-уриказных конъюгатов. Это открытие с наибольшей вероятностью применимо к отличным от уриказ белкам, в том числе к интерферонам и факторам роста.

На безопасность, удобство и финансовую выгоду биомедикаментов отрицательно влияет снижение их силы и вытекающая из этого необходимость увеличения дозы введения. Таким образом, существует необходимость в безопасном и эффективном альтернативном средстве для снижения повышенных уровней мочевой кислоты в жидкостях организма, в том числе в крови и в моче. Настоящее изобретение обеспечивает способ для производства уриказы, свободной отуриказных агрегатов крупнее октамеров, для использования при синтезе ПЭГ-уриказы. Данная ПЭГ-уриказа сохраняет всю или почти всю уриколитическую активность интактного фермента. Также настоящее изобретение обеспечивает очищенную уриказу, практически свободную от агрегатов крупнее октамеров. Термин "практически свободная" указывает на то, что очищенная уриказа содержит не более приблизительно 2%, а предпочтительно не более приблизительно 1% агрегатов крупнее октамеров.

Настоящее изобретение обеспечивает такой способ очистки уриказы, что агрегаты крупнее октамеров, исключаются из очищенного препарата. Поскольку эти крупные агрегаты являются сильно иммуногенными, их наличие в очищенном уриказном препарате нежелательно. Способ включает в себя отслеживание колоночных фракций с помощью светорассеивания вместо или в дополнение к поглощению ультрафиолетового излучения с длиной волны 280 нм, поскольку эти агрегаты могут быть слишком разбавлены, чтобы обнаруживаться с помощью поглощения ультрафиолетового излучения. Очищенная уриказа затем конъюгируется с водорастворимыми полимерами, предпочтительно с поли(этиленгликолями) или поли(этиленоксидами), как описано в параллельно рассматриваемой патентной заявке США №09/370084.

Устранение агрегированной уриказы из препарата, состоящего преимущественно из тетрамерной уриказы, может выполняться любым из способов, известных специалистам, в том числе хроматографией с исключением по размеру, ионообменной хроматографией, ультрафильтрацией сквозь микропористую мембрану и центрифугированием, в том числе ультрацентрифугированием. Способ отделения может содержать разделение и анализ фракций и устранение или исключение тех фракций, которые содержат избыточные количества крупных агрегатов. Получаемый уриказный препарат в большей степени пригоден для синтеза практически неиммуногенных конъюгатов уриказы, чем неразделенная на фракции уриказа. Для постоянного введения важно, чтобы ПЭГ-конъюгаты белков, например ПЭГ-уриказа, имели низкую иммуногенность и не вызывали прогрессирующе быстрое выведение из потока крови после повторяющихся дозировок.

Изобретение также обеспечивает фармацевтические составы полимер-уриказных конъюгатов. Эти конъюгаты являются практически неиммуногенными и сохраняют по меньшей мере 75%, предпочтительно 85%, а более предпочтительно 95% или более уриколитической активности интактного фермента. Уриказы, пригодные для конъюгирования с водорастворимыми полимерами, включают в себя уратоксидазы естественного происхождения, выделенные из животных, как позвоночных, так и беспозвоночных, а также рекомбинантные формы уриказы, в том числе мутантные, гибридные и/или усеченные ферментативно-активные варианты уриказы. Водорастворимые полимеры, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают в себя линейные и разветвленные поли(этиленгликоли) или поли(этиленоксиды), совместно известные как ПЭГ. Примеры разветвленных ПЭГ являются предметом патента США №5643575. Одним из предпочтительных примеров ПЭГ является монометоксиПЭГ с общей структурой CH₃O-(CH₂CH₂O)_nH, где n варьирует от приблизительно 100 до приблизительно 2300.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является конъюгат уратоксидазы (уриказы), который сохраняет по меньшей мере приблизительно 75% уриколитической активности неконъюгированной уриказы и обладает значительно сниженной иммуногенностью. Уриказа по данному аспекту изобретения может быть рекомбинантной. Является она рекомбинантной или нет, это может быть уриказа, происходящая от млекопитающего. В одном из аспектов данного варианта осуществления уриказа может быть уриказой свиной, бычьей или овечьей печени. В еще одном аспекте данного варианта осуществления уриказа может быть химерной. Химерная уриказа может содержать части уриказы свиной печени и/или уриказы печени бабуина. Например, химерная уриказа может быть свиной уриказой, содержащей мутации R291K и T301S (PKS уриказа). Альтернативно, уриказа может быть уриказой печени бабуина, в которой тирозин 97 заменен на гистидин, причем специфическая активность уриказы может быть увеличена по меньшей мере, на 60%. Уриказа по изобретению, какого бы происхождения она ни была, может также быть в укороченной форме, либо со стороны амино-конца, либо со стороны карбоксильного конца, либо с обоих концов. Подобным же образом уриказа может быть грибной или микробной уриказой. В одном из аспектов данного варианта осуществления грибная или микробная уриказа может являться естественной или рекомбинантной формой уриказы из Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis. Bacillus sp. или Candida utilis. Альтернативно уриказа может быть уриказой беспозвоночного, такой как, к примеру, естественная или рекомбинантная форма уриказы из Drosophila melanogaster или Drosophila pseudoobscura. Уриказа по изобретению может быть также растительной уриказой, например естественной или рекомбинантной формой уриказы из клубеньков соевого корня (Glycine max). ПЭГ может иметь средний молекулярный вес приблизительно между 5 кДа и 100 кДа; предпочтительно ПЭГ может иметь средний молекулярный вес приблизительно между 8 кДа и 60 кДа; более предпочтительно ПЭГ может иметь средний молекулярный вес между приблизительно 10 кДа и приблизительно 40 кДа, например от 10 до 20 кДа. Среднее количество ковалентно связанных нитей ПЭГ может составлять от 2 до 12 нитей на субъединицу уриказы; предпочтительно, среднее количество ковалентно связанных нитей составляет от 6 до 10 на субъединицу; более предпочтительно, среднее количество нитей ПЭГ составляет от 7 до 9 на субъединицу. В одном из аспектов данного варианта осуществления уриказа может быть тетрамерной. Нити ПЭГ могут быть ковалентно связаны с уриказой через уретановые (карбаматные) связи, вторичные аминные связи и/или амидные связи. Если уриказа является рекомбинантной формой любой подразумеваемой здесь уриказы, то эта рекомбинантная форма может в значительной степени иметь последовательность естественной формы.

