Способ прогнозирования развития профессиональных гиперкератозов у работников производства стекловолокна

Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования развития профессиональных гиперкератозов. Сущность способа состоит в том, что выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят генотипирование полиморфизма rs1625895 гена ТР53 методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом. При выявлении генотипа G/A и аллеля А прогнозируют риск развития профессиональных гиперкератозов. Использование изобретения дает возможность прогнозировать развитие профессиональных гиперкератозов при воздействии на организм вредных производственных факторов. 2 табл., 2 пр.

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для прогнозирования развития профессиональных гиперкератозов при воздействии на организм вредных производственных факторов.

Развитие всех областей промышленности, фармации и сельского хозяйства сопровождается все большим числом работников, контактирующих с неблагоприятными производственными факторами, вызывающими развитие профессиональных заболеваний кожи. Причиной возникновения большинства профессиональных дерматозов (более 90%) являются химические соединения и лишь немногим более 9% случаев приходится на долю физических и инфекционных факторов. Одну из групп в профдерматозах химической природы составляют ограниченные гиперкератозы. К профессиям с высоким риском развития профессиональных гиперкератозов относятся операторы получения непрерывного стекловолокна.

В условиях производства операторы подвергаются действию комплекса химических веществ, эффект которых усиливается микроклиматом и пылью стекловолокна. В связи с высокой долей ручного труда, кожные покровы работников имеют постоянный контакт с замасливателями и их компонентами. Замасливатели представляют собой многокомпонентную смесь сложных химических соединений, которые обладают аллергенным, раздражающим, общетоксическим действием и относятся к 2-3 классу опасности. Некоторые из них являются канцерогенами (формальдегид и эпихлоргидрин).

Развитию гиперкератоза предшествует хронический, развивающийся в период от нескольких месяцев до нескольких лет, трудно поддающийся излечению дерматит, возникающий на местах непосредственного контакта с производственными раздражителями. На коже пальцев кистей и предплечий работников появлялись начальные патологические изменения в виде гиперпигментации, которые обычно развивались через 2-3 года от начала работы с замасливателями. При дальнейшем производственном контакте с ними формировались очаги ограниченного гиперкератоза с бородавчатыми разрастаниями, не вызывающими субъективных ощущений. Но изменения на коже рук прогрессировали и приобретали более выраженный характер. При гистологическом исследовании ограниченных гиперкератозов изменения эпидермиса соответствовали псевдоэпителиоматозной гиперплазии.

Ежегодно у работников производства стекловолокна регистрируются 5-7 случаев гиперкератоза. Средний возраст работников на момент установления профессионального ограниченного гиперкератоза составил - 56,6 лет. Профессиональные заболевания кожи были выявлены у операторов наиболее часто при стаже работы 15-20 лет. Средние сроки появления ограниченного гиперкератоза после начала работы составляют 12,6 лет. У одного оператора начальные изменения на коже рук появились через 1 год от начала контакта с продуктами производства, у четверых - через 3-4 года.

Важную роль в патогенезе гиперкератоза, помимо средовых факторов, играет генетическая предрасположенность. Гиперкератоз характеризуется повышенным утолщением эпидермиса, к которому приводит усиленное деление рогового слоя в сочетании с нарушениями слущивания эпидермиса. Для поддержания тканевого гомеостаза необходимо равновесие между процессами деления клеток и их гибели. То есть для нормального развития и функционирования организма важна не только пролиферация, но и регуляция клеточной смерти. Одним из наиболее известных генов, инициирующих программируемую клеточную смерть, является ТР53, кодирующий белок р53. Активируясь в ответ на самые разные неблагоприятные воздействия, р53 индуцирует механизм, приводящий клетку к апоптозу.

Активность белка р53 в значительной степени модифицирована генетическим полиморфизмом. Одним из наиболее функционально значимых полиморфизмов гена ТР53 является - точечная замена гуанина на аденин в 6-м интроне (IVS6+62G>A, rs 1625895). Установлено, что данный полиморфизм может изменять экспрессию белка р53, тем самым приводить к снижению апоптического индекса и эффективности репарации ДНК [Barel D., Avigad S., Cohen I.J. et al. A novel germline р53 insertion/duplication mutation in intron 6 in a Li-Fraumeni Famaly // Cancer Res. - 1994. - V.54, №23. - P.1298-1304].

Известен способ прогнозирования риска развития профессиональных аллергических дерматозов, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфного варианта A4889G цитохрома Р-450 1А1 [Лазарашвили Н.А. Роль системы «оксиданты-антиоксиданты» и генетического биохимического полиморфизма в патогенезе профессиональных аллергических дерматозов. Автореф. дис. канд. мед. наук. - Москва. - 2006].

В работе Хайрутдинова В.Р. (2005) изучалось распределение аллелей Arg/Pro полиморфизма гена р53 у больных псориазом [Хайрутдинов В.Р. Особенности распределения аллелей 72 кодона гена р53 у больных псориазом. Автореф. дис. канд. мед. наук. - Санкт-Петербург. - 2005]. Однако результаты исследования показали, что Arg/Pro полиморфизм гена р53 не оказывает влияния на формирование риска развития псориаза.

