Сулодексид для применения в лечении патологий, в которые вовлечены металлопротеиназы

Сулодексид для применения в лечении патологий, в которые вовлечены металлопротеиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В настоящем изобретении описан сулодексид или по меньшей мере один из его компонентов для применения в снижении уровня циркулирующей матриксной металлопротеиназы (ММР), в частности ММР-9.

Сулодексид и его композиция полезны для лечения патологий, в которые вовлечены ММР, таких как сердечно-сосудистое заболевание, сердечнососудистое заболевание, вызванное диабетом, варикозное расширение вен, хроническая венозная недостаточность (CVI), желудочно-кишечные язвы, легочное заболевание и неопластические патологии.

Предшествующий уровень техники

Недавние исследования продемонстрировали участие группы цинк-зависимых эндопептидаз, названных матриксными металлопротеиназами (ММР), принадлежащих к матриксиновому семейству, в сосудистых изменениях при сердечно-сосудистых патологических состояниях.

Венозная гипертензия является основой нескольких патологий, связанных с расстройствами макро- и микроциркуляции и вызывающих инфильтрацию лейкоцитов в эндотелий, разрушение сердечных клапанов и, наконец, обеспечивающих ремоделирование/перестройку венозной стенки, что может приводить к рефлюксу или образованию варикозного расширения вен и к патологиям дермы, как описано в Bergam J. et al. Ann. Vasc. Surg. 21 (2007), 260-266. Raffetto JD. и др. в Thromb. Res. 123 (2009) S66-S71 сообщают, что модификации, наблюдаемые во время развития хронической венозной патологии, могут быть связаны с изменением баланса между уровнем матриксных металлопротеиназ (ММР) и их тканевых ингибиторов (TIMP) в крови.

Как ММР, так и TIMP, участвуя в физиологическом ремоделировании внеклеточного матрикса, играют важную роль также и в клеточной коммуникации.

Высокие концентрации ММР были обнаружены при различных патологиях, как сообщают Mannello F. и др. в Curr. Cancer Drug Targets 5 (2005), 285-298. Среди ММР, ММР-9 (желатиназа В, КФ 3.4.24.35 с 92, 130 и 225 кДа) вовлечена в несколько патологий, в том числе неопластические патологии, откуда следует, что их присутствие в виде циркулирующего фермента и их увеличение связаны с развитием различных типов рака, таких как рак молочной железы, легких, яичников, предстательной железы и меланома, как сообщают Rahko E. и др. в Tumor Biol., 30 (5-6) (2009), 574-64.

Патогенная роль ММР четко показана при сосудистых патологических состояниях, вызванных также диабетом. Galis Z.S. и др. в Circ. Res. 90 (2002), 251-262, Kadoglou N.P. и др. в Angiology 56 (2005), 173-189, Derosa и др. в Diabetes Metab. 33 (2007), 129-134 и Tayebjee M.H. и др. в Diabetes Care 27 (2004), 2049-2051 описывают повышенный уровень циркулирующей ММР у пациентов с диабетом.

Raffetto JD. и др. в Biochem. Pharmacol. 75 (2008), 346-359, демонстрируют важность ММР в сосудистых заболеваниях, сообщая, что повышенная деградация внеклеточного матрикса (ЕСМ) в венозной стенке вовлечена в ранние стадии расслабления вен, образование варикозного расширения вен, дермальную модификацию и, наконец, приводит к образованию венозных язв.

Среди нескольких патологических механизмов, связанных с повышенной экспрессией ММР, важны и являются возможным объектом фармакологического лечения взаимодействия лейкоцитов с эндотелием. Mannello F. и др. сообщают в Arterioscler. Thromb, Vase. Biol. 28 (2008), 611-614, что лейкоциты и тромбоциты содержат более высокие количества ММР, которые могут высвобождаться во внеклеточную среду после активации/дегрануляция лейкоцитов или во время агрегации тромбоцитов. Более того, ММР-9 высвобождается из тромбоцитов и лейкоцитов после такого стимула, как реакции, индуцированные процессом коагуляции.

Известно, что плазмин, активированный во время фазы коагуляции, в свою очередь, является активатором ММР.

Среди протеолитических ферментов, присутствующих в человеческих стенках и потенциально ассоциированных с раковыми инвазиями, ММР, как было продемонстрировано, вовлечены в способность практически разрушать белки интерстициального матрикса и базальных мембран, позволяя клеткам диффундировать и проникать в соседние стенки.

Несколько соединений, таких как рецепторы ростовых факторов и молекулы клеточной адгезии, хемокины, цигокины, апоптозные лиганды и ангиогенные факторы, могут взаимодействовать с ММР, модифицируя и их экспрессию, и их активность.