Одной из предпочтительных уриказ млекопитающего является рекомбинантная химерная уриказа свиньи-бабуина, составленная из частей последовательностей уриказы свиной печени и печени бабуина, обе из которых были впервые определены Wu, et al., (1989). Один из примеров такой химерной уриказы содержит первые 288 аминокислот свиной последовательности (SEQ ID NO:1), а последние 16 аминокислот бабуиновой последовательности (SEQ ID NO:2). Hershfield, et al. International Publication WO 00/08196, Urate Oxidase, опубликовано 17 февраля 2000. Поскольку последняя последовательность отличается от свиной последовательности только в двух позициях, содержа лизин (K) вместо аргинина в остатке 291 и серии (S) вместо треонина в остатке 301, этот мутант обозначается как свиная-K-S, или PKS уриказа (SEQ ID NO:3). PKS уриказа имеет на один лизиновый остаток больше и, следовательно, на один потенциальный сайт ПЭГилирования больше, чем свиная или бабуиновая последовательности.

кДНК для различных уриказ млекопитающих, в том числе PKS уриказы, были субклонированы, и были определены оптимальные условия для экспрессии в E.coli с помощью стандартных способов. См. Erlich, НА, (Ed.) (1989) PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification. New York: Stockton Press; Sambrook, J, et al., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Рекомбинантные уриказы экстрагировали, очищали, а их стабильность и активность исследовали с помощью модификаций стандартных тестов. См. Fridovich, I, (1965) J Biol Chem 240:2491-2494; Nishimura, et al., (1979), и примеры 1 и 5.

В одном из вариантов осуществления изобретения уриказа может конъюгироваться с помощью биологически стабильной, нетоксичной, ковалентной связи с относительно небольшим количеством нитей ПЭГ. Такие связи могут быть уретановыми (карбаматными) связями, вторичными аминными связями и амидными связями. Различные активированные ПЭГ, пригодные для такого конъюгирования, доступны коммерчески у фирмы Shearwater Polymers, Huntsville, AL.

Например, уретановые связи с уриказой могут формироваться путем инкубирования уриказы в присутствии сукцинимидилкарбонатного (СК) или р-нитрофенилкарбонатного (НФК) производного ПЭГ. СК-ПЭГ может быть синтезирован с помощью процедуры, описанной в патенте США №5612460. НФК-ПЭГ может быть синтезирован путем реагирования ПЭГ с п-нитрофенилхлорформатом в соответствии со способами, описанными в Veronese, FM, et al., (1985) Appi Biochen Biotechnol 11:141-152, и в патенте США №5286637. Способы, описанные в патенте '637, адаптированы для ПЭГ с большим молекулярным весом путем регулирования концентраций реагентов для поддержания подобной стехиометрии. Альтернативный способ синтеза НФК-ПЭГ описан в Buttner, W, et al., описание патента ГДР №279486 А1.