Известен способ прогнозирования трофических нарушений мягких тканей нижней конечности у больных сахарным диабетом, заключающийся в том, что проводят прицельное исследование участков критической функциональной нагрузки и компрессии опорных участков нижних конечностей путем термографического сканирования. Исследование проводят до и после ортостатической и/или маршевой нагрузки. Используют ортопедические приспособления и/или обувь. Определяют характер изменения термоактивности и время ее восстановления в данном участке до исходного уровня. По этим показателям оценивают состояние локальной микроциркуляции и прогнозируют характер трофических нарушений - в виде мацерации, гиперкератоза и изъязвлений или в виде некрозов [Патент RU №2128941, 1999 г.].

Известен способ прогнозирования развития профессиональных злокачественных новообразований кожи, включающий выделение ДНК, проведение анализа полиморфизма dup 16 bp d в 3 интроне и Arg72Pro полиморфизма 4 экзона гена ТР53. При выявлении сочетания генотипов *Arg/*Pro и *W/*dup16 прогнозируют риск развития злокачественных новообразований кожи [Патент RU №2454668, 2012 г.].

Но для развития кожного профессионального рака требуется длительное, измеряемое двумя-тремя десятками лет, раздражение кожи, и появлению рака предшествуют предраковые заболевания кожи (ксеродерма, кожный рог, гиперкератоз и др.). Термин «предраковые поражения кожи» впервые предложен W. Dubreulh еще в 1886 г. на III Международном конгрессе дерматологов в Лондоне. Он поставил вопрос о кератозах как предшественниках (предраках) злокачественных опухолей кожи.

Для ранней диагностики и прогнозирования течения профессионального гиперкератоза очень важно изучение генетических детерминант гиперкератоза как предракового заболевания. Это позволит разработать принципиально новые и эффективные подходы к профилактике развития данного профессионального заболевания.

В доступной научно-медицинской и патентной литературе сведений об известности способа прогнозирования риска раннего развития профессиональных гиперкератозов у работников производства стекловолокна не обнаружено.

Задачей настоящего изобретения является прогнозирование риска раннего развития профессиональных гиперкератозов у работающих во вредных и/или опасных условиях труда.

Техническим результатом изобретения является получение критериев прогноза развития профессиональных гиперкератозов у работников производства стекловолокна.

Указанный технический результат достигается тем, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфного локуса rs1625895 гена TP53 методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом, и при выявлении генотипа G/A и аллеля А прогнозируют риск развития профессиональных гиперкератозов у обследуемых.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Венозную кровь в объеме 5 мл забирают в пробирки, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта, и тщательно перемешивают. Для выделения ДНК используют метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью [Mathew С.С.The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA // Methods in Molecular Biology / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press. - 1984. - V.2. - P. 31-34].

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 50 мл, туда же добавляют 30 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трисНСl (pH 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4000 об./мин, при 4°C.

3. Надосадочную жидкость сливают, добавляют 15 мл лизирующего буфера, перемешивают с осадком, центрифугируют 10 мин при 4000 об./мин, при 4°C.

4. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 0,5 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8,0, суспензируют.

5. К суспензии добавляют 40 мкл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 37°С.

Далее проводят фенол-хлороформную экстракцию ДНК с последующим осаждением 96% этанолом и центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об./мин. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в деионизированной воде, раствор хранят при -20°С.

Оценку полиморфизма гена ТР53 проводят с помощью ПЦР-ПДРФ анализа. ПЦР проводят в амлификаторе «Терцик» фирмы ДНК-Технология. При этом используют специфические праймеры и условия реакции. Последовательности специфических праймеров представлены в таблице 1. ПЦР проводят в объеме 25 мкл следующего состава: по 6 пмоль каждого праймера, четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (каждый в концентрации 0,2 мМ), 1 мкл геномной ДИК, Taq-полимеразу («Sileks»), буфер для Taq-полимеразы и необходимое количество деионизированной воды до объема 25 мкл. Режим амплификации следующий: денатурация (94°С, 5 мин) - 1 цикл; денатурация (94°С, 30 с), отжиг (61°С, 40 с) и элонгация (72°С, 30 с) - 30 циклов; конечная элонгация (72°С, 5 мин) - 1 цикл.

Для рестрикционного анализа продукты ПЦР подвергают обработке рестриктазой MspI («Fermentas)» в течение 6 часов. На реакцию рестрикции берут 5 мкл ампликона, 0,5 рестриктазы (3-4 Ед.) и 1 мкл 10Х буфера для рестриктазы.

Результаты амплификации и рестрикции оценивают с помощью вертикального электрофореза в 6-8% полиакриламидном геле (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламида 29: 1) при напряжении 200-300 В (10 В/см). По окончании электрофореза гель окрашивают раствором бромистого этидия (0,1 мкг/мл) в течение 15 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Размер фрагментов определяют с помощью стандарта массы 500 п.о. - Ladder фирмы «Fermentas». О наличии в образце определенных аллельных вариантов судят по появлению в геле фрагментов с размерами, указанными в таблице 1.