Эти протеолитические ферменты действуют на многие биоактивные субстраты, вовлеченные в такие стадии неопластического развития, как рост первичной опухоли, ангиогенез, экстравазация и интравазация неопластических клеток, миграция и инвазия метастатических клеток во вторичный орган, начало и поддержание опухолевого роста.

Несколько клинических исследований было проведено как на животных, так и человеческих опухолевых моделях для оценки важности снижения уровня циркулирующей матриксной металлопротеиназы. Полученные результаты привели к разработке синтетических ингибиторов, как описано Ramnath N. и др. в Curr. Oncol. Rep.6 (2004), 96-102.

Основные исследованные ингибиторы содержат пептиды-миметики и пептиды-немиметики коллагена, тетрациклинов и бифосфонатных производных.

Клинические испытания, проведенные с имеющимися соединениями, показали, что длительные режимы лечения вызывают скелетно-мышечную боль и воспаление. Хотя показано, что эти события обратимы, и пациенты снова начинали лечение после короткого периода отмены, неожиданные нежелательные события ограничивали вводимые дозировки.

Более того, когда клинические испытания в отношении лечения неопластических заболеваний были расширены на большее число пациентов, кроме серийных токсикологических проблем вследствие цитостатических эффектов, никакой значительной терапевтической пользы не наблюдали, как сообщили Mannello F. и др. в Curr. Cancer Drug Targets 5 (2005), 285-298.

Некоторые ингибиторы ММР, исследованные в клинических испытаниях, представляют собой батимастат, маримастат, приномастат, BAY 12-9566, CGS27023A и производные тетрациклинов.

Батимастат, ВВ-94 (WO 90057191), представляет собой производное гидроксамовой кислоты, которое имитирует пептидную структуру природных субстратов. Батимастат является мощным ингибитором ММР и был первым ингибитором ММР, использованным в клинических испытаниях, но как было показано, он имеет низкую селективность, вызванную низкой растворимостью и абсорбцией. Более того, лечение батимастатом плохо переносится пациентами, поскольку его надо вводить посредством инъекций в плевральное и брюшное пространство. Клинические испытания Фазы III почти немедленно были остановлены из-за серьезных побочных эффектов, таких как сильные локальные воспалительные тканевые реакции, тошнота, боли в животе, как сообщают Tu G. и др. в Curr. Med. Chem. 15 (2008), 1388-1395.

Маримастат, ВВ-2516 (WO 9402447), представляет собой производное гидроксамовой кислоты с такой же структурой, что и батимастат, но с более высокой растворимостью и последующей более легкой абсорбцией при пероральном введении. Маримастат, как и батимастат, имеет низкую специфичность и был токсичным приблизительно у 30% всех леченых пациентов, вызывая скелетно-мышечные боли и ригидность, которые начинаются с мелких суставов пальцев рук и распространяются на предплечья и плечи, особенно около мест присоединения сухожилий, фиброз и некроз околосуставных стенок локтя и колена и желудочное расстройство, ассоциированные с потерей массы тела, как сообщают Vihinen и др. в Int. J. Cancer 99 (2002), 157-166.

Приномастат, AG3340 (WO 90720824) представляет собой производное гидроксамовой кислоты, селективное против некоторых ММР, вовлеченных в опухолевую инвазию и метастазы. Во время клинических испытаний побочные эффекты наблюдались в суставах плеч, коленей и рук, и лечение немедленно отменили, как сообщают Ramnath N. и др. в Curr. Oncol. Rep.6 (2004), 96-102.

BAY 12-9566 (US 4705798) представляет собой производное масляной кислоты, и в нескольких клинических испытаниях оно продемонстрировало токсичность, проявляющуюся в тромбоцитопении, анемии, увеличении уровней печеночных ферментов и билирубина, тошноте, утомляемости и головной боли, как сообщают Nelson А. и др. J. Clin. Oncol. 18 (2000), 1135-1149.

CGS27023A (US 5455258) имеет известные токсичные эффекты с обширным кожным раздражением, миалгией и артралгией.

Также производные тетрациклинов продемонстрировали во время клинических испытаний тяжелые нежелательные эффекты, такие как утомляемость, спутанность сознания, тошнота, рвота, кожная фототоксичность, увеличение уровней панкреатических ферментов, которые ограничивают вводимые дозы, как сообщают Hidalgo М. и др. в J. Natl. Cancer Inst. 93 (2001), 178-193.

Зимография и обратная зимография представляют собой методы, используемые в настоящее время для анализа ММР и TIMP в биологических образцах. Все типы субстратов для зимографии берут из способа желатиновой зимографии. Методы являются одинаковыми, за исключением того, что субстрат отличается, в зависимости от типа ММР или TIMP. В этих методах белки разделяются электрофорезом в денатурирующих, невосстанавливающих условиях в присутствии додецилсульфата натрия (SDS). Желатиновая зимография является методом, используемым в основном для определения ММР, представляющих собой желатиназу, и она чрезвычайно чувствительна для детекции ММР-2 и ММР-9 в концентрации несколько пикограмм. Следует учитывать, что другие ММР, такие как ММР-1, ММР-8 и ММР-13, также могут разлагать этот субстрат.

