Антиоксидантное средство с гепатопротекторным эффектом на основе наноструктурированного селена и способы его получения и применения

Антиоксидантное средство с гепатопротекторным эффектом на основе наноструктурированного селена и способы его получения и применения

Реферат

Изобретение относится к фармации, в частности, может применяться для профилактики и лечения редокс-зависимых заболеваний, а также для восполнения селена в организме животных и человека, что обеспечивает целевую гепатотропную антиоксидантную защиту и восполнение в организме эссенциального микроэлемента селена, а также снижение его токсичности при терапевтическом применении.

Известен комплексный поливитаминный препарат, регулирующий метаболические процессы и снижающий частоту проявления селенового дефицита в организме животных, в том числе птиц, содержащий селен и масляный растворитель, при этом он содержит в своем составе селен в виде натрия селенита, ретинола ацетат в качестве витамина A, а масляным растворителем является масло кукурузных зародышей.

[Патент. RU №2250099, кл. A61K 9/08, A61K 33/04, A61K 31/07, A61K 35/78, опубл. 20.04.2005 г.].

Известен препарат, содержащий селенит натрия и витамин E, который с успехом используется для профилактики послеродовых заболеваний у крупного рогатого скота. Так, комплексное применение селенита натрия и витамина E способствовало снижению мастита в стадах на 30% и более [Smith A.M. and Picciano М.Ф. Evidence for increased selenium requirement for the rat during pregnancy and lactation. - J. of Nutrition, 1986, v.H6, N6, p.1068-1079.; Smith I., Hogan J. Vitamin E and selenium can help lover incident of mastitis. - Zarge anim. Veter., 1988, 43, 6, 20-24].

Недостатками данных препаратов являются их неудовлетворительная усвояемость и достаточно высокая токсичность.

Известно средство на основе наномолекулярного селенопротеина, обладающее выраженным иммунотропным и метаболическим действием. Способ его получения включает экстракцию протеина из белок-содержащего растительного сырья органическими растворителями с последующим добавлением селена, обработкой смеси в электромагнитном синусоидальном высокочастотном поле, затем трипсином, добавлением к образовавшимся наночастицам молекулы селенопротеина ионов селена и повторного выдерживания в высокочастотном электромагнитном поле 20-30 ГГц. Полученное средство представляет собой наномолекулярную селенопротеиновую матрицу, содержащую селен, полученный путем термолиза селеномочевины, при этом молярное соотношение протеина и селена составляет 1:8.

[Патент. RU №2242234, кл. A61K 33/04, A61K 35/78, A61P 37/02, опубл. 20.12.2004 г.].

Данное средство обладает только иммунотропным и метаболическим действием, причем наноразмерной является макромолекула селенопротеина, а размерность частиц селена не определена.

Известна также иммуномодулирующая композиция для животных, которая содержит в качестве активно действующего вещества белок сыворотки молока - лактоферрин, в качестве растворителя - дистиллированную воду. Активно действующее вещество включает в дополнение к лактоферрину белки сыворотки молока лактоальбумин и лактоглобуллин, при этом активно действующее вещество представляет собой водный раствор смеси белков сыворотки молока с концентрацией общего белка 10 г/л, содержащий 10-20% лактоферрина, 20-30% лактоальбумина, 60-70% лактоглобуллина, кроме того, указанное активно действующее вещество дополнительно содержит наночастицы селена, которые непосредственно образуются в процессе формирования композиции при добавлении в водный раствор смеси трех белков 1 М раствора солянокислого гидразина и 1 М раствора селенита натрия Na₂SeO₃. Затем объем полученной смеси доводят дистиллированной водой до 100 мас.%. Останавливают реакцию доведением pH раствора до 7,2 1 М раствором гидроксида натрия и освобождают от низкомолекулярных соединений диализом против дистиллированной воды. Наночастицы селена, включенные в состав активно действующего вещества, придают композиции дополнительный антиоксидантный эффект.

[Патент RU №2485964, кл. A61K 35/20; A61K 33/04; A61P 37/02; B82B 1/00;, опубл. 27.06.2013 г.].

Недостатком данной композиции является то, что в качестве активного действующего вещества используют белки животного происхождения (из цельного коровьего молока), что обуславливает их потенциальную аллергогенность, а также в значительной мере сказывается на увеличении стоимости препарата. Кроме того, для остановки реакции образования наночастиц селена необходим контроль pH среды, а также дополнительная стадия диализа для освобождения от низкомолекулярных соединений.