Нами были исследованы образцы ДНК у 51 больных с гиперкератозом, которые по профессии были операторами получения непрерывного стекловолокна. Группу сравнения составили 53 оператора с большим стажем работы, не имеющие установленной профессиональной патологии.

Ассоциацию генотипов с развитием заболевания выявляли, сравнивая выборки больных и здоровых индивидов по частоте одного признака с использованием критерия χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. Если абсолютное число наблюдений хотя бы в одной ячейке таблицы было 5 и менее, то применялся точный критерий Фишера. Статистически значимыми считали различия при р<0.05.

Относительный риск заболевания по конкретному признаку вычисляли как соотношение шансов (OR - odds ratio). Для этого используют формулу, предложенную Бландом (Bland J.M., Altaian D.G. / The odds ratio // Br. Med. J. - 2000. - Vol.320. - P.1468]:

OR=(axd)/(bxc),

где a - частота генотипа в выборке больных, b - частота генотипа в контрольной выборке, с - сумма частот остальных генотипов в выборке больных, d - сумма частот остальных генотипов в контрольной выборке.

Значение OR=1 показывало отсутствие ассоциации, значение OR>1 рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с признаком («фактор риска»), OR<1 - как отрицательную ассоциацию («фактор устойчивости»).

В ходе исследования нами проведен анализ полиморфного варианта гена ТР53 в выборке больных с профессиональным гиперкератозом, а также в группе сравнения для выяснения их взаимосвязи с риском развития данной патологии. По исследуемому локусу отклонения от равновесия Харди-Вайнберга в изученных группах обнаружено не было.

Сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1625895 гена ТР53 выявил достоверно значимые различия между изученными группами. Так, гомозиготный генотип G/G и аллель G преобладали в группе здоровых работников (χ2=8,03, р=0,006; χ2=9,16, р=0,003 соответственно). Тогда как в группе больных профессиональными заболеваниями достоверно чаще встречался гетерозиготный генотип G/A (χ2=5,87, р=0,016; OR=4,64, 95% CI 1,28-18,32), а также аллель А (χ2=9,16, р=0,003; OR=5,47, 95% CI 1,65-19,92) (таблица 2).

Таким образом, наличие в генотипе варианта G/A и аллеля А полиморфного локуса rs1625895 гена ТР53 является фактором предрасположенности. Высокий показатель отношения шансов позволяет рассматривать эти специфичности в качестве генетических маркеров, ассоциированных с повышенным риском развития профессионального гиперкератоза.

Пример 1.

Больной Р., 1960 г.р., работает оператором получения непрерывного стекловолокна на ОАО «Стеклонит» в течение 25 лет. Находился на стационарном лечении в клинике ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека» с диагнозом гипертензивная болезнь сердца. Проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем гомозиготного генотипа G/G и аллеля G полиморфного локуса rs1625895 гена ТР53. В отношении развития профессионального гиперкератоза прогноз благоприятный. При осмотре кожных покровов патологии не выявлено.

Пример 2.

Больной Г., 1954 г.р., находился на диспансерном наблюдении в ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека» с 2004 г. с диагнозом хронический дерматит рук. Работал оператором получения непрерывного стекловолокна на ОАО «Стеклонит» в течение 11 лет.

Проведено исследование по предлагаемой методике. Установлено: является носителем генотипа G/A и аллеля А полиморфного локуса rs1625895 гена ТР53. В отношении развития профессионального гиперкератоза прогноз неблагоприятный.

При осмотре при очередном освидетельствовании обнаружены очаги ограниченного гиперкератоза. Работник был переведен в другой цех.

Таблица 1
Тип полиморфизма, последовательности праймеров, ферменты рестрикции и номенклатура аллелей полиморфного ДНК-локуса гена ТР53
Полиморфный локус гена Праймеры (5′→3′) t° C отжига Длина продукта, пн Рестриктаза Аллели, пн Литературный источник
1 2 3 4 5 6 7
1 rs1625895 ТР53 intron 6 TGGCCATCTACAGGCACTCA TTGCACATCTCATGGGGTTA 61 404 MspI G 336 + 68 А 404 Wu X. et al., 2002
Таблица 2
Частоты аллелей и генотипов полиморфного локуса rs1625895 гена ТР53 у работников производства стекловолокна
Группа N Генотипы (%) Аллели (%)
G/G G/A А/А G А
Больные 51 35 (68,6) 14 (27,5) 2 (3,9) 84 (82,4) 18 (17,7)
Группа сравнения 53 49 (92,5) 4 (7,6) 0 102 (96,2) 4 (3,8)

Способ прогнозирования развития профессиональных гиперкератозов, характеризующийся тем, что проводят выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят генотипирование полиморфного локуса rs1625895 гена TP53 методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом, при выявлении генотипа G/A и аллеля А прогнозируют риск развития профессиональных гиперкератозов у обследуемых.