Этот метод основан на разделении электрофорезом в полиакриламидном геле со специфическим субстратом; SDS денатурирует ММР, которые становятся неактивными, и после миграции в электрофорезе SDS удаляют из геля в подходящем буфере, который восстанавливает структуру и функции ММР. После этого, если гель инкубируют, то активированные желатиназы переваривают желатин, который превращается в низкомолекулярные пептиды, которые удаляют промывкой, как описано Mannello F. и др. в Clin. Chem. 49 (2003), 339-34.

Гели помещают в проявочный раствор, например содержащий Кумасси, и затем обесцвечивают растворами, содержащими метиловый или этиловый спирт и уксусную кислоту. Окрашенные зоны геля являются результатом присутствия непереваренного желатина, тогда как неокрашенные зоны являются результатом ферментативной активности ММР. Ферментативная активность пропорциональна ширине прозрачных полос, таким образом, ее можно проанализировать и количественно определять с помощью денситометра, снабженного анализатором изображений.

Зимограммы дают специфичную и четкую информацию о ММР и, в частности о ММР-2 и ММР-9, поскольку эти два фермента могут быть разделены на основании различных электрофоретических подвижностей, которые зависят от их молекулярных масс. С этой целью подходящие стандарты молекулярной массы, соответствующие 72 кДа для про-ММР-2 и 92, 130 и 225 кДа для комплекса про-ММР-9 и ММР-9, наносят для сравнения на тот же гель.

Mannello F. и др. в Clin. Biochem. 41 (2008), 1466-73 исследовали эффект добавления высокомолекулярного гепарина (HMWH) лития на образцы периферической крови для оценки влияния HMWH на экспрессию ММР и TIMP в крови. Описанный эффект состоял в том, что HMWH оказывал как прямое, так и опосредованное влияние, изменяя количество циркулирующих ММР и TIMP и увеличивая высвобождение TIMP-2. Цель этой публикации состояла по существу в описании влияния высокомолекулярного гепарина (HMWH) на экспрессию ММР при манипуляциях с кровью для того, чтобы стандартизировать процедуры обращения с образцами крови в способе измерения ММР. В этой публикации нет ссылок и/или предложений, относящихся к фармакологическим применениям гепарина. Более того, не сообщаются концентрации гепарина лития, при которых наблюдается эффект. Вследствие этого, невозможно знать, может ли концентрация гепарина лития, которая обеспечивает наблюдаемый эффект, быть терапевтически полезной, поскольку хорошо известен высокий риск кровотечения, ассоциированный с HMWH. Тем не менее, поскольку известно, что гепарины обычно вводят посредством инъекции, следует предположить, что любое возможное применение гепарина с целью изменения концентраций ММР в плазме должно следовать тому же пути.

Эффект гепарина на экспрессию мРНК ММР-2 и TIMP-2 также описано у Caenazzo I. и др. в Nephrol. Dial. Transplant 2001, 16, 1769-75.

Поэтому все еще существует потребность в поиске активных ингредиентов для медицинских препаратов, полезных в снижении концентрации циркулирующих ММР в крови с целью лечения всех патологий, в которые вовлечены ММР, таких как патогенез воспаления, инфекционное, или неопластические, или сердечно-сосудистое заболевание. Среди этих патологий есть, например, патологии, вызванные диабетом, варикозное расширение вен, хроническая венозная недостаточность (CVI), атеросклероз, разрыв сердца после инфаркта миокарда, аневризма брюшной аорты, легочная патология, увеличение и развитие опухоли, врастание первичной опухоли, аномальный ангиогенез, экстравазации и интравазации неопластических клеток.

Сосудистые заболевания выбраны из группы варикозного расширения вен, атеросклероза у человека, разрыва сердца после инфаркта миокарда, аневризмы брюшной аорты.

Более того, существует потребность в получении лекарственных средств без каких-либо побочных или токсических эффектов при терапевтически эффективной дозировке, приемлемой для пациентов и вводимой пероральным путем, внутримышечной или внутривенной инъекцией для лечения всех патологий, в которые вовлечены ММР.

Неожиданно обнаружили, и это является предметом настоящего изобретения, что сулодексид или один из его компонентов, в частности дерматансульфат, полученный с помощью сулодексида (SDX-DS), или гепарин (SDX-HEP), полученный с помощью сулодексида, ингибирует и/или снижает уровень циркулирующих ММР.