Амидные связи с уриказой могут быть получены с помощью N-гидроксисукцинимидного сложноэфирного карбоксилово-кислотного производного ПЭГ (Shearwater Polymers). Вторичные аминные связи могут быть сформированы с помощью 2,2,2-трифторэтансульфонилового ПЭГ (тресил ПЭГ; Shearwater Polymers) или путем восстанавливающего алкилирования с помощью ПЭГ-альдегида (Shearwater Polymers) и цианборгидрата натрия.

В конъюгатах, содержащих ПЭГ с молекулярным весом 10 кДа, максимальное количество нитей ПЭГ, которые связывались с одной субъединицей при сохранении по меньшей мере 75% уриколитической активности интактного фермента, составляло приблизительно 12 нитей для уриказ млекопитающих (например, PKS уриказы, мутеина свиной уриказы; см. условия теста в Примере 5). Последний объем ПЭГ-илирования соответствовал приблизительно 40% всех аминогрупп. В одном из вариантов выполнения изобретения среднее количество нитей ПЭГ, связанных с субъединицей уриказы, составляло приблизительно между 2 и 12. В предпочтительном варианте осуществления среднее количество нитей ПЭГ, связанных с субъединицей уриказы, составляло приблизительно между 6 и 10. В более предпочтительном варианте существления среднее количество ковалентно связанных с субъединицей уриказы нитей ПЭГ составляло приблизительно между 7 и 9. В еще одном варианте осуществления молекулярный вес ПЭГ, использованных в реакции связывания, составлял приблизительно между 5 кДа и 30 кДа, предпочтительно приблизительно между 10 кДа и 20 кДа.

Существует несколько факторов, которые могут влиять на выбор оптимального молекулярного веса и количества нитей ПЭГ для связывания с определенной формой уриказы. В целом уменьшение или устранение иммуногенности без значительной потери уриколитической активности может потребовать связывания сравнительно большего количества нитей ПЭГ более низкого молекулярного веса по сравнению с относительно меньшим количеством нитей ПЭГ более высокого молекулярного веса. Подобным же образом, каждая отличная форма уриказы может иметь различный оптимум по отношению и к размеру, и к количеству нитей. Оптимальное количество нитей ПЭГ и молекулярный вес ПЭГ могут быть определены с помощью описываемых здесь способов.

Если ПЭГ-конъюгаты уриказы млекопитающего были приготовлены из очищенных тетрамерных и октамерных форм фермента (содержащих четыре или восемь субъединиц весом приблизительно 35 кДа), они проявляли коренным образом ослабленную иммуногенность у мышей, в противоположность умеренной иммуногенности ПЭГ-конъюгатов препаратов уриказы, содержавших крупные агрегаты (см. фиг.6), и очень высокой иммуногенности интактного фермента.

Очищенные препараты естественных и рекомбинантныхуриказ обычно содержат смесь очень крупных агрегатов фермента вдобавок к тетрамерной (140 кДа) и октамерной (280 кДа) формам. Процент уриказы, находящейся либо в тетрамерной, либо в октамерной форме в каждом уриказном препарате, обычно варьируется приблизительно от 20% до 95% (см. фиг.2-4). Несмотря на очевидность того, что не-ПЭГ-илированные агрегаты нескольких других белков являются высокоиммуногенными (например, см. Moore, WV, et al., (1980)JCIin Endocrinol Metab 51:691-697), предшествующие исследования ПЭГ-уриказы не описывали никаких попыток ограничить содержание агрегатов, что говорит о том, что потенциальная иммуногенность ПЭГ-модифицированных агрегатов не рассматривалась. На основе наблюдений изобретателей представляется вероятным, что такие агрегаты присутствовали в ферментных препаратах, использовавшихся ранее для синтеза ПЭГ-уриказы. Их присутствие могло усложнять задачу приготовления неиммуногенных конъюгатов. Представляется также, что большие потери уриколитической активности, наблюдавшиеся при предыдущих попытках ПЭГ-илирования уриказы, были связаны с большим количеством нитей ПЭГ низкого молекулярного веса, которые связывались. С другой стороны, способы очистки и ПЭГ-илирования уриказы, описанные здесь, обеспечивают ковалентное присоединение 12 нитей ПЭГ на субъединицу, сохраняя при этом более 75% уриколитической активности, по меньшей мере для некоторых уриказ, например, PKS уриказы (мутеина свиных уриказ) и фермента из термофильной Bacillus sp.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления практически все крупные агрегаты фермента могут быть удалены ионообменной хро