Запатентован также препарат для инъекций, повышающий иммунную резистентность организма животных, который может быть использован для регулирования метаболических процессов и снижения частоты селенового дефицита в организме животных, в котором селен содержится в наноразмерном состоянии. Препарат получают восстановлением неорганического производного селена в высокой степени окисления (H₂SeO₃) с образованием атомов селена в нулевой степени окисления или нульвалентных, которые затем конденсируют с образованием наночастиц селена размером до 100 нм и стабилизируют полиэлектролитом (высокомолекулярным природным или синтетическим азотсодержащим полимером, способным стабилизировать наночастицы селена). Препарат включает в себя воду для инъекций, высокомолекулярный азотсодержащий полимер в качестве стабилизатора, селен в наноразмерном состоянии и нулевой валентности (Se⁰).

[Патент. RU №2392944, кл. A61K 31/758, А61Л 33/04, A61P 3/02 опубликовано 27.06.2010 г.].

Недостатками данного препарата являются использование в качестве стабилизатора синтетических или природных азотсодержащих полимеров белковой природы, что предопределяет их потенциальную аллергогенность, кроме того, эти полимеры не обладают направленным гепатотропным действием.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту по отношению к предлагаемому изобретению является селеносодержащий нанопрепарат на основе полисахаридов гриба Pleurotus tuber-regium с противоопухолевой активностью. Синтез нанокомпозита предполагает две стадии: сначала к полисахариду добавляют аскорбиновую кислоту (восстановитель прекурсора селена), а затем по каплям водный раствор диоксида селена или селенита металла. Появление красного цвета реакционной смеси свидетельствует об образовании наночастиц элементного селена. Прикапывание заканчивают в тот момент, когда окраска раствора уже перестает углубляться. Использование конкретных полисахаридов гриба Pleurotus tuber-regium необходимо как для контроля размеров образующихся частиц селена в целевом нанокомпозите, так и для проявления совместного противоопухолевого действия этих полисахаридов и наночастиц селена.

[Patent US 2013029931 "Pleurotus tuber-regium polysaccharide functionalized nano-selenium hydrosol with anti-tumor activity and preparation method thereof.", кл. A61K 31/715; A61P 35/00, опубликовано 31.01.2013 г.].

Недостатками данного препарата являются узкий спектр тестированного биологического действия (только противоопухолевая активность), а также отсутствие сведений о целевом гепатотропном действии получаемого нанокомпозита (и полисахаридов, входящих в состав этого нанокомпозита).

Задачей предлагаемого изобретения является разработка нового высокоэффективного антиоксидантного препарата селена на основе гепатотропных галактозосодержащих полисахаридных матриц, в которых селен содержится в наноразмерном состоянии.

Технический результат, который достигается с помощью предлагаемого изобретения, сводится к направленной доставке препарата к клеткам печени за счет реализации специфического рецепторного связывания гепатоцитов с галактозными фрагментами полисахаридов, а также к повышению усвояемости препарата и снижению токсического действия селена за счет того, что этот элемент используется в наноразмерном состоянии.

Средство на основе данного препарата предлагается для лечения и профилактики редокс-зависимых патологий (в частности, токсического поражения печени), и представляет собой водорастворимые порошки красно-оранжевого цвета, содержащие селен нулевой валентности (Se⁰) в количестве от 0.5 до 60% в виде нанокомпозита с размерами частиц селена в диапазоне 1-100 нм. Нанокомпозит получают из различного селенсодержащего сырья непосредственно в водном растворе природного галактозосодержащего гепатотропного полисахарида (арабиногалактана, галактоманнана, каррагинана и др.), который, к тому же, является стабилизатором наночастиц, затем очищают его высаживанием в 96%-ный этиловый спирт или другой спирт, или ацетон и сушат. Для получения готового антиоксидантного средства сухой полисахаридный нанокомпозит селена растворяют в дистиллированной воде, при следующем соотношении компонентов в масс.%:

селенсодержащий нанокомпозит	0,0001-1,0
вода дистиллированная	остальное

Соотношение нанокомпозита и воды задают таким образом, чтобы в приготовленном антиоксидантном средстве концентрация селена была близка к эффективной дозе селена в селените натрия, используемого для профилактики и лечения вызываемой дефицитом селена в организме беломышечной болезни (0.1-0.2 мг Na₂SeO₃ на 1 кг массы животного, или 0.0457-0.0913 мг чистого селена на 1 кг массы животного, или 3.0 мг для однократной суточной дозы человека).