Сулодексид представляет собой природную смесь природных гликозаминогликанов (GAG), экстрагированных из слизистой оболочки кишечника млекопитающих, как описано в US 3936351, которая содержит смесь быстродвижущегося гепарина (SDX-HEP) со средней молекулярной массой 7 кДа и дерматансульфата (SDX-DS) со средней молекулярной массой 25 кДа. Другие возможные компоненты, содержащиеся в сулодексиде, представляют собой хондроитинсульфат и гепарин. Сулодексид следует рассматривать в качестве уникального активного ингредиента, отличного от других гликозаминогликанов, содержащего примерно 80% по массе SDX-HEP и примерно 20% по массе SDX-DS. Эти компоненты до сих пор еще не выделены, и компоненты сулодексида определяют аналитическим способом, таким как гель-фильтрация и электрофорез.

Известно, что сулодексид демонстрирует высокую аффинность к антитромбину III (AT III) и кофактору II гепарина, ингибирует фактор Ха и тромбин, активирует тканевый плазминоген и снижает уровень фибриногена, как описано Ofosu F.A. в Semin. Thromb. Hemost. 24 (1998), 127-38 и Ceriello A. и др. в Diab, Nutr. Metab., 6 (1993), 1-4.

Поскольку известно, что активация плазмина из плазминогена представляет собой один из механизмов локальной активации ММР, известные свойства сулодексида приводят к выводу, что это соединение должно повышать концентрацию циркулирующих ММР.

В настоящем изобретении описан сулодексид или один из его компонентов, в частности SDX-DS или SDX-HEP, для ингибирования и/или снижения уровня циркулирующих ММР и, в частности ММР-9, известной также как желатиназа В, которые вовлечены во многие заболевания, в частности, инфекцию или неопластическое заболевание, сосудистое заболевание, характеризующееся высоким уровнем ММР, желудочно-кишечные язвы, увеличение и развитие опухоли, рост первичной опухоли, измененный ангиогенез, экстравазацию и интравазацию неопластических клеток и их комбинации. Что касается сосудистого заболевания, характеризующегося высоким уровнем ММР, то настоящее изобретение, в частности, относится к хронической венозной недостаточности (CVI), варикозному расширению вен, разрыву сердца после инфаркта миокарда, аневризме брюшной аорты, расслаблению вен, легочной патологии и неопластическим патологиям.

Другой неожиданный и важный аспект настоящего изобретения представляет собой дерматансульфат (SDX-DS) и низкомолекулярный гепарин (SDX-HEP), выделенный из сулодексида, способ их получения и их применение для ингибирования и/или снижения высвобождения ММР in vitro и in vivo, в отдельности или в их смеси.

Этот результат является действительно неожиданным, поскольку в литературе, например, в Cell Biol. Int. 2003, 27, 779-84, Isnard N. и др. сообщают, что дерматансульфат активирует экспрессию ММР-2 и ММР-9.

Неожиданные характеристики SDX-DS были продемонстрированы при сравнении с коммерческим дерматансульфатом, и результаты показаны в Примерах 2-9.

Эти результаты действительно делают сулодексид уникальным соединением, отличным от любых других гликозаминогликанов, которые могут быть получены с помощью низкомолекулярных гепаринов и дерматансульфатов, доступных на рынке, для лечения всех патологий, в которые вовлечены ММР.

Другой аспект настоящего изобретения относится к SDX-DS, выделенному из сулодексида.

Другой аспект настоящего изобретения относится к SDX-HEP, выделенному из сулодексида.

Другой конкретный аспект настоящего изобретения относится к дерматансульфату, полученному из сулодексида способом очистки, таким как аффинная хроматография с AT III-функционализированной средой.

Другой конкретный аспект настоящего изобретения относится к низкомолекулярному гепарину, полученному из сулодексида способом очистки, таким как аффинная хроматография с AT III-функционализированной средой.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим SDX-DS или SDX-HEP, и их применению в качестве лекарственного средства.

Описание изобретения

Предметом настоящего изобретения является сулодексид или один из его компонентов, в частности, SDX-DS или SDX-HEP, выделенный из сулодексида, и их применение в качестве лекарственного средства при всех патологиях, в которые вовлечены ММР. В частности, в изобретении описано применение сулодексида, или SDX-DS, или SDX-HEP для снижения уровня и/или ингибирования циркулирующих ММР, в частности, индуцибельной формы желатиназы ММР-9, с последующим уменьшением концентрации циркулирующих ММР в крови. Выделенные компоненты могут быть использованы для лекарственного средства либо по отдельности, либо в их смеси.

Сулодексид представлен в виде лекарственного средства, имеющегося в продаже под товарным знаком VESSEL 2F®, и его вводят пероральным путем, посредством внутримышечной или внутривенной инъекции для лечения сосудистых патологий с риском тромбоза, таких как расстройство периферических артерий, постфлебитный синдром, для лечения альбуминурии при нефропатии, как описано Harenberg J. в Med. Res. Rev. 18 (1998), 1-20 и Tamarin R. в Medical Praxis 8 (1997), 1.

Здесь также предусмотрено, что сулодексид и его производные, в частности SDX-DS и SDX-HEP, включают в себя их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, гидраты и клатраты.

Важным аспектом настоящего изобретения является специфичность сулодексида в ингибировании/снижении уровня ММР-9, называемой также желатиназой В, которая вовлечена в расслабление вен, варикозное расширение вен, хроническую венозную недостаточность (CVI) и язвы нижних конечностей.

Сулодексид, или SDX-DS, или SDX-HEP могут быть использованы в качестве активного ингредиента при всех патологиях, характеризующихся увеличением уровня индуцибельной ММР-9, без какого-либо влияния на конститутивную ММР-2. Преимуществом сулодексида или его компонентов является возможность введения пероральным или инъекционным путем, внутримышечным или внутривенным. Другим преимуществом сулодексида и его компонентов является возможность введения высокой дозировки без побочного эффекта, как описано в ЕР 1292315, которая хорошо переносится вплоть до 1000 мг/сутки и выше.

В настоящем изобретении описано новое применение сулодексида, или SDX-DS, или SDX-HEP для снижения и/или ингибирования концентрации ММР, в частности ММР-9 (желатиназа В, КФ 3.4.24.35 с мол. масс. 92, 130 и 225 кДа).

В настоящем изобретении описан сулодексид или один из его компонентов, в частности SDX-DS и SDX-HEP, для применения в ингибировании или снижении уровня ММР, в частности ММР-9, более чем на 20%.

В настоящем изобретении описаны количества сулодексида или SDX-DS или SDX-HEP, достаточные для достижения снижения и/или ингибирования высвобождения ММР-9 из клеток крови в циркулирующую плазму с последующим уменьшением активности циркулирующих ММР в венозном аппарате и последующим уменьшением ферментативной активности in situ в венозных стенках. Такой эффект имеет место при концентрации сулодексида in vitro и ex-vivo в диапазоне от 8 мкг/мл до 12 мкг/мл. Эти концентрации соответствуют терапевтически приемлемым дозировкам, которые могут достигаться в крови посредством введения сулодексида внутривенным, внутримышечным или пероральным путем при дозировках от 20 мг и вплоть до 1000 мг/сутки. Эффект сулодексида, SDX-DS, SDX-HEP на ММР в описанных концентрациях был продемонстрирован в экспериментах ex-vivo на биологических образцах.

Подробно, образцы крови брали от 50 здоровых добровольцев, мужчин и женщин. Образцы, которые обрабатывали для получения соответствующих образцов плазмы и сыворотки, анализировали с добавлением или без добавления варьирующей концентрации сулодексида SDX-DS и SDX-HEP.

В изобретении также описан SDX-DS, содержащийся в сулодексиде, в концентрации примерно 20% по массе, SDX-HEP в концентрации примерно 80%, способ их получения и применение в качестве лекарственного средства и для лечения всех патологий, в которые вовлечены ММР. SDX-DS и SDX-HEP могут быть получены способом очистки и экстракции.

В частности, в Примере 1 описан способ получения SDX-DS и SDX-HEP из сулодексида посредством очистки аффинной хроматографией, где гепариновую фракцию адсорбируют на стационарной фазе, функционализированной AT III, и дерматановую фракцию собирают в неадсорбированном элюате.

В Примере 2 описан эффект добавления в цельную кровь возрастающих количеств сулодексида до конечной концентрации от примерно 10 мкг/мл до примерно 50 мкг/мл и SDX-DS, экстрагированного из сулодексида, в конечной концентрации от примерно 0 мкг/мл до примерно 10 мкг/мл. После центрифугирования сыворотку из образцов цельной крови собирали и анализировали в желатиновой зимографии, как описано Mannello F. и др. в Clin. Chem. 2003, 49, 339-34. Для того чтобы нормализовать активности ММР в различных образцах, объем образцов доводили до одинаковых количеств общих белков. Денситометрические результаты желатиновой зимографии показаны в Таблице 2, где значение 100% приписано площади ММР из образцов сыворотки без добавления сулодексида или ингибитора ММР, и вычислено уменьшение площади ММР в присутствии сулодексида и SDX-DS. Было показано, что площадь полосы, соответствующей ММР-9, уменьшается по меньшей мере примерно на 20% при концентрации сулодексида, соответствующей примерно 10 мкг/мл, и до менее чем одна десятая при концентрации сулодексида, соответствующей примерно 50 мкг/мл.