Сродство галактозосодержащей полисахаридной матрицы к асиалогликопротеиновым рецепторам мембраны гепатоцитов позволяет данному терапевтическому средству направленно связывать селен с мембранами гепатоцитов, а также потенциально внедрять его в эти клетки путем рецептор-обусловленного эндоцитоза. Важно подчеркнуть, что при использовании галактозосодержащих полисахаридов в качестве матрицы-носителя происходит более рациональная доставка веществ в органы (депо) и не наблюдается его перераспределения в пользу РЭС [Медведева С.А. Арабиногалактан лиственницы - перспективная биогенная матрица для биогенных металлов / С.А. Медведева и др. // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. - 2002. - №7. - С.45-50., Кривцов Г.Г., Жданов Р.И. // Вопросы медицинской химии. - 2000. - №3. С. - 25-30]. То есть, комбинирование наноселена с полисахаридами, которые обладают сродством к асиалогликопротеиновым рецепторам печени и селезенки, позволяет обеспечить направленную рецепторно-опосредованную доставку селена к клеткам органов депо и конкретно печени (а также возможный последующий эндоцитоз - внутриклеточную доставку Se) в зависимости от потребности в этом элементе, что можно условно обозначить как «интеллектуальный» механизм.

Нанокомпозит селена с галактозосодержащей полисахаридной матрицей предлагается получать тремя способами из различных селеносодержащих исходных веществ в присутствии различных галактозосодержащих полисахаридов, например, арабиногалактан или галактоманнан, или каррагинан и др.:

1. Восстановлением диоксида селена в воде - селенистой кислоты H₂SeO₃ или ее солей при помощи боргидрида натрия в водном растворе галактозосодержащего полисахарида при комнатной температуре с образованием атомов селена в нулевой степени окисления согласно схеме:

8H₂SeO₃+4NaBH₄=8Se⁰+Na₂B₄O₇+2NaOH+15H₂O

При этом восстановление селена до нуль-валентного состояния и последующее формирование наночастиц селена протекает в матрице галактозосодержащего полисахарида, обуславливающего гепатотропные свойства получаемого нанокомпозита, а также выполняющего функцию стабилизатора наночастиц в момент образования нанокомпозита. Выделение и очистка от примесей готового нанокомпозита производится посредством высаживания в четырехкратный избыток смешивающегося с водой органического растворителя (ацетона, этанола и др.) с последующей фильтрацией и сушкой.

2. Восстановлением товарного элементного селена (в виде пудры, порошка, гранул или блоков) до полиселенид- и селенид-анионов гидразингидратом в щелочной среде. При этом происходит растворение элементного селена и образование высокореакционноспособных селенид-анионов согласно уравнению:

2Se+4NaOH+N₂H₄·H₂O=2Na₂Se+N₂+5H₂O

[Э.Н. Дерягина, Н.В. Руссавская, Л.К. Паперная, Е.П. Леванова, Э.Н. Сухомазова, Н.А. Корчевий. "Синтез халькогенорганических соединений в основно-восстановительных системах" // Известия АН. Серия химическая, 2005, №11. С.2395-2405.]

Генерируемые селенид-анионы характеризуются ограниченной временной стабильностью, что определяет необходимость их получения непосредственно перед синтезом наночастиц селена. Затем к полученному раствору, содержащему селенид-анионы, добавляют водный раствор галактозосодержащего полисахарида и окисляют, продувая кислородом воздуха при комнатной температуре, что обеспечивает образование атомов селена в нулевой степени окисления, а полисахарид выступает в роли стабилизирующего лиганда для формирующихся наночастиц Se⁰. Выделение и очистка от примесей готового нанокомпозита также происходит посредством высаживания в четырехкратный избыток смешивающегося с водой органического растворителя (ацетона, этанола и др.) с последующей фильтрацией и сушкой.

3. Окислением органилдиселенофосфинатов аммония, щелочных и щелочноземельных металлов пероксидом водорода, которое протекает согласно схеме:

M[Se₂PR₂]_n+2H₂O₂=2Se⁰+M[O₂PR₂]_n+2H₂O

M = катионы аммония или щелочных, или щелочноземельных металлов, n=1, 2.