Добавление сулодексида не влияет на концентрацию ММР-2.

Получается, что добавление сулодексида к образцам цельной крови до конечной концентрации в диапазоне от примерно 10 мкг/мл до примерно 50 мкг/мл снижает концентрацию циркулирующих ММР, в частности ММР-9, в соответствующих образцах сыворотки и пропорциональным образом, тогда как концентрация ММР-2 остается неизмененной.

В таблице 2 приведены также денситометрические результаты в образцах, обработанных SDX-DS, где площадь полосы, относящейся к ММР-9, уменьшается по меньшей мере примерно на 20% при концентрации, соответствующей примерно 2,5 мкг/мл, и по меньшей мере примерно на 60% при конечной концентрации примерно 10 мкг/мл.

Из этих результатов можно сделать вывод, что эффекту снижения/ингибирования ММР отдается предпочтение благодаря присутствию SDX-DS, содержащегося в сулодексиде, и эти результаты делают сулодексид уникальным активным ингредиентом среди гликозаминогликанов.

Эти данные также подтверждены количественным твердофазным иммуноферментным анализом, выполненным с использованием набора Biotrak® MMP Amersham, который распознает про-ММР желатиназы с пределом детекции (LOD, от англ. limit of detection), соответствующим 0,37-0,25 мкг/мл.

Таблица 3 подтверждает, что сулодексид при концентрации примерно 25 мкг/мл снижает по меньшей мере примерно на 20% площадь полосы, относящейся к ММР-9, и по меньшей мере примерно на 60% при концентрации примерно 50 мкг/мл. Добавление SDX-DS, полученного в Примере 1, снижает количества ММР по меньшей мере примерно на 20% при концентрации примерно 2,5 мкг/мл и по меньшей мере примерно на 60% при концентрации примерно 10 мкг/мл.

Демонстрация того, что сулодексид действует также на снижение высвобождения ММР тромбоцитами и лейкоцитами, очевидна в Примере 3, в котором сулодексид добавляют к образцам плазмы после удаления клеточного компонента цельной крови центрифугированием.

В Примере 3 описаны результаты, относящиеся к добавлению сулодексида к образцам крови, полученным от 50 здоровых добровольцев со средним возрастом 37 лет, ранее обработанным 0,13 М раствором цитрата натрия в количестве между 1% и 10% по объему и затем центрифугированным. К образцам супернатантов добавляли количества сулодексида до конечной концентрации от примерно 10 мкг/мл до 50 мкг/мл. Образцы анализировали с помощью желатиновой зимографии, как описано в Примере 2.

Значение, соответствующее 100%, приписывали полосе образца сыворотки без какого-либо добавления (контроль) и определяли пропорциональные уменьшения площади в зависимости от увеличивающихся количеств сулодексида в образцах сыворотки. Наблюдали, что прозрачные полосы переваривания желатина, относящиеся к протеолитической активности ММР-9, остаются неизменными после добавления сулодексида, как показано в Таблице 4 из Примера 3, и этот результат демонстрирует, что сулодексид не влияет на активность ММР, когда ферменты уже высвобождены в плазму.

Такой же результат получают, когда сулодексид добавляют к образцам сыворотки, как описано в Примере 4, в которые были добавлены возрастающие количества сулодексида. В частности, в Примере 4 описан эффект увеличивающихся количеств сулодексида от примерно 10 мкг/мл до примерно 50 мкг/мл, добавляемых к образцам сыворотки, полученной после центрифугирования образцов крови, взятых у 50 здоровых добровольцев со средним возрастом 37 лет. Полученные образцы сыворотки анализировали методом зимографии, как описано в Примере 2.

Относительные денситометрические значения желатинолитических площадей коррелировали с желати политически ми полосами ММР-2 и ММР-9, как показано в Таблице 5, где не наблюдалось никакого снижения относительно полос образца без добавления сулодексида.

В частности, полученные результаты из Примера 2 демонстрируют, что сулодексид и SDX-DS, содержащийся в сулодексиде, предотвращают увеличение и снижение уровня ММР в крови посредством механизма действия, который селективно действует на индуцибельную форму ММР-9, идентифицируя возможное терапевтического применение для лечения всех патологий, где присутствие ММР-9 прямо или опосредованно коррелирует с течением заболевания.

В Примере 5 описано сравнение между сулодексидом, парнапарином и SDX-DS, экстрагированным из сулодексида, по ММР, присутствующим в сыворотке. Образцы цельной крови, взятые от здоровых добровольцев, обрабатывали как в Примере 2, группу образцов обрабатывали сулодексидом до конечной концентрации примерно 25 мкг/мл, группу с дерматансульфатом - до конечной концентрации примерно 5 мкг/мл, и группу с низкомолекулярным гепарином (парнапарином) - до конечной концентрации примерно 20 мкг/мл. В Таблице 8 и Таблице 9 описаны результаты, полученные при зимографии и иммуноферментном анализе соответственно, где сулодексид демонстрирует снижение уровня ММР-9 в диапазоне от 50% до 70%, парнапарин в диапазоне от примерно 20% до 30%, и SDX-DS в диапазоне от примерно 50% до 70% относительно контрольного образца без какого-либо добавления.

Уникальное свойство сулодексида высвобождать ММР следует отнести к природной смеси GAG (гликозаминогликаны), которые представляют сулодексид.

Пример 6 подтверждает характеристики SDX-DS в снижении уровня ММР по сравнению с двумя различными дерматансульфатами, коммерчески доступными на рынке. В той же концентрации 5 мкг/мл SDX-DS индуцирует снижение уровня ММР-9 более чем на 50%, тогда как два коммерческих дерматансульфата (Sigma и Calbiochem) индуцируют снижение менее чем на 10%.

Обнаружили, что SDX-DS снижает уровень ММР, в частности ММР-9, по меньшей мере в три раза больше, чем коммерческие препараты DS.

Пример 7 демонстрирует, что SDX-HEP также имеет уникальные свойства, фактически, смесь низкомолекулярного гепарина и дерматансульфата, содержащаяся в сулодексиде, действуют иначе, чем синтетическая смесь, полученная путем добавления парнапарина к коммерческим дерматансульфату и SDX-DS.

Более подробно, сулодексид сравнивают со смесями низкомолекулярного гепарина и дерматансульфатов, смешанных примерно в таком же соотношении, какое имеет место в сулодексиде, примерно 80% парнапарина и примерно 20% дерматансульфата. Данные, представленные в Таблице 11, свидетельствуют о том, что сулодексид демонстрирует значительно более высокий процент ингибирования относительно смесей парнапарин/дерматансульфат и парнапарин/SDX-DS.

В частности, наблюдение, что сулодексид имеет превосходную активность относительно смеси гепарин/SDX-DS, позволяет продемонстрировать, что гепариновый компонент, содержащийся в сулодексиде, также имеет уникальные свойства, влияющие на уровень циркулирующих ММР.

Также была продемонстрирована способность сулодексида применительно к ММР на таком биологическом образце, как внутренняя стенка вен.

Внутренние стенки вен особенно важны, поскольку они являются местом действия ММР, вызывающих некоторые патологии, относящиеся к протеолитическому ремоделированию внеклеточного матрикса.

В Примере 8 показан сравнительный эффект сулодексида, SDX-DS и парнапарина на ММР на венозных стенках в иммуногистохимическом эксперименте. Этот эксперимент подтверждает эффект сулодексида и SDX-DS во всех патологиях, где вовлечены ММР, и, в частности, в снижении и/или ингибировании концентрации и экспрессии ММР. Добавляли сулодексид, SDX-DS и парнапарин в концентрации, соответственно, примерно 25 мкг/мл, 5 мкг/мл и 20 мкг/мл к сегментам подкожной вены ноги человека, хирургически полученным от 10 здоровых женщин (средний возраст 42 года), подвергнутым сафенэктомии в отношении варикозной вены.

После надлежащей обработки ткани, серийные срезы толщиной примерно 5 мкм инкубировали с моноклональным антителом против ММР-9, и после инкубации с биотинилированным вторичным антителом комплекс определяли с помощью пероксидазной реакции в соответствии со стандартными способами. Комплекс после инкубации детектировали с помощью авидин-пероксидазы в соответствии со стандартными способами.

Образцы ткани, обработанные сулодексидом, продемонстрировали уменьшенные площади окрашенной области, что демонстрирует более низкую локальную концентрацию ММР относительно контрольных и обработанных гепарином образцов.

Таблица 12 демонстрирует, что, если приписать значение, соответствующее 100, образцу без какой-либо добавки, то сулодексид в концентрации примерно 25 мкг/мл уменьшает интенсивность окрашенной области ММР-9 соответственно до примерно 60%; SDX-DS в концентрации примерно 5 мкг/мл уменьшает интенсивность до примерно 70%, и парнапарин в концентрации примерно 20 мкг/мл не уменьшает интенсивность ММР-9. Эти результаты in vitro в отношении сулодексида и SDX-DS можно перенести на применение in vivo и можно использовать для снижения уровня ММР при всех патологиях, в которые вовлечены ММР.

Пример 9 демонстрирует эффект сулодексида, SDX-DS и парнапарина на ММР в венозных стенках с помощью зимографии in situ (цитохимия).

Сулодексид, SDX-DS и парнапарин в концентрации, соответственно, примерно 25 мкг/мл, 5 мкг/мл и 20 мкг/мл добавляли к сегментам подкожной вены ноги человека, хирургически полученной от 10 здоровых женщин (средний возраст 42 года), подвергнутых сафенэктомии в отношении варикозной вены.