R = алкил-, арил-, гетарил-, арилалкил-, гетарилалкил-

Взаимодействие происходит в водных растворах полисахаридов с последующим формированием наночастиц селена и их одновременной стабилизацией полисахаридной матрицей при температуре 35-40°C. Выделение и очистка от примесей готового нанокомпозита происходит также посредством высаживания в четырехкратный избыток смешивающегося с водой органического растворителя (ацетона, этанола и др.) с последующей фильтрацией и сушкой.

В зависимости от способа получения наноселена, размер образующихся наночастиц составляет 1-100 нм, что определялось просвечивающей электронной микроскопией, а также ренгенофазовым анализом.

Накомпозит селена на основе природного галактозосодержащего гепатотропного полисахарида представляет собой гибридные органо-неорганические материалы, в качестве неорганической фазы которых выступают наноразмерные частицы элементного селена в количестве 0.5-60% и размером 1-100 нм, а в качестве органической фазы - природные галактозосодержащие полисахариды с гепатотропной активностью: арабиногалактан, галактоманнан, каррагинан и другие.

Независимо от способа получения наночастиц селена, выделение Se⁰-содержащего нанокомпозита осуществляют высаживанием реакционной смеси в четырехкратный избыток смешивающегося с водой органического растворителя (ацетона, этанола и др.). При этом происходит формирование осадка селенсодержащего нанокомпозита вследствие нерастворимости в органическом растворителе высокомолекулярного галактозосодержащего полисахарида (арабиногалактан, галактоманнан, каррагинан, и др.), являющегося основной фазой нанокомпозита. Все остальные органические и неорганические прекурсоры, восстановители и продукты их превращений являются низкомолекулярными и поэтому растворяются в водно-органической смеси и легко отделяются от нанокомпозита в процессе дальнейшей фильтрации и промывке на фильтре. Завершается процесс получения нанокомпозитов их простой сушкой на воздухе. Полученные нанокомпозиты представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена от 0.5 до 60%.

Антиоксидантное средство на основе наночастиц селена и галактозосодержащего полисахарида готовят растворением полученных селенсодержащих нанокомпозитов в дистиллированной воде. Соотношение компонентов в полученном средстве варьируется в следующих пределах (масс.%)

селенсодержащий нанокомпозит	0,0001-1,0
вода дистиллированная	остальное
содержание селена	0.0457-0.0913 мг на кг веса животного, или 3.0 мг для однократной суточной дозы человека

Следующие примеры получения препарата для лечения и профилактики редокс-ассоциированных патологий (в частности, токсического поражения печени), а также исследование их антиоксидантной активности, иллюстрируют изобретение.

Пример 1. В реакционную колбу помещают 0.5 г галактозосодержащего полисахарида каррагинана, добавляют 50 г воды и нагревают смесь при постоянном перемешивании на магнитной мешалке до температуры 40°C до полного растворения полисахарида, после чего раствор охлаждают до комнатной температуры и приливают 5 мл водного раствора, содержащего 0.0037 г диоксида селена, или 0.0042 г селенистой кислоты, или 0.0043 г селенита натрия. Перемешивают смесь в течение 5 минут, после чего добавляют 0.0050 г боргидрида натрия. По истечении 15 минут, производят выделение Se⁰-содержащего нанокомпозита осаждением реакционной смеси в четырехкратный избыток ацетона или этанола, с последующей фильтрацией, промывкой на фильтре тем же растворителем, а затем сушкой на воздухе. Полученный нанокомпозит представляет собой водорастворимый порошок оранжево-красного цвета, с массовым содержанием селена 0.5% и полисахарида 99.5%. Выход нанокомпозита составляет 97% (в пересчете на селен из его прекурсора).

Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите определялось элементным анализом, а также ренгено-энергодисперсионным микроанализом. Полученные Se⁰-содержащие нанокомпозиты проанализированы посредством просвечивающей электронной микроскопии и рентгенодифракционного анализа. Наличие в составе всех полученных нанокомпозитов наноразмерных частиц элементного селена, идентифицировано методом рентгенодифракционного анализа (Дифрактометр Bruker D8 ADVANCE), по уширенным рефлексам в области 21.6°; 29.7°; и 42° 2θ, которые соответствуют (110), (101) и (200) плоскостям кристаллической решетки наноразмерного элементного селена. Сферическая морфология наноразмерных частиц селена в составе нанокомпозитов на основе арабиногалактана, галактоманнана и каррагинана установлена на основании просвечивающей электронной микроскопии.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но берут увеличенное в 120 раз количество диоксида селена, или селенистой кислоты, или селенита натрия, а также боргидрида натрия. Выход нанокомпозита составляет 99% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 60% и полисахарида 40%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Пример 3. В реакционную колбу, помещают 0.5 г галактозосодержащего полисахарида галактоманнана, добавляют 50 г воды и нагревают смесь при постоянном перемешивании на магнитной мешалке до температуры 40°C до полного растворения полисахарида, после чего раствор охлаждают до комнатной температуры и вносят 5 мл раствора содержащего 0.022 г диоксида селена, или 0.025 г селенистой кислоты, или 0.026 г селенита натрия. Перемешивают смесь в течение 5 минут, после чего добавляют 0.029 г боргидрида натрия. По истечении 15 минут, производят выделение Se⁰-содержащего нанокомпозита (Se⁰-ГМ) осаждением реакционной смеси в четырехкратный избыток ацетона или этанола, с последующей промывкой на фильтре тем же растворителем, фильтрацией и сушкой на воздухе. Выход нанокомпозита составляет 98% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 3%, полисахарида 97%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Пример 4. Проводят аналогично примеру 3, но берут увеличенное в 20 раз количество диоксида селена, или селенистой кислоты, или селенита натрия, а также боргидрида натрия. Выход нанокомпозита составляет 99% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 60% и полисахарида 40%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Пример 5. В реакционную колбу помещают 1.0 г полисахарида арабиногалактана и 0.08 г органилдиселенофосфината или аммония, или щелочного, или щелочноземельного металла, затем добавляют 50 г воды и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения полисахарида. После чего раствор дополнительно термостатируют 3 ч при 35-40°C и добавляют концентрированную перекись водорода (Пергидроль). Выделение Se⁰-содержащего нанокомпозита и очистку нанокомпозита от образовавшегося дифенилфосфината осуществляют выливанием реакционной смеси в четырехкратный избыток ацетона или этанола, с последующей промывкой на фильтре тем же растворителем, фильтрацией осадка и сушкой на воздухе. Выход нанокомпозита составляет 97% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 2%, и полисахарида 98%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Пример 6. В реакционную трехгорлую колбу, оборудованную обратным холодильником, термометром и отверстием для ввода реагентов, помещают 0.224 г гидроксида натрия, добавляют 0.5 г гидразингидрата и нагревают смесь при постоянном перемешивании на магнитной мешалке до температуры 70°C, после чего добавляют 0.176 г или порошкообразного, или гранулообразного, или в виде раздробленных кусочков элементного селена. Смесь перемешивают при указанной температуре в течение 1.5 часов и охлаждают до комнатной температуры, при этом происходит растворение элементного селена и образование высокореакционноспособных селенид-анионов.

Далее аликвоту полученного раствора объемом 0.1 мл, вносят при комнатной температуре и интенсивном перемешивании в 1% водный раствор галактозосодержащего полисахарида каррагинана, постоянно барботируя воздух через смесь для селективного окисления селенид-анионов до атомарного элементного селена, с последующей конденсацией его до наночастиц. При этом галактозосодержащий полисахарид каррагинан выступает в роли стабилизирующего лиганда для формирующихся наночастиц Se⁰. По истечении 15 минут, производят выделение Se⁰-содержащего нанокомпозита (Se⁰-КГ) осаждением реакционной смеси в четырехкратный избыток ацетона или этанола, с последующей промывкой на фильтре тем же растворителем, фильтрацией и сушкой на воздухе. Выход нанокомпозита составляет 98% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 6%, полисахарида 94%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Пример 7. Проводят аналогично примеру 6, но в качестве стабилизирующего лиганда используют галактозосодержащий полисахарид галактоманнан. Выход нанокомпозита составляет 97% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 6%, полисахарида 94%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Пример 8. Проводят аналогично примеру 6, но в качестве стабилизирующего лиганда используют галактозосодержащий полисахарид арабиногалактан. Выход нанокомпозита составляет 99% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 6%, полисахарида 94%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Из всех полученных Se⁰-содержащих нанокомпозитов приготовлены антиоксидантные средства для лечения редокс-зависимых патологий. Это иллюстрируется следующими примерами.