После обработки срезы вен инкубировали с субстратом, представляющим собой флуорогенный желатин, и протеолитическую активность наблюдали, сравнивая микроскопическое изображение участков вен при 530 нм.

В этих экспериментах уровень флуоресценции пропорционален активностям ММР в ткани, и результаты зимографии in situ представлены в Таблице 13.

Таблица 13 демонстрирует, что, если приписать значение, соответствующее 100, образцу без какой-либо добавки, то сулодексид в концентрации примерно 25 мкг/мл уменьшает интенсивность ММР-9 до примерно 50%; SDX-DS в концентрации примерно 5 мкг/мл уменьшает интенсивность ММР-9 до примерно 80%, и парнапарин в концентрации примерно 20 мкг/мл уменьшает интенсивность ММР-9 до примерно 40%.

Эффект сулодексида, SDX-DS и SDX-HEP на ткань вены в отношении снижения и/или ингибирования можно распространить на все ткани, где вовлечены ММР.

Например, сулодексид, SDX-DS и SDX-HEP также может быть использован в лечении кишечной язвы и другого поражения, относящегося к ММР, без ограничения.

С целью получения эффективных концентраций in vivo для снижения уровня ММР и, в частности, ММР-9, сулодексид можно вводить внутривенным путем, инъецируя из 1-4 флаконов раствора, содержащего примерно 60 мг/мл сулодексида с фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Альтернативно, сулодексид можно вводить в терапевтически эквивалентной дозировке внутримышечным или пероральным путем. В этом последнем случае можно вводить до 1000 мг/сутки и более высокие дозировки без каких-либо нежелательных явлений, как описано в ЕР 1292315.

Свойство сулодексида снижать уровень циркулирующих ММР и особенно селективное действие против ММР-9 представляет собой неизвестный и неожиданный эффект, в частности, полезный при всех патологиях, в которые вовлечены ММР, и, в частности, ММР-9, таких как сосудистое заболевание, хроническая венозная недостаточность (CVI), варикозное расширение вен, венозные язвы, легочные патологии, увеличение и развитие опухоли, врастание первичной опухоли, ангиогенез, экстравазации и интравазации неопластических клеток.

Описанные и неограничивающие эксперименты демонстрируют новое применение сулодексида, SDX-DS и гепариновой фракции сулодексида, для снижения/ингибирования высвобождения ММР, в частности ММР-9, высвобождаемой лейкоцитами и тромбоцитами, и ингибирования величин ММР во внутренних стенках вен. Результаты ex-vivo можно полностью перенести на применение сулодексида, SDX-DS и гепариновой фракции сулодексида in vivo с помощью фармацевтической композиции, содержащей сулодексид в количестве от примерно 20 до 1000 мг и выше; SDX-DS в количестве от примерно 4 мг до примерно 200 мг и выше; SDX-HEP в количестве от примерно 16 до примерно 700 и выше.

Более того, введение сулодексида, SDX-DS и SDX-HEP, можно осуществлять инъекционным путем, внутримышечным и/или внутривенным или пероральным путем, без ограничения.

Дозировка активного ингредиента: сулодексида, SDX-DS и SDX-HEP, может значительно варьироваться в зависимости от способа введения, возраста пациента, массы и общего состояния пациента, а также от тяжести заболевания, и может быть определена стандартными методами. В дополнение к этому, для идентификации возможных диапазонов дозировок можно использовать анализ in vitro и анализ на животных. Предпочтительно, фармацевтическая композиция находится в форме, приемлемой для перорального введения. Сулодексид, SDX-DS и гепариновая фракция сулодексида, по настоящему изобретению может содержаться в композиции в форме таблеток, капсул, гранулятов, суспензий, растворов или аэрозоля.

Пероральная фармацевтическая композиция может обеспечивать контролируемое высвобождение.

Пероральная фармацевтическая композиция может обеспечивать биоадгезивные свойства для увеличения мукоадгезивности.

Эксципиенты для перорального препарата выбраны из одного или более чем одного связующего агента, скользящего агента, разрыхлителя, разбавителя, природного агента.

Эксципиенты для перорального применения могут содержать разрыхлители, разбавители и их комбинации. Разрыхлители могут быть выбраны из кросповидона, натрия крахмала гликолата, кукурузного крахмала, производных целлюлозы и их комбинации. Разбавители могут быть выбраны из лактозы, маннита, ксилита, микрокристаллической целлюлозы, сахара, декстрина, гидрофильного углевода и их комбинации. Пероральная фармацевтическая форма может содержать биоадгезивные эксципиенты.

Таблетки могут дополнительно содержат оболочку, которая содержит гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, по