Пример 9.

Антиоксидантное средство с гепатопротекторным эффектом на основе наночастиц селена и галактозосодержащего полисахарида арабиногалактана или галактоманнана или каррагинана и др. полисахаридов готовят растворением полученных селенсодержащих нанокомпозитов в дистиллированной воде при комнатной температуре. Средство представляет собой гомогенный прозрачный раствор светло-оранжевого цвета, агрегативно устойчивый в течение длительного периода времени. Соотношение компонентов в полученном средстве варьируется в следующих пределах (масс.%).

селеносодержащий нанокомпозит	0.0001-1,0
вода дистиллированная	остальное

При приготовлении средства первоначально исходят из содержания селена в сухом нанокомпозите, определенное элементным анализом, рентгено-энергодисперсионным микроанализом, а также другими чувствительными для определения селена видами анализа. Затем рассчитывают соотношение нанокомпозита и воды таким образом, чтобы в приготовленном антиоксидантном средстве концентрация селена была близка к эффективной дозе селена в селените натрия, используемого для профилактики и лечения вызываемой дефицитом селена в организме беломышечной болезни (0.1-0.2 мг Na₂SeO₃ на 1 кг массы животного, или 0.0457-0.0913 мг чистого селена на 1 кг массы животного, или 3.0 мг для однократной суточной дозы человека).

Пример 10.

Определение антиоксидантной активности in vitro.

Для оценки антиоксидантной активности (АОА) нанокомпозита селена с арабиногалактаном использовали спектрофотометрический метод, в котором радикал-катион 2,2′-азинобис(3-этилбентиозолин-6-сульфоновой кислоты) диаммониевой соли (ABTS^+·), имеющий характерное поглощение в области 600-850 нм, генерировали персульфатом калия и измеряли процент ингибирования поглощения добавляемыми антиоксидантами (Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization ASSAY // Free Radical Biology & Medicine, Vol.26, Nos. 9/10, pp.1231-1237, 1999)

Методика определения. Антиоксидантную активность определяли по методике, описанной в работе (Ильясов И.Р., Белобородов В.Л., Тюкавкина Н.А., Веровская Е.В. Применение радикал катионов ABTS^·+ в оценке антирадикальной активности флавоноидов. // Фармация, 2008, №6, С.15-18). Для определения АОА использовали раствор чистого арабиногалактана, а также его нанокомпозиты с селеном с концентрациями 1,9% и 3% в дистиллированной воде. Растворы антиоксидантов: аскорбиновой кислоты в воде и кверцетина в этаноле готовили с концентрациями 0,002 моль/л и 0,00057 моль/л, соответственно.

Процент ингибирования рассчитывали по формуле:

% ингиб. = 100·(1-A₂/A₁),

где A₁ - оптическая плотность раствора ABTS^·+ на длине волны 730 нм без добавления исследуемого образца; A₂ - оптическая плотность раствора ABTS^·+ через 4 минуты после добавления исследуемого образца.

На основании полученных результатов строили графики зависимости процента ингибирования от концентрации антиоксиданта и определяли IC50 - концентрацию, при которой нейтрализуется 50% радикал-катионов, также рассчитывали наиболее универсальную относительную характеристику АРА - ТЕАС - эквивалент антиоксидантной активности в пересчете на тролокс, активность которого принимают за 1. Данные по АРА изученных соединений представлены в таблице 1.

Таблица 1.
Характеристика антирадикальной активности исследуемых соединений для их молярных концентраций
Соединение	Ингибирующая концентрация IC50, мкмоль/л	TEACмIC50
Арабиногалактан	Не обладает	Не обладает
Нанокомпозит арабиногалактана и селена	18±2.9	0.91
s=2.5; n=6
Стандарт (аскорбиновая кислота)	16.1±1.1	0.98
s=0.96; n=5

Достоверность полученных величин IC50 оценивали среднеквадратической ошибкой (s) и доверительным интервалом среднего значения (Δx), вычисленным для n измерений при 95% вероятности по формулам (K. Doerffel, Statistics in Analytical Chemistry, Deut. Verlag Grundstoffind., Leipzig (1966).).

Как видно из таблицы, величины АРА стандартного антиоксиданта (аскорбиновая кислота) совпадают с литературными, поэтому используемую методику оценки АРА можно считать адекватной. Табличные данные свидетельствуют, что АРА полученного нанокомпозита селена с арабиногалактаном сравнима с таковой для аскорбиновой кислоты. Поскольку эксперименты показали, что исходный арабиногалактан не способен ингибировать ABTS^·+ при значительно более высоких концентрациях, чем нанокомпозит на его основе, можно полагать, что АРА последнего определяется наличием Se.

Значения антиоксидантной активности Se⁰-содержащих нанокомпозитов на основе галактоманнана и каррагинана in vitro, которые определялись нами аналогичным образом, оказались такими же, как и для Se⁰-содержащего нанокомпозита на основе арабиногалактана.

Пример 11.

Определение антиоксидантной активности in vivo.

Для определения антиоксидантной активности препарата использовали здоровых крыс, массой 180-220 г. исследования проводили согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под общей редакцией члена-корреспондента РАМН, профессора Р.У. Хабриева (Издательство «Медицина», 2005 г.). Изучаемый препарат вводили животным перорально через зонд в дозе 2 мкг/100 г массы животного (исходя из информации о содержании селена и эффективных доз селенита натрия). Результаты исследования о содержании продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной активности (АОА) приведены в таблице 2.

Таблица 2.
Содержание продуктов ПОЛ и АОА
Сроки забора материала	Группы экспериментальных животных	Исследуемые параметры сыворотки крови
		Двойные связи (усл. ед)	Диеновые конъюгаты (мкМ/л)	Конъюгированные диены _Сопряженные триены (ус. ед.)	Малоновый диальдегид (мкМ/л)	Антиоксидантная активность (ус. ед.)
7 сутки	Nano-Se	1.300±0.092•	1.950±0.129♦	0.786±0.161♦	2.290±0.287*	20.26±1.664
АГ	0.776±0.145	2.300±0.233♦	1.043±0.136♦	2.960±0.141se♦	13.50±1.726
CCl4	0.378±0.081	3.424±0.631	2.425±0.350	3.575±0.512	9.020±1.630
интактные	1.613±0.248	1.326±0.155	0.770±0.107	1.763±0.229	19.90±1.784
14 сутки	Nano-Se	1.560±0.144	1.753±0.259	0.793±0.159	2.426±0.337	18.43±0.860•♦
АГ	0.586±0.201•♦	2.616±0.280	1.200±0.221	3.156±0.261	11.43±1.368•
CCl4	0.374±0.029	3.631±0.385	2.370±0.221	4.092±0.393	7.706±1.746
интактные	1.430±0.081	1.256±0.148	0.466±0.117	1.886±0.217	19.96±3.442
21 сутки	Nano-Se	1.093±0.123	1.257±0.062*•♦	0.670±0.147	1.938±0.247	20.22±1.616
АГ	0.755±0.129	2.110±0.304se	1.340±0.237	3.325±0.481	12.18±2.242♦
CCl4	0.473±0.078	2.993±0.313	1.898±0.189	3.204±0.404	8.702±0.853
интактные	1.440±0.206	1.460±0,227	0.553±0.182	2.100±0.254	20.00±1.363
Примечание: +• - p<0.05 - в сравнении с интактными животными; * - p<0.05 - в сравнении с группой арабиногалактана; ♦ - p<0.05 - в сравнении с группой CCl4.

ДК - нетоксичный промежуточный продукт ПОЛ, и при дальнейшем окислении ДК образуют МДА, который оказывает отрицательное воздействие на организм, известное как редокс-ассоциированные поражения. Во все сроки эксперимента, содержание промежуточных продуктов (ДК) в группе Nano-Se ниже, чем в группах сравнения, и приближается к показателю группы интактных животных. Следовательно, и образование МДА из ДК достоверно ниже, чем в остальных группах. Такой показатель как АОА - показатель защиты организма от действия свободных радикалов и активных форм кислорода - всегда оставался на одном уровне в группе Nano-Se и даже превышал таковой у интактных животных, в то время как в группах с АГ и CCl₄ значительно был снижен во все дни эксперимента.

Активность селенсодержащих ферментов восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона, а так же супероксиддисмутазы (СОД) приведены в таблице 3.

Таблица 3.
Активность селенсодержащих ферментов восстановленного и окисленного глутатиона, а так же супероксиддисмутазы в сыворотке крови
Сроки забора материала	Группы экспериментальных животных	Исследуемые параметры
СОД (ус.ед)	GSH (мМ/л)	GSSG (мМ/л)
7 сутки	NanoSe	1.620±0.084*	1.826±0.069*•	1.380±0.105*
АГ	1.343±0.040se♦	1.144±0.177se♦	1.380±0.032se♦
CCl4	1.078±0.130	1.144±0.086	1.233±0.099
интактные	1.637±0.071	2.013±0.172	1.436±0.059
14 сутки	Nano-Se	1.730±0.097	1.940±1.130•	1.686±0.092
АГ	1.390±0.083	1.276±0.153•♦	1.473±0.056
CCl4	1.100±0.091	1.093±0.077	1.204±0.069
интактные	1.606±0.118	2.026±0.062	1.660±0.093
21 сутки	NanoSe	1.705±0.069*	1.790±0.641*•♦	1.548±0.158•
АГ	1.362±0.166se♦	1.235±0.086se	1.290±0.106
CCl4	1.213±0.067	1.160±0.064	1.014±0.083
интактные	1.650±0.102	2.030±0.065	1.700±0.073
Примечание: • - p<0.05 - в сравнении с интактными животными; * - p<0.05 - в сравнении с группой арабиногалактана; ♦ - p<0.05 - в сравнении с группой CCl4

Супероксиддисмутаза (СОД) - фермент - показатель защиты мембран клеток от повреждающего действия свободных радикалов, образующихся при активации ПОЛ - достаточно высок в группе Nano-Se. Также небольшое повышение активности СОД является компенсаторным механизмом защиты клеток от окислительного стресса (Герасименко М.Н. Титова Н.М., Зуков Р.А. и др. Перекисное окисление липидов и состояние антиоксидантной системы в эритроцитах, больных раком почки. / М.Н. Герасименко, Н.М. Титова, Р.А. Зуков, Ю.А. Дыхано, Е.С. Перетока // Бюллет. эксперимент, биол. и мед. - 2012. - №3. - С.693).

Селеносодержащий фермент глутатион восстановленный (GSH) является важнейшим внутриклеточным антиоксидантом (Pompella A., Visvikis A., Paolicchi A., De Tota V., Casini A.F. 2003. The changing faces of glutathione, a cellular protagonist. Biochem. Phermacol. 66: 1499-1503.) и его активность зависит от наличия в организме элементного селена, а также витамин Е. В клетках же глутатион восстанавливает любую дисульфидную связь. При этом GSH превращается в GSSG. Содержание GSH в группе Nano-Se достаточно высокое и приближается к показателям группы интактных животных, что говорит о высоком уровне антиоксидантной защиты клетки во все сроки эксперимента.

Изменение концентрации жирорастворимых витаминов, являющихся компонентами общей антиоксидантной активности и которые могут играть важнейшую роль в гомеостазе вязкостных свойств мембран, приведены в таблице 4.

Таблица 4.
Содержание жирорастворимых витаминов в сыворотке крови
Сроки забора материала	Группы экспериментальных животных	Исследуемые параметры
α-токоферол (мкМ/л)	ретинол (мкМ/л)
7 сутки	Nano-Se	9.000±0.746*	0.83±0.159
АГ	11.886±1.717se	1.563±0.225•
CCl4	5.208±1.084	0.454±0.127
интактные	7.010±1.020	0.776±0.085
14 сутки	Nano-Se	9.456±1.737	0.930±0.152
АГ	14.403±1.241	2.016±0.087•
CCl4	5.554±1.128	0.374±0.103
интактные	8.420±1.698	1.040±0.220
21 сутки	Nano-Se	7.215±1.082	1.185±0.163•
АГ	14.440±1.916•♦	1.362±0.148•
CCl4	6.569±0.854	0.600±0.100
интактные	11.230±0.791	1.140±0.355
Примечание: • - p<0.05 - в сравнении с интактными животными; * - p<0.05 - в сравнении с группой арабиногалактана; ♦ - p<0.05 - в сравнении с группой CL4

Таким образом, исследование нового нанокомпозитного препарата селена in vitro и in vivo показало его выраженные антирадикальные